CN105925612A - 一种基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，该方法通过RNA干扰技术来抑制Dby基因的表达，进而降低雄性小鼠的出生比例来进行小鼠的性别控制。具体的，该方法通过抑制Y染色体上的Dby基因表达，来抑制Dby基因功能的实现，而Dby基因作为胚胎早期发育的重要基因，其功能的丧失会导致Y染色体及雄性受精卵的发育受阻，进而降低雄性小鼠的出生比例，由此达到小鼠性别控制的目的。

Description

一种基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法。
背景技术
性别控制(Sex control)是指人为地干预动物的生殖过程，使得雌性动物生产出符合特定性别后代的一门生物技术。动物性别控制技术在预防人类遗传疾病、提高畜禽生产能力、动物遗传育种及濒危珍稀动物的保护等方面有着重要意义。
目前对于动物性别控制的方法有很多，但都不适合大规模推广应用：
一、X、Y精子分离
精子分离的方法有层析法(X、Y精子DNA含量差异)、电泳法(X、Y精子携带电荷差异)、Percoll密度梯度离心法(X、Y精子密度差异)、免疫分离法(H-Y抗血清抗体特异性结合Y精子)和流式细胞分离法(X、Y精子DNA含量差异，目前在家畜生产中应用的最广泛最成熟的技术是流式细胞术分离法。
运用流式细胞术分离X、Y精子的原理是精子能够与DNA荧光染料Hoechst 33342特异性地结合，由于X、Y精子所携带DNA的含量不同，根据两者之间结合染料后发出荧光的差异可以实现对其进行分离。
有研究表明应用流式细胞仪分离的兔精子进行受精，X精子产生雌性的比例为94％，Y精子产生雄性的比例为81％。2000年9月，英国Cogent公司正式将牛性控精液商业化，推出了冷冻性控精液。利用流式细胞术分离的水牛新鲜精液对母畜进行人工授精，产母犊比例达87.39％。此外，流式细胞分离法在茸鹿、绒山羊和猪等物种上的研究应用均有一定的性控效果。性控精液在分选过程中相对于普通精液有大约70％的精子由于损伤或者信号不能被识别而被浪费，这无疑减少了优良公畜的使用率；此外精子数量少、活力低下，母畜受胎率低也是性控精液在使用中不可忽视的缺点。
该技术在奶牛生产中有广泛的应用，但是其成本很高。不同动物精子分离及处理、保存等要求差异很大，分选精子的速度每小时可分选6×106个，对于单次输精量很大的动物(比如：猪)并不适用，这是在很多物种上都存在的问题，因此限制了该技术的推广应用。怎样提高母畜使用性控精液输精的受胎率，也是生产中所面临的问题。
二、早期胚胎性别鉴定
鉴定利用IVF产生的早期胚胎性别，主要是利用细胞遗传学、生物化学、免疫学等方法来判断。利用PCR技术对哺乳动物植入前的胚胎进行鉴定，准确率可以达到90％以上。但是早期胚胎性别鉴定需要一定的专业技术，易受外部环境污染，不能很好地应用于养殖企业，鉴定完性别的胚胎需要借助胚胎分割、胚胎移植等手段，技术难度较高。进行胚胎移植操作可能会降低母畜的受胎率，不能满足正常的生产需要。
三、妊娠选择
在医学和生产中主要通过B超对胎儿的性别进行观察，对预期性别胎儿进行保留，不符合预期胎儿进行引产处理。目前该方法主要在人类医学鉴定中，在牛上对妊娠中期的母牛胎儿进行B超检测，准确率可达87.7％。利用DNA探针检测母畜外周血及深度测序同样能够判断胎儿性别，但成本很高。妊娠选择途径会增加养殖成本，对母畜造成一定伤害，一般说来动物性别控制技术很少采用此种途径。
四、环境控制
母畜的营养状况、季节、疾病状况、激素水平、年龄、胎次、发情状况、受精的时间等均会对后代的性别比例产生一定的影响。
