CN105974027A

CN105974027A - 测定果醋中乙酸δ13C值的方法

Info

Publication number: CN105974027A
Application number: CN201610479932.8A
Authority: CN
Inventors: 钟其顶; 王道兵
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2016-09-28

Abstract

本发明公开了一种应用液相色谱‑稳定同位素比值质谱测定果醋中乙酸δ¹³C值的方法，属于稳定同位素分析技术领域。该方法包括如下步骤：1)为液相色谱组件配制酸性流动相；2)调整液相色谱‑稳定同位素比值质谱至工作状态；3)先后在相同的条件下测定δ¹³C值已知的物质和样品中乙酸；4)根据仪器的系统偏差得出样品乙酸的δ¹³C值。本方法具有操作简单、计算方便、测定稳定准确的特点(测定标准偏差仅为0.10‰)，将促进稳定同位素技术在果醋产品掺伪检测中的应用，为我国食品安全提供一份助力。

Description

测定果醋中乙酸δ13C值的方法

技术领域：

本发明涉及测定果醋中乙酸稳定碳同位素比值(记作δ¹³C)的方法，属于稳定同位素分析技术领域。

背景技术：

稳定同位素技术在食品成分的掺假检验中具有重要作用和应用价值，其在国外果醋的真伪鉴别中已得到应用，也取得了一些成绩。果醋的掺假鉴别，关键就是果醋中主要有机组分(乙酸)的来源问题，因此，乙酸的同位素组成的准确测定就成了稳定同位素技术能否得到成功应用的关键。果醋产品是一种除乙酸之外还有乙醇、芳香物质构成的混合物，若不能将乙酸与其他有机物有效分离，乙酸碳同位素比值测定时难免会受到干扰，因此，如何有效分离乙酸与其他有机物是果醋中乙酸碳同位素准确测定的关键所在。

根据文献(H NMR and 13 C-IRMS analyses of acetic acid fromvinegar,18 O-IRMS analysis of water in vinegar:Internationalcollaborative study report)、(Measurement of the isotope ratio ofacetic acid in vinegar by HS-SPME-GC-TC/C-IRMS)、(Gaschromatography/isotope ratio mass spectrometry:Analysis ofmethanol,ethanol and acetic acid by direct injection of aqueousalcoholic and acetic acid samples)、(有机溶剂稀释与气相色谱-燃烧-同位素质谱(GC-C-IRMS)联用测定食醋中乙酸的δ¹³C)可知，当前醋中乙酸碳同位素组成的测定技术主要有固相微萃取技术结合气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱法、微蒸馏提取技术结合元素分析-稳定同位素比值质谱法以及有机溶剂稀释结合色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱法，前两种方法在国外的文献中有所报道，但是其整套方法所需时间长、消耗样品量大，且需要专门的技术人员进行前处理操作，另外，由于涉及到纯乙酸的提取过程，难免出现同位素分馏，因此这两种方法的稳定性和准确性均存在一定问题；第三种方法已获得国家发明专利保护(ZL201210473395.8)，而且该方法尽管使用有机溶剂稀释样品，进样时仍然含有一些水分(尤其是醋产品中乙酸含量较低时)，时间长了会损伤气相色谱柱。液相色谱-稳定同位素比值质谱技术的应用价值在大分子有机物质的碳同位素分析中已逐渐显现，如测定蜂蜜和果汁的糖类物质的碳同位素组成：(An overview of analytical methods for determiningthe geographical origin of food products)、(Improved detection ofhoney adulteration by measuring differences between 13C/12C stablecarbon isotope ratios of protein and sugar compounds with acombination of elemental analyzer-isotope ratio massspectrometry and liquid chromatography-isotope ratio massspectrometry)、(Liquid chromatography coupled to isotope ratiomass spectrometry:a new perspective on honey adulterationdetection)、(液相色谱-元素分析-同位素比率质谱联用法鉴定橙汁掺假)、(液相色谱元素分析-同位素比值质谱联用法鉴定蜂蜜掺假)；葡萄酒中的乙醇和甘油的δ¹³C值：(Resolution OIV/OENO 343/2010：Methodfor the determination of the 13C/12C isotope ratio of glycerol inwines by Gas Chromatography Combustion or High performance LiquidChromatography coupled to Isotopic Ratio Mass Spectrometry)的、(Simultaneous stable carboni sotopic analysis of wine glyceroland ethanol by liquid chromatography coupled to isotope ratio massspectrometry)、(液相色谱-同位素比质谱法同时测定葡萄酒中甘油和乙醇的δ¹³C值)，并且由于流动相是液体状态，尤其适用于含水量较多的样品的分析。李鑫等(稳定同位素比率技术对食醋真伪鉴别的应用初探)在液相色谱-稳定同位素比值质谱上安装反相C18色谱柱实现了乙酸δ¹³C分析，但是由于反相C18色谱柱对食醋中复杂组分(除乙酸外的其他有机物)缺乏有效分离效果，不能将其与乙酸分开，因此使用消解的方式在80℃条件下除去醋样中的乙醇等物质，但是需要注意的是，该过程为非密闭条件操作，乙酸是极易挥发的物质，此过程中会因部分乙酸逸散而出现碳同位素分馏，造成测定结果不准确，而且消解步骤处理样品需要耗费时间，增加了样品分析难度。

