CN105963690A - 用于溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法 - Google Patents

用于溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法，该组合物包括纳豆激酶、当归和黄芪组成；每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为200～400IU。其制备方法包括：1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液，离心，取上清液浓缩，得到纳豆激酶浓缩液；2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成黄芪浸膏；3)将当归加水提取，将提取液浓缩成当归浸膏；4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液混合，即得。本发明以纳豆激酶、当归和黄芪为原料，这三种组分发挥协同增效的作用，具有较好的预防血栓形成以及溶栓效果。

Description

用于溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物组合物，具体涉及用于溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法。
背景技术
血栓性疾病作为中老年人的高发病，是死亡威胁最大的疾病之一，目前60岁以上的老人已达到1亿以上，占人口比例的8.7％，今后20年我国将进入老龄化社会，血栓性疾病的防治必须引起足够的重视。全世界现有血栓塞病人约1500万，所需的溶栓药的潜在市场价值约20亿美元。国内市场上普遍使用的溶栓类药物链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等都存在明显的不足：抗再灌注、产生再栓塞和出血性副作用，且价格昂贵。
纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有溶解血栓、降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。纳豆激酶是1987年由日本生理学教授须见洋行博士从200多种食品中首先发现并命名的一种分子量远远小于UK、SK、tPA的蛋白质，等电点是8.7，分子量为27724，具有很强的纤维蛋白溶解能力，并具有活化弹性酶和尿酸酶的活性，在此之后的相关研究表明，纳豆激酶能够有效清除人体血液内的血栓，是目前溶栓活力最高的蛋白酶，而且对高血压、衰老、中风、肌肉痉挛和心脑血管疾病也有很好的疗效，已被用作溶栓药物。并且，纳豆激酶来源于日本传统的食物纳豆，安全性好，同时可由肠道吸收，在体内作用持续时间长，最重要的一点是它还能激活人体内重组型纤溶酶激活剂，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性，因此，近年来，以纳豆激酶为主要成分的药品、功能性食品、食品添加剂的研发工作进展十分迅速。对于纳豆激酶产品的应用，营养专家建议每日服用的预防量为1500～2000IU，然而这一用量也将带来较高的成本，使得血栓患者的经济负担较重。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法。
本发明提供的技术方案是用于溶栓的纳豆激酶组合物，该组合物包括纳豆激酶、当归、黄芪组成；每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为200～400IU。
上述纳豆激酶可以是由产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵液，也可以是纳豆激酶冻干粉。
黄芪甲苷为黄芪的活性成分，在该组合物中黄芪甲苷的含量为0.02～0.03mg/g。
阿魏酸为当归的活性成分，在该组合物中阿魏酸的含量为0.02～0.03mg/g。
本发明还提供了上述用于溶栓的纳豆激酶组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液，离心，取上清液浓缩，得到纳豆激酶浓缩液；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成黄芪浸膏；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成当归浸膏；
4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液混合，即得。
本发明的纳豆激酶来自能够产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵产物，枯草杆菌作为一种益生菌，市场上可以直接购买，例如Bacillus Subtilis AK(PN2003-210136，FERM P-182391JP),Bacillus Subtilis MR141(PN 08-154616，FERM P-14692JP)，Bacillus Subtilis IAM1026(PN 5486467，FERM BP-6713US)等，这些菌种在发酵过程中除能产生纳豆激酶外，各级代谢产物均含有对人体有益的成分，因此都可以作为本发明的菌种。本发明优选纳豆杆菌，其能够通过固体或液体基质发酵产生高效纤溶活性的纳豆激酶。