在白尾鹿上的研究表明，发情后36h内进行交配的雌鹿产生的雄性后代比例为27.1％，发情后37-96h进行交配的雌鹿产生的雄性后代比例为69.7％。对母牛进行人工授精时，选择发情早期输精能够得到49.6％的雄性率，发情中期和晚期输精则雄性率分别达到53.6％和60.8％。这暗示着掌握好母畜的发情规律对做好动物性别控制技术十分重要。但是在生产中大规模群体的母畜发情规律并不一致，不同动物发情期前后的性别控制效果尚需探索。
根据动物X、Y精子对外部环境酸碱变化的耐受力不同，可以通过改变母畜生殖道pH的方法实现性别控制。X精子在相对偏酸的环境中游动会快于Y精子，在碱性环境则表现出相反的结果。利用乳酸和乳酸钠分别灌注母兔的阴道，本交后发现分别能够显著地提高雌性和雄性后代的出生比例，且对母兔怀孕率、产仔数没有影响。同样地，使用精氨酸处理母牛生殖道可以提高雌性后代所占的比例，在一定程度上还能够提高母牛受胎率。在小鼠的体外受精液中添加雌激素使得雌性后代的比例提高，说明改变母畜的激素水平也有一定的性别控制效果。添加高浓度的镉到小鼠精子获能液中，可以显著提高体外受精(in vitro fertilization，IVF)雄性囊胚所占比例，但是在进行皮下注射时却没有显著效果，反而会降低雄性小鼠生殖能力。另外做IVF时普遍会出现雄性比例高于雌性的现象，这可能是与受精方式对雌性胚胎的X染色体失活有关，在培养液中添加视黄酸可以使性别比例恢复平衡。
影响受精的环境因素十分复杂，通过改变受精环境对家畜进行性别控制的效果重复性较差。使用IVF的方法能够很好地控制体外培养环境，结合胚胎性别鉴定技术，对已知性别胚胎进行移植是一种进行性别控制研究的有效方法，但该技术的复杂性使得其在生产中难以大规模推广。
五、类原始生殖细胞移植
哺乳动物主要依靠原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的分化形成精子或卵子的前体细胞，PGCs具有一定的全能性。类原始生殖细胞(primordial germ cell-like cells，PGCLCs)是一类在体外利用诱导的方法使胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)或诱导多能性干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPSCs)分化成的类似于PGCs的细胞，PGCLCs可以在体外分化形成精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)，之后移植到雄性睾丸中通过不断地分裂生成精子。利用这种方法可以治疗男性的不育症，甚至在体外通过ESCs与睾丸组织匀浆物质共培养就可以生成可育的圆形精子细胞。
将雌性动物PGCLCs在体外诱导生成“雌性精子”，或者移植到去除内源PGCs的雄性动物睾丸中，使其只产生单一的X精子，这对动物性别控制技术是一大突破。但该技术应用尚不成熟，目前有关雌性动物PGCLCs的研究尚未见报道。另外，由PGCLCs产生的精子样细胞不具有自然受精能力，需借助单精卵胞浆注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术，适合于体外胚胎的获得。该技术理想的性别控制效果只适用于产生雌性动物，对雄性动物的选择并不适用。
六、Sry基因敲出敲入
哺乳动物的性别是多种转录因子和生长因子相继表达和相互调控的结果，主要是由遗传所决定。哺乳动物的性别主要由受精卵在受精时精子所携带的性染色体决定，主要是X和Y两种类型。性染色体内含有决定其性别的关键基因，如Sry基因、DAX1基因等。同时，哺乳动物的性别也取决于常染色体，因为常染色体内也含有与性别有关的基因，如SOX9基因、WT1基因等。敲除Sry基因的小鼠会出现性逆转的现象，如外貌类似雌鼠，具有像雌鼠一样的内生殖器等，但是其繁殖能力丧失；相类似地，向小鼠XX雌性胚胎导入含有Sry的一段DNA片段，部分小鼠产生了性反转，其在生长性能(大小、体重)，交配方式与正常XY型雄性小鼠相比并无差异，但同样繁殖力丧失。因此敲除或敲入Sry基因虽然能够改变动物的性别，但是造成的生育功能的丧失使得该技术不能应用于生产中。
