CN105987965A - 测定人全血中多种滥用药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属药物检测与司法鉴定技术领域，具体涉及采用超声辅助的分散液液微萃取法对人全血中7种滥用药物苯丙胺、甲基苯丙胺、亚甲基二氧苯丙胺、亚甲基二氧甲基苯丙胺、氯胺酮、哌替啶和美沙酮进行提取并测定的方法，采用甲醇作为分散剂及蛋白沉淀溶剂，以二氯甲烷为萃取溶剂，并于pH13的水溶液形成三溶剂体系的微乳系统，在超声的辅助下进一步乳化，进行液-液微萃取，提取过程无需挥干提取溶剂；该方法具有高富集倍数和回收率、操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、线性范围宽以及费用低、环境友好等优点，能够满足司法鉴定任务紧迫、对检测时间要求高的特点。本发明的检测体系为毒品检测提供了新的技术平台。

Description

测定人全血中多种滥用药物的方法

技术领域

本发明属药物检测与司法鉴定技术领域，涉及测定人全血中药物的方法，具体涉及基于超声辅助的分散液-液微萃取(ultrasound-assisted dispersiveliquid-liquid microextraction,UA-DLLME)对人全血中7种滥用药物进行提取并测定的方法，该方法具有高富集倍数和回收率、操作简便、快速、费用低、环境友好等优点。

背景技术

据报道，苯丙胺(amphetamine,AMP)、甲基苯丙胺(methamphetamine,MAMP)、亚甲基二氧苯丙胺(methylenedioxyamphetamine,MDA)、亚甲基二氧甲基苯丙胺(methylenedioxymethamphetamine,MDMA)、氯胺酮(ketamine)、哌替啶(pethidine)和美沙酮(methadone)是被广泛滥用的毒品或药物；其中AMP、MAMP、MDA和MDMA均为苯丙胺类兴奋剂，可兴奋中枢神经，AMP和MAMP以中枢神经系统兴奋作用为主，毒品“摇头丸”的主要成分则是MDA和MDMA，兼具兴奋和致幻作用；氯胺酮是被称作“K粉”的主要成分，有致幻作用，长期使用或过量使用会对脑部造成永久损害；哌替啶又名度冷丁，是临床常用的镇痛剂，长期使用会产生依赖性，滥用情况比较严重；美沙酮因其药理作用与吗啡相似，具有治疗海洛因依赖脱毒和替代维持治疗的药效作用，因此，美沙酮替代递减法是阿片类药物依赖的常规戒毒方法之一，在涉毒事件鉴定中检出率较高，美沙酮的滥用报道近年来也越来越多。

通常，人全血是毒品鉴定中重要的生物检材，也是毒品定量分析最为常用的检材，所得的定量数据可用于与文献报道的中毒浓度或致死浓度相比较。

已见报道的人全血中上述7种滥用药物的检测方法主要有酶联免疫法、气相色谱－质谱联用法、液相色谱－质谱联用法。实践显示，酶联免疫法对样品的前处理虽无特别的要求，但是其专属性较差，难以区分结构类似物，有时甚至会出现假阳性的情况，因而该方法常常只能作为一种初筛的手段；采用气相色谱－质谱联用法(GC-MS)或液相色谱－质谱联用法(LC-MS)则具有较高的专属性及灵敏度，能进一步对化合物进行确证，然而在采用GC-MS或LC-MS对生物样品进行分析之前常需要对样品进行提取和纯化，而目前常用的提取方法主要是采用较大体积量的有机溶剂，如乙醚、正己烷等进行，因此采用该种提取方法，则常常涉及需将提取液挥干，从而达到富集的效果，但已有研究表明，其中的AMP和MAMP会随着提取液的挥干而快速挥发，分析的重现性及标准曲线的线性均会受到影响，从而造成生物检材中所述的2种物质难以准确定量；虽然有报道提出可以通过加酸或在低温条件下对样品进行挥干或进行衍生化操作来避免AMP和MAMP的挥发，但这些样品前处理方法相对繁琐且耗时，而且使用的样品量大，有机溶剂使用量大，对环境不友好，难以满足司法鉴定对于毒品分析快速准确的要求，也对样品的采样量有较大的要求。

鉴于现有技术存在的缺陷，本申请的发明人拟提供一种具有高富集倍数和回收率、且操作简便、快速、费用低、环境友好的测定人全血中多种滥用药物的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供测定人全血中药物的方法，具体涉及基于超声辅助的分散液-液微萃取(ultrasound-assisted dispersiveliquid-liquid microextraction,UA-DLLME)对人全血中7种滥用药物进行提取并测定的方法，该方法具有高富集倍数和回收率、操作简便、快速、费用低、环境友好等优点。