根据选定的菌种，选择其适当的培养条件进行发酵培养，其中，可以选用固体发酵法，把菌种制成菌悬液，接种到固体培养基中，在适宜的条件下进行培养，发酵结束后将发酵产生的的纳豆激酶溶解提取出来得到发酵液，将发酵液离心，上清液浓缩，得到浓缩液。由于固体发酵法为常规方法，本发明在此处就不做详细说明。
也可以采用液体发酵法，其具体工艺如下：
1)选用纳豆激酶高产菌株，直接在平板上进行分离筛选，分离平板优选LB-琼脂糖-纤维蛋白平板：LB培养基配制时用0.01M磷酸钾缓冲液(PB pH7.4)溶解，制作平板时，将人血纤维蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同琼脂糖-纤维蛋白平板。
2)根据所选用的不同菌种的最佳培养条件，所用到的发酵培养基中的氮源、碳源和无机盐可以进行选择，氮源可以选择大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酪蛋白酸水解物以及干大豆粉末等中的一种或多种，使用的质量浓度为0.5～4％左右；碳源可以是葡萄糖、木糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖和蔗糖中的一种或多种，其质量浓度优选在1.0～10.0％左右；无机盐可以选择KH2PO4约0.2％、K2HPO4约0.4％、MgSO4约0.05％、CaCl2约0.02％等。
根据本发明优选的方法，使用纳豆杆菌进行发酵制备种子液，发酵至OD＝0.3～1.0，以1.0～2.0％左右的接种量进行液体深层发酵，发酵温度25～40℃，发酵周期12～35小时，pH为6～8。
作为优选，纳豆激酶组合物的制备方法为：
1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液，以3000～6000rpm离心，取上清液浓缩，得到纳豆激酶浓缩液；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.10～1.20的黄芪浸膏；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.20～1.45的当归浸膏；
4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液混合，即得。
纳豆激酶发酵液要进行离心，转速以3000～6000rpm为优，可除去发酵液中的大部分菌体和杂质。由于纳豆激酶为热敏性物质，浓缩一般选用常温超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为50000～200000，超滤压力为0.1～0.3MPa，截留率≥90％，浓缩倍数视发酵液中纳豆激酶的纤溶活性而定。
纳豆激酶组合物的制备方法还可以是：
1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液，以3000～6000rpm离心，取上清液浓缩，真空冷冻干燥，得到纳豆激酶冻干粉；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1～1.20的浸膏，干燥，得到黄芪干粉；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.20～1.45的浸膏，干燥，得到当归干粉；
4)将黄芪干粉、当归干粉与纳豆激酶冻干粉混合，即得。
本发明的组合物可以包括药学可接受的辅料，按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任何常规剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂等。药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。
本发明所述的纳豆激酶组合物的日服用量为1g,其中1g组合物中纳豆激酶的纤溶活性仅为200～400IU，远远低于常规用量，但完全可以达到甚至超过纳豆激酶纤溶活性2000IU的溶栓效果，因此可大大节约成本，减轻血栓性疾病患者的经济压力。
根据现有技术可知，黄芪和当归均有一定的溶栓作用，其活性成分分别为黄芪甲苷和阿魏酸，要达到较好的溶栓效果，阿魏酸的用量为每日0.1～0.5mg，黄芪甲苷的用量为每日0.4～4mg。而服用本发明的组合物，阿魏酸的日服用量仅为0.02～0.03mg，黄芪甲苷的日服用量仅为0.02～0.03mg，远远低于常规用量。
本发明的用于溶栓的纳豆激酶组合物由纳豆激酶、当归和黄芪三种组分组成，这三种组分发挥协同增效的作用，能够延长动脉血栓形成时间，降低静脉血栓重量，加速体外血栓溶解的作用。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
以下实施例中所述纳豆激酶发酵液均按下述方法制得：
1)选用纳豆杆菌高产菌株，直接在平板上进行分离筛选，分离平板优选LB-琼脂糖-纤维蛋白平板：LB培养基配制时用0.01M磷酸钾缓冲液(PB pH7.4)溶解，制作平板时，将人血纤维蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同琼脂糖-纤维蛋白平板。
2)发酵培养基中氮源选择大豆蛋白胨，使用的质量浓度为0.5～4％左右；碳源为葡萄糖，其质量浓度优选在1.0～10.0％左右；无机盐可以选择KH2PO4约0.2％、K2HPO4约0.4％、MgSO4约0.05％、CaCl2约0.02％。使用纳豆杆菌进行发酵制备种子液，发酵至OD＝0.3～1.0，以1.0～2.0％左右的接种量进行液体深层发酵，发酵温度25～40℃，发酵周期12～35小时，pH为6～8，得到纳豆激酶发酵液。