RNA干扰(RNAi)技术是一种转录后的基因沉默现象，是通过人工合成或体内形成的双链小RNA，在细胞内特异性降解其同源mRNA，使相应的基因沉默，达到阻止细胞特定基因表达的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，以解决上述问题。
根据本发明的一个方面，提供了一种基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，该方法通过RNA干扰技术来抑制Dby基因的表达，进而降低雄性小鼠的出生比例来进行小鼠的性别控制。具体的，该方法通过抑制Y染色体上的Dby基因表达，来抑制Dby基因功能的实现，而Dby基因作为胚胎早期发育的重要基因，其功能的丧失会导致Y染色体及雄性受精卵的发育受阻，进而降低雄性小鼠的出生比例，由此达到小鼠性别控制的目的。
在一些实施方式中，RNA干扰技术是通过向小鼠受精卵雄原核注射抗Dby基因的siRNA来实现的。因此，可以通过抗Dby基因的siRNA来抑制Y染色体上Dby基因的表达，同时siRNA易降解，不会在胚胎中长期存留，避免给胚胎造成额外的代谢负担，以此可以提高胚胎的存活率，尤其是雌性胚胎的存活率。
在一些实施方式中，siRNA的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。siRNA的碱基序列与靶基因通过配对结合，来降解靶基因，达到抑制靶基因表达的效果，因此，siRNA的序列直接决定了与靶基因结合的效率及RNA干扰的效果，而当siRNA序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7时，其抑制Dby基因表达的效果最佳，可以达到最好的性别控制目的。
在一些实施方式中，该抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，所述方法包括如下步骤：
1)选择Dby基因上的靶位点；
2)根据Dby基因上的靶位点序列设计合成shRNA，并构建抗DbyshRNA慢病毒表达载体；
3)用抗Dby shRNA慢病毒表达载体侵染靶细胞；
4)选用抗Dby shRNA慢病毒表达载体侵染靶细胞并检测靶细胞中Dby基因的mRNA表达水平，筛选出抑制效果好的shRNA1；
5)根据筛选出的shRNA1设计合成相应的siRNA，并将siRNA注射入小鼠胚胎，检测其对胚胎Dby mRNA的抑制效果；
6)将siRNA显微注射至小鼠受精卵，并将受精卵移植至代孕母鼠子宫内，待小鼠出生。
由此，通过细胞体外检测筛选出最有效的siRNA，进而将siRNA显微注射入小鼠受精卵中，可以有效的对小鼠后代的进行性别控制，尤其是可以显著降低雄性小鼠的出生比例，提高性别控制的效率。
在一些实施方式中，siRNA的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。siRNA的碱基序列与靶基因通过配对结合，来降解靶基因，达到抑制靶基因表达的效果，因此，siRNA的序列直接决定了与靶基因结合的效率及RNA干扰的效果，而当siRNA序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7时，其抑制Dby基因表达的效果最佳，可以达到最好的性别控制目的。
在一些实施方式中，siRNA显微注射入小鼠受精卵的浓度为20μM。siRNA通过与与Dby基因通过配对结合，来降解Dby基因。而显微注射所用注射针的体积固定为10pL，只有通过合适的siRNA浓度来达到最佳的抑制Dby基因表达的效果。当siRNA显微注射浓度低时，无法有效的抑制Dby基因的表达，而当浓度过高时，又会给受精卵造成过重的代谢负担，影响受精卵的发育，进而影响胚胎的成活率。由此，当siRNA显微注射的浓度为20μM时，可以达到最佳的抑制Dby基因表达的效果。