本发明的方法能同时提取、纯化和富集人全血中7种滥用药物以及对样品进行前处理；所述的滥用药物包括：苯丙胺(amphetamine,AMP)、甲基苯丙胺(methamphetamine,MAMP)、亚甲基二氧苯丙胺(methylenedioxyamphetamine,MDA)、亚甲基二氧甲基苯丙胺(methylenedioxymethamphetamine,MDMA)，以及氯胺酮(ketamine)，哌替啶(pethidine)和美沙酮(methadone)。

具体而言，本发明方法基于超声辅助的分散液-液微萃取方法对人全血中上述7种滥用药物进行提取、纯化和富集，其特征在于，采用甲醇作为分散剂及蛋白沉淀溶剂，以二氯甲烷为萃取溶剂，并于pH13的水溶液形成三溶剂体系的微乳系统，在超声的辅助下进一步乳化，进行液-液微萃取；其包括步骤：

(1)样品前处理：

取人全血检材至具塞尖底玻璃离心管中，加入内标，加入甲醇，涡旋混匀，4000rpm离心后，转移上清至另玻璃离心管中，加入二氯甲烷，将该混合溶液加入含有4％氯化钠溶液(pH＝13)的具塞尖底玻璃离心管中，形成浑浊溶液；将该浑浊溶液在超声水浴中振摇提取，然后4000rpm离心，弃去上层溶液，转移下层有机相；

(2)采用气相色谱－质谱联用法对前处理后的样品进行定量定性分析。

本发明的样品前处理中，采用甲醇作为分散剂，本发明的一个实施例中采用1.3mL甲醇作为分散剂；

本发明的样品前处理中，采用二氯甲烷作为萃取溶剂，本发明的一个实施例中采用200μL二氯甲烷作为萃取溶剂；

本发明的一个实施例中，样品前处理中，以4.5mL的含4％氯化钠和pH为13的水溶液作为水相，并且以2min的超声水浴中振摇进行辅助微萃取，该过程不涉及提取液的挥干过程，而是将提取液直接进样检测。

本发明方法中，气相色谱－质谱仪操作条件为：

色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管气相色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm

柱温：起始100℃维持1.5min，然后25℃/min升至280℃并保持6min

溶剂延迟时间：3min

进样口/传输线温度：250℃/280℃

载气：高纯He，恒流1mL/min

EI源电子能量：70eV

扫描方式：选择离子监测(SIM)

检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰：如表1所示。

表1 检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰

本发明方法中，采用甲醇对全血样品的蛋白沉淀，二氯甲烷与甲醇的混合后能快速加大pH 13，盐浓度为4％的水溶液形成乳化体系，辅助以超声能进一步加强乳化合液-液微萃取效果。

本发明方法中，采用气相色谱－质谱联用对人全血中上述7种滥用药物进行定性和定量分析，其中采用DB-5MS毛细气相色谱柱以及质谱检测器测定人全血中7种滥用药物含量，检测的灵敏度高、准确度好。

本发明方法对人全血中AMP、MAMP、MDA、MDMA、氯胺酮、哌替啶和美沙酮等7种滥用药物进行了定性和定量分析，结果准确、可靠，各化合物检测限均为10ng/mL，定量限为40ng/mL，线性范围0.04～25μg/mL，线性相关系数r值均大于0.99。准确度在85.0～113.3％范围内，批内精密度的RSD值不超过8.2％，批间精密度的RSD值不超过12.8％。本方法具有高富集倍数和回收率、操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、线性范围宽以及费用低、环境友好等优点，能够满足司法鉴定任务紧迫、对检测时间要求高的特点。本发明的检测体系为毒品检测提供了新的技术平台。

本发明方法与现有技术的检测方法尤其是其中的样品前处理方法相比，具有以下明显优势：

(1)本发明使用的样品量少，仅需0.2mL，而现有技术方法常为1-2mL，能够较好地应对解决法医案件中检材量通常非常有限的情况。

(2)本发明方法的样品前处理的步骤避免了吹干的过程，保证了标准曲线的线性，并且简便、快速，能极大地提高毒品鉴定的效率。

(3)本发明方法使用少量的有机溶剂，既有利于保护操作人员，又对环境友好，还也可节约分析成本。

(4)本发明方法的专属性强、灵敏度高，各化合物的检测限可达到10ng/mL，足以满足实际检案的需要。

附图说明

图1是药物苯丙胺类、氯胺酮、哌替啶、美沙酮的标准色谱图，

其中，AMP(3.6min),MAMP(4.0min),MDA(5.8min),MDMA(6.1min)，哌替啶(7.2min)，氯胺酮(7.7min)及美沙酮(8.8min)及内标物MAMP-d5(4.0min)。