本研究针对果醋中乙酸碳同位素快速分析的迫切需求和稳定性、准确性要求，借鉴液相色谱-稳定同位素比值质谱技术和阳离子交换色谱技术的先进性，通过液相色谱柱分离果醋中不同有机组分然后测定乙酸碳同位素组成，为果醋产品的真实性研究和掺伪检测技术的建立提供技术支持。

发明内容：

(1)拟解决的问题

针对果醋产品中乙酸碳同位素的测定问题，建立一种快速、稳定、准确且不损伤仪器的测定乙酸δ¹³C的方法，为果醋产品中乙酸碳同位素(δ¹³C)的分析及其应用提供技术方法。

简言之，本发明基于果醋产品的含水特性，采用不加入其他有机化学成分而直接利用液相色谱--稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS)实现对果醋中乙酸δ¹³C的快速测定，解决以往果醋中乙酸δ¹³C测定需纯化或引入其他有机组分、因水而影响色谱柱寿命的问题。本发明为乙酸δ¹³C的测定提供了另外一种可行性方案，将促进果醋中乙酸δ¹³C研究和应用的进步，也为以后乙酸中δ¹³C的测定和果醋产品的真伪鉴别提供技术方法。

(2)本发明的具体方案

本发明结合色谱分离理论和稳定同位素技术实现了果醋中乙酸稳定碳同位素组成(δ¹³C)的更稳定、准确测定，且在测定前无需去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分，如去除果醋样品中的乙醇等物质。优选地，其中所述的果醋为苹果醋。

具体而言，本发明提供采用液相色谱-稳定同位素比值质谱仪测定果醋中乙酸δ¹³C值的方法，其中包括样品稀释、过滤的前处理步骤、液相色谱分离、在线反应装置氧化处理然后测定稳定同位素比值的步骤，且本发明中所述的样品前处理步骤不包括去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分的步骤，如除去果醋样品中的乙醇等其他有机物质。

更具体而言，本发明测定果醋中乙酸δ¹³C值的方法，包括以下步骤：

1)仪器准备；

2)样品前处理；

3)测定碳同位素参考物质或工作标准；

4)测定样品的δ¹³C_测定值；

5)计算样品的δ¹³C值。

上述步骤中，所述的仪器准备为调整各项参数至工作状态：保护气为氦气；色谱柱为可耐纯水的液相色谱柱；柱流速为0.25～0.60mL/min；柱温为20～70℃；配制酸性流动相(pH为0～6)；调整反应助剂的浓度和流速至m/z＝32的背景信号强度为4000～18000mv；进样体积为20μL。