实施例1
该组合物由纳豆激酶、当归和黄芪组成，其中，纳豆激酶的用量以纳豆激酶纤溶活性计，每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为200IU；黄芪的用量以黄芪甲苷计，该组合物中黄芪甲苷的含量为0.02mg/g；当归的用量以阿魏酸计，该组合物中阿魏酸的含量为0.02mg/g。
该组合物的制备方法为：
1)将纳豆激酶发酵液以3000rpm离心，将上清液常温超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为50000，超滤压力为0.1MPa，得到纳豆激酶浓缩液；
2)将黄芪加水提取，将提取液过滤，滤液浓缩成60℃下相对密度为1.10的黄芪浸膏；
3)将当归加水提取，将提取液过滤，滤液浓缩成60℃下相对密度为1.20的当归浸膏；
4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液按比例进行混合，以确保每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为200IU，黄芪甲苷的含量为0.02mg，阿魏酸的含量为0.02mg。
实施例2
该组合物由纳豆激酶、当归和黄芪组成，其中，纳豆激酶的用量以纳豆激酶纤溶活性计，每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为400IU；黄芪的用量以黄芪甲苷计，该组合物中黄芪甲苷的含量为0.03mg/g；当归的用量以阿魏酸计，该组合物中阿魏酸的含量为0.03mg/g。
该组合物的制备方法为：
1)将纳豆激酶发酵液以6000rpm离心，将上清液常温超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为200000，超滤压力为0.3MPa，得到纳豆激酶浓缩液；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.20的黄芪浸膏；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.45的当归浸膏；
4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液进行混合，以确保每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为400IU、黄芪甲苷的含量为0.03mg、阿魏酸的含量为0.03mg。
实施例3
该组合物由纳豆激酶、当归和黄芪组成，其中，纳豆激酶的用量以纳豆激酶纤溶活性计，每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为300IU；黄芪的用量以黄芪甲苷计，该组合物中黄芪甲苷的含量为0.025mg/g；当归的用量以阿魏酸计，该组合物中阿魏酸的含量为0.025mg/g。
该组合物的制备方法为：
1)将纳豆激酶发酵液以5000rpm离心，将上清液常温超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为100000，超滤压力为0.2MPa，得到纳豆激酶浓缩液；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.15的黄芪浸膏；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.35的当归浸膏；
4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液按比例进行混合，以确保每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为300IU、黄芪甲苷的含量为0.025mg、阿魏酸的含量为0.025mg。
实验例1对大鼠体内动脉血栓形成的影响实验
取SD大鼠70只，体重在180～220g，雌雄各半，将其随机分为7组，每组10只，雌雄各5只，分别为实验组1、2、3，对照组1、2、3，以及空白对照组。实验组1、2、3分别给药实施例1、2、3的组合物，给药剂量为1g/kg；对照组1给药纳豆激酶冻干粉(2000IU/g)、对照组2给药黄芪提取物(黄芪甲苷的含量为0.03mg/g)、对照组3给药当归提取物(阿魏酸的含量为0.03mg/g)，对照组给药剂量均为1g/kg；空白对照组给予1g/kg的生理盐水。采用灌胃给药，每天一次，连续七天，末次给药后30分钟，将大鼠用20％乌拉但麻醉，剥离大鼠颈总动脉，在远心端进行动脉插管用四道生理记录仪加测血压，在近心端用45％的三氯化铁溶液浸泡的0.5cm宽的滤纸条包裹动脉，记录从包裹到血压降为0时的时间为动脉血栓形成时间，记录数据，各组进行组间t检验统计分析。结果见表2
表1本发明药物组合物胶囊对大鼠体内动脉血栓形成的影响(X±SD)
组别 例数(n) 剂量(g/kg) 动脉血栓形成时间(min)
空白对照组 10 1 10.55±1.54
实验组1 10 1 15.4±2.25ΔΔ
实验组2 10 1 15.7±2.74Δ
实验组3 10 1 15.25±1.30ΔΔ
对照组1 10 1 12.7±2.74Δ
对照组2 10 1 10.86±2.15
对照组3 10 1 10.93±1.30Δ
注：与空白对照组比较，Δp＜0.05ΔΔp＜0.01。