具体实施方式

实施例1测定人全血中多种滥用药物

(1)样品制备：

取全血检材0.2mL至一5mL具塞尖底玻璃离心管中，加入内标(MAMP-d5，10μg/mL)20μL，加入1.3mL甲醇，涡旋混匀，4000rpm离心5min，转移上清至另一5mL玻璃离心管中，并加入200μL二氯甲烷，然后将这一混合溶液快速加入到含有4％氯化钠溶液(pH＝13)的具塞尖底玻璃离心管中，此时立刻形成乳白色浑浊；接着将该溶液在超声水浴中振摇提取2min，然后4000rpm离心5min，弃去上层溶液，移取下层有机相至150μL玻璃内衬管中供GC-MS分析；

本实验中：

色谱条件：

色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管气相色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm

柱温：起始100℃维持1.5min，然后25℃/min升至280℃并保持6min

溶剂延迟时间：3min

进样口/传输线温度：250℃/280℃

载气：高纯He，恒流1mL/min

EI源电子能量：70eV

扫描方式：选择离子监测(SIM)

检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰：如表1所示：

表1 检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰

(2)线性试验：

取混合标准系列工作液，加入空白全血，涡旋混匀，配成含待测物浓度分别为0.04、0.1、0.5、2、5、10、25μg/mL的标准含药血样,按“样品处理”项下操作，制备标准曲线，并同时制备空白样品，记录色谱图，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，进行线性回归运算，绘制标准曲线；

(3)精密度和准确度试验：

取混合标准低、中、高质控工作液，加入空白全血，涡旋混匀，配成含待测物浓度分别为0.05,1,20μg/mL的含药血样；每批每个浓度配制5份，共做3批，按“样品处理”项下操作；根据每批线性回归方程计算其实测浓度，计算每个浓度的准确度、批内和批间精密度，精密度以相对标准偏差(RSD)表示，结果显示，结果准确、可靠，各化合物检测限均为10ng/mL，定量限为40ng/mL，线性范围0.04～25μg/mL，线性相关系数r值均大于0.99。准确度在85.0～113.3％范围内，批内精密度的RSD值不超过8.2％，批间精密度的RSD值不超过12.8％(如表2所示)。

表2 人全血中待测物的批内和批间精密度、准确度数据

Claims (7)

1.测定人全血中多种滥用药物的方法，其特征在于，采用超声辅助的分散液-液微萃取方法对人全血中多种滥用药物进行提取、纯化和富集，采用甲醇作为分散剂及蛋白沉淀溶剂，以二氯甲烷为萃取溶剂，并于pH13的水溶液形成三溶剂体系的微乳系统，在超声的辅助下进一步乳化，进行液-液微萃取；其包括步骤：

(1)样品前处理：

取人全血检材至具塞尖底玻璃离心管中，加入内标，加入甲醇，涡旋混匀，4000rpm离心后，转移上清至另玻璃离心管中，加入二氯甲烷，将该混合溶液加入pH＝13含有4％氯化钠溶液的具塞尖底玻璃离心管中，形成浑浊溶液；将该浑浊溶液在超声水浴中振摇提取，然后4000rpm离心，弃去上层溶液，转移下层有机相；

(1)采用气相色谱－质谱联用法对前处理后的样品进行定量定性分析。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人全血中多种滥用药物包括：苯丙胺(amphetamine,AMP)、甲基苯丙胺(methamphetamine,MAMP)、亚甲基二氧苯丙胺(methylenedioxyamphetamine,MDA)、亚甲基二氧甲基苯丙胺(methylenedioxymethamphetamine,MDMA)，以及氯胺酮(ketamine)，哌替啶(pethidine)和美沙酮(methadone)。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用1.3mL甲醇作为分散剂。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用200μL二氯甲烷作为萃取溶剂。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，以4.5mL的含4％氯化钠和pH为13的水溶液作为水相，以2min的超声水浴中振摇进行辅助微萃取。

6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，按权利要求4所述的方法，其特征在于，辅助微萃取过程不涉及提取液的挥干过程，是将提取液直接进样检测。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，气相色谱－质谱仪操作条件为：

色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管气相色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm

柱温：起始100℃维持1.5min，然后25℃/min升至280℃并保持6min

溶剂延迟时间：3min

进样口/传输线温度：250℃/280℃

载气：高纯He，恒流1mL/min

EI源电子能量：70eV

扫描方式：选择离子监测(SIM)

检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰：如下表所示，