所述的样品前处理包括稀释和过滤程序，将样品稀释至乙酸浓度0.1～1.2g/L，稀释后经滤膜过滤(水系，0.45μm或0.22μm)，任选地，确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验仪器测定CO₂中δ¹³C的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值。本发明中所述的样品前处理步骤不包括去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分的步骤，如除去果醋样品中的乙醇等有机物质。

(3)有益效果：

本发明根据果醋产品的理化特性及液相色谱-稳定同位素比值质谱技术特点实现了果醋样品中乙酸δ¹³C值的高精度分析与测定，且在测定前无需去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分，为果醋产品的掺假检测研究、生产过程控制技术研究提供了一种新方法。

具体实施方式：

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例一：

1.1仪器

液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)，上述仪器均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

1.2材料与试剂

碳同位素参考物质：蔗糖(IAEA-CH-6，δ¹³C_PDB＝-10.45‰)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)；乙酸(纯度≥99％)。

1.3色谱条件

HyperRez XP Carbohydrate H+色谱柱(7.7×300mm/8μm)；流动相为0.0005mol/L的硫酸溶液，流速为0.30mL/min；色谱柱温度为35℃。

1.4氧化接口工作条件

氧化接口(IsoLink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用IRMS同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，调整磷酸和过二硫酸钠溶液的浓度和流速确保m/z＝32的离子流信号强度为8000mV。

1.5参考物质准备

用超纯水和碳同位素参考物质(蔗糖)配制0.3g/L的蔗糖水溶液，保存待用。

1.6样品前处理

用超纯水配制0.3g/L的乙酸水溶液，经0.22μm滤膜过滤后保存待用。

1.7测定

分别进样测定蔗糖水溶液和乙酸水溶液的δ¹³C_测定值，并根据蔗糖δ¹³C的测定值与真实值(-10.45‰)的差异计算得出乙酸的δ¹³C值。

1.8结果分析

连续10次测定纯乙酸的δ¹³C值，结果如表1所示。

表1乙酸δ¹³C值重复测定结果

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											δ¹³C(‰)	-26.38	-26.28	-26.36	-26.38	-26.23	-26.26	-26.20	-26.17	-26.25	-26.18

由上表可知，本发明中LC-IRMS测定乙酸δ¹³C值的方法稳定性优异，其标准偏差仅为0.08‰，优于已知文献中乙酸δ¹³C值测定的精密度。

实施例二

2.1仪器

2.2材料与试剂

碳同位素参考物质：蔗糖(IAEA-CH-6，δ¹³C_PDB＝-10.45‰)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)；乙酸(纯度≥99％)；市售苹果醋。

2.3色谱条件

2.4氧化接口工作条件

2.5参考物质和工作标准准备

选择乙酸(纯度≥99％)为工作标准物质，用超纯水配制0.3g/L的乙酸水溶液，经0.22μm滤膜过滤后保存待用。

2.6样品前处理

用超纯水将苹果醋稀释至乙酸约0.3g/L，经0.22μm滤膜过滤后保存待用。

2.7测定

分别进样测定蔗糖水溶液δ¹³C_{蔗糖测定值}和乙酸工作标准的δ¹³C_{乙酸测定值}，测定苹果醋的δ¹³C_{乙酸测定值}，并根据蔗糖δ¹³C的测定值与真实值(-10.45‰)、乙酸工作标准的测定值和校正值(-26.27‰)的差异计算得出样品中的乙酸δ¹³C值。

2.8结果分析

苹果醋样品平行处理3份，每份样品测定3次，结果见表2。

表2醋样品分析

样品	乙酸δ¹³C(‰)	标准偏差(‰)
			苹果醋	-27.11	0.10

由上表可知，样品3次测定的标准偏差最大仅为0.10‰，这说明尽管样品中成分比较复杂，但是该发明的方法能够排除其它含碳有机物对乙酸δ¹³C测定的干扰，这表明该发明的方法测定苹果醋中乙酸δ¹³C值的重复性满足碳同位素的分析要求。

实施例三

3材料方法

3.1仪器

气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱仪(GC-C-IRMS)；

液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)。

3.2材料与试剂

碳同位素参考物质：蔗糖(IAEA-CH-6，δ¹³C_PDB＝-10.45‰)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)；乙醇(HPLC级)；市售苹果醋(共5个)。