实验组1～3与对照组和空白对照组比较均能延长动脉血栓形成时间。统计结果分析表明，本发明的纳豆激酶组合物具有延长动脉血栓形成时间的作用。
实验例2对大鼠体内静脉血栓形成的影响实验
取SD大鼠70只，体重在180～220g，雌雄各半，将其随机分为7组，每组10只，雌雄各5只，分别为实验组1、2、3，对照组1、2、3，以及空白对照组。实验组1、2、3分别给药实施例1、2、3的组合物，给药剂量为1g/kg；对照组1给药纳豆激酶冻干粉(2000IU/g)、对照组2给药黄芪提取物(黄芪甲苷的含量为0.03mg/g)、对照组3给药当归提取物(阿魏酸的含量为0.03mg/g),对照组给药剂量均为1g/kg；空白对照组给予1g/kg的生理盐水。采用灌胃给药，每天一次，连续七天，末次给药后30分钟，将大鼠用20％乌拉但麻醉，剥离大鼠下腔总静脉，在左肾静脉下端用线结扎下腔总静脉，3h后打开下腔总静脉取出血栓称重，记录数据，各组进行组间t检验统计分析。结果见表2
表2本发明药物组合物胶囊对大鼠体内静脉血栓形成的影响(X±SD)
注：与空白对照组比较Δp＜0.05ΔΔp＜0.01。
由上表可知，本发明的纳豆激酶组合物的血栓重量与空白对照组比较均有所降低，且明显低于对照组1～3。统计结果分析表明，本发明药物组合物具有降低静脉血栓重量的作用。
实验例3对家兔体内外血栓溶解的影响实验
取健康家兔一只，颈动脉采血，静止2小时，用手术刀仔细分取0.5g血块70粒，称重后分别放入7只试管中，每只试管放入10粒血块。将试管分为7组，分别为实验组1、2、3，对照组1、2、3，以及空白对照组。实验组1、2、3分别给药实施例1、2、3的组合物0.14g+4.86g蒸馏水；对照组1添加纳豆激酶冻干粉(2000IU/g)0.14g以及4.86g蒸馏水、对照组2添加黄芪提取物(黄芪甲苷的含量为0.03mg/g)0.14g以及4.86g蒸馏水、对照组3添加当归提取物(阿魏酸的含量为0.03mg/g)0.14g以及4.86g蒸馏水,对照组分别添加给药剂量为0.14g；空白对照组给予5ml蒸馏水。放入37℃水浴箱中水浴3h，取出吸去水分后称重，按下列公式计算溶解率：溶解率＝(溶解前重量-溶解后重量)/溶解前重量×100％，结果见表3。
表3本发明药物组合物胶囊对体外血栓溶解的影响(X±SD)
组别 例数(n) 剂量(g) 溶解率(％)
空白对照组 10 5 11.8±2.89
实验组1 10 5 56.81±5.34Δ
实验组2 10 5 57.43±2.45ΔΔ
实验组3 10 5 58.6±4.81ΔΔ
对照组1 10 5 39.66±4.11Δ
对照组2 10 5 13.79±1.87Δ
对照组3 10 5 13.15±2.39
注：与空白对照组比较Δp＜0.05ΔΔp＜0.01，
本发明的纳豆激酶组合物与空白对照组比较均能增加体外血栓溶解率，且溶栓效果明显优于对照组。统计结果分析表明，本发明的纳豆激酶组合物具有加速体外血栓溶解的作用。

Claims (7)

1.用于溶栓的纳豆激酶组合物，其特征在于：该组合物包括纳豆激酶、当归和黄芪组成；每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为200～400IU。
2.根据权利要求1所述的用于溶栓的纳豆激酶组合物，其特征在于：该组合物中黄芪甲苷的含量为0.02～0.03mg/g。
3.根据权利要求1所述的用于溶栓的纳豆激酶组合物，其特征在于：该组合物中阿魏酸的含量为0.02～0.03mg/g。
4.权利要求1～3中任一项所述的用于溶栓的纳豆激酶组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液，离心，取上清液浓缩，得到纳豆激酶浓缩液；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成黄芪浸膏；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成当归浸膏；
4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液混合，即得。
5.根据权利要求4所述的用于溶栓的纳豆激酶组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液，以3000～6000rpm离心，取上清液浓缩，得到纳豆激酶浓缩液；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.10～1.20的黄芪浸膏；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.20～1.45的当归浸膏；
4)将黄芪浸膏、当归浸膏与纳豆激酶浓缩液混合，即得。
6.根据权利要求5所述的用于溶栓的纳豆激酶组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液，以3000～6000rpm离心，取上清液浓缩，真空冷冻干燥，得到纳豆激酶冻干粉；
2)将黄芪加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.10～1.20的浸膏，干燥，得到黄芪干粉；
3)将当归加水提取，将提取液浓缩成60℃下相对密度为1.20～1.45的浸膏，干燥，得到当归干粉；
4)将黄芪干粉、当归干粉与纳豆激酶冻干粉混合，即得。
7.根据权利要求4所述的用于溶栓的纳豆激酶组合物的制备方法，其特征在于：所述枯草杆菌为纳豆杆菌。
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