3.3LC-IRMS的工作条件

HyperRez XP Carbohydrate H+色谱柱(7.7×300mm/8μm)；流动相为0.0005mol/L的硫酸溶液，流速为0.30mL/min；色谱柱温度为35℃；氧化接口(IsoLink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用IRMS同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，调整磷酸和过儿硫酸钠溶液的浓度和流速确保m/z＝32的离子流信号强度为8000mV。

3.4GC-C-IRMS的工作条件

GC配备VF-Wax毛细色谱柱，进样口温度为300℃，分流进样模式(分流比1:20，恒流1.2mL/min)；程序升温：初始温度80℃，保持1min，以15℃/min升温至200℃，保持2min；载气为He(纯度99.999％)；配备在线燃烧装置(陶瓷反应管，内充CuO、NiO以及Pt丝，工作温度为1000℃)。

3.5样品准备

LC-IRMS：苹果醋样品均用超纯水稀释至乙酸约0.3g/L，经0.22μm滤膜过滤后保存待用；

GC-C-IRMS：苹果醋样品经0.22μm滤膜过滤后，用乙醇稀释至乙酸浓度约8g/L，保存待用。

3.6测定

分别用LC-IRMS和GC-C-IRMS测定市售苹果醋样品中的乙酸δ¹³C值，结果见表3。

表3 LC-IRMS和GC-C-IRMS测定苹果醋样品中乙酸δ¹³C值的比较

由上表可知，采用本发明测定的苹果醋中乙酸δ¹³C值与GC-C-IRMS方法相比，测定结果的差值均小于0.25‰，线性相关程度达0.995，说明本方法测定苹果醋样品乙酸的δ¹³C值准确有效。另外，从样品前处理过程可以看出，本发明方法比GC-C-IRMS消耗的样品量更少。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims

1.一种测定果醋中乙酸δ¹³C值的方法，其使用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定，且在测定前无需去除果醋样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分。

2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

1)为液相色谱配制酸性流动相；

2)调整液相色谱-稳定同位素比值质谱的参数使之达到工作状态；

3)用δ¹³C值已知的物质校正仪器的系统偏差Δ¹³C；

4)取一定量的果醋样品，并测定样品中乙酸δ¹³C_测定值；

5)根据Δ¹³C和δ¹³C_测定值得出样品的乙酸δ¹³C值。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酸性流动相为用硫酸和超纯水配制的pH为0～6的溶液，优选pH为3，例如为0.0005mol/L的硫酸溶液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于调整液相色谱-稳定同位素比值质谱的参数：设定流动相流速为0.25～0.6mL/min，优选为0.3mL/min；设定色谱柱温度为20～75℃，优选为35℃；同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，确保m/z＝32的离子流信号强度为5000mV～18000mV，优选为8000mV。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于δ¹³C值已知的物质为国际或国家认证认可的参考物质，如IAEA-CH-6，或以国际或国家认证认可的参考物质标定的工作标准物质，优选为以国际或国家认证认可的参考物质标定的成分为乙酸的工作标准物质。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用与样品测定时相同的仪器参数测定参考物质或工作标准物质，得出测定值δ¹³C₁，与其已知的δ¹³C值δ¹³C₀相比较得出仪器的系统偏差Δ¹³C：Δ¹³C＝δ¹³C₀-δ¹³C₁。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，果醋样品在被水(优选为超纯水)稀释后进行测定，稀释后的乙酸含量为0.1～1.2g/L，优选为0.3g/L。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在稀释果醋样品后进行过滤(例如滤膜过滤，优选为0.45μm或0.22μm的滤膜过滤)。

9.根据权利要求1-6和8中任一项所述的方法，其特征在于，所用的色谱柱为可耐纯水流动相的色谱柱，优选为HyperREZ XPCarbonhydrate H+型号的色谱柱。

10.根据权利要求1-6和8中任一项所述的方法，其特征在于，所述果醋为苹果醋。