在一些实施方式中，用于筛选有效shRNA时所用的靶细胞是MC3T3-E1细胞系，由此可以达到最佳的筛选效果，及可以准确的筛选出对Dby基因抑制效果最好的shRNA。
附图说明
图1为慢病毒载体pGLV/H3/GFP+Puro Vector示意图。
图2为shRNA1连接到pGLV/H3/GFP+Puro Vector载体中的测序结果图。
图3为shRNA2连接到pGLV/H3/GFP+Puro Vector载体中的测序结果图。
图4为shRNA3连接到pGLV/H3/GFP+Puro Vector载体中的测序结果图。
图5为shRNA4连接到pGLV/H3/GFP+Puro Vector载体中的测序结果图。
图6为shRNA慢病毒表达载体侵染293T细胞系结果，图中A、B、C、D代表慢病毒包装后载体的稀释倍数，分别为10-1、10-2、10-3、10-4。
图7为不同shRNA慢病毒表达载体对MC3T3-E1细胞系的侵染结果图。
图8为不同shRNA对小鼠MC3T3-E1细胞中Dby的干扰效果图，图中Blank为空白组；NC为NC载体侵染组；shRNA1-shRNA4为shRNA载体侵染组，不同字母标注表示差异显著。
图9为注射siRNA对8细胞胚胎Dby mRNA表达量的影响，图中不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合附图对发明作进一步详细的说明。
本发明中所涉及的pGLV/H3/GFP+Puro Vector载体购于上海吉玛制药技术有限公司；Dby基因序列来源于GenBank accession number：NM-012008.2；内参基因GAPDH基因序列来源于：GenBank accessionnumber：NM_001289726.1；293T及MC3T3-E1细胞购自中科院上海细胞库。1、抗Dby shRNA慢病毒表达载体的构建
按照siRNA设计原则针对Dby基因设计4个靶位点，根据靶位点设计并合成相应shRNA的DNA插入序列，其4个靶位点的shRNA名称及对应DNA插入序列及NC阴性对照序列见下表1：
将shRNA对应的DNA插入序列经酶切、连接克隆到慢病毒表达载体pGLV/H3/GFP+Puro Vector后，挑取单个阳性细菌克隆团进行测序，经测序比对发现结果完全正确，构建成相应的抗Dby shRNA慢病毒，结果见附图2-5。
2、抗Dby shRNA慢病毒表达载体侵染靶细胞
2.1 293T及MC3T3-E1细胞的培养
打开水浴锅并将温度设置为37℃，待温度达到后从液氮罐中取出细胞冻存管，立即投入37℃水浴中迅速解冻。将解冻后的细胞悬液在超净工作台中转移至离心管内，加入3倍培养液，800转/分钟，室温离心5分钟后去上清，加入含10％胎牛血清的培养液悬浮沉淀细胞，将细胞稀释至所需浓度，接种到直径6厘米的培养皿中，39℃5％CO2培养箱静置培养，次日换液，当细胞汇合度达到80-90％时可进行传代培养。
2.2慢病毒侵染393T细胞及慢病毒滴度检测
1)铺板：293T细胞，96孔板，加入0.5-1×105个细胞/孔，每孔中加入0.1ml DMEM细胞培养基+10％FBS牛血清，37℃、5％CO2过夜培养；
2)稀释病毒：稀释液配方为：DMEM细胞培养液+10％FBS牛血清+终浓度5μg/ml Polybrene，将慢病毒(10-20ul)用稀释液十倍稀释为3-5个梯度的病毒液；
3)移去步骤3.1中细胞培养液，加入步骤3.2稀释后的病毒液0.05ml，同时建立对照(mock control)，37℃、5％CO2过夜培养；
4)移去细胞培养液，加入0.1ml DMEM细胞培养基+10％FBS牛血清，37℃、5％CO2过夜培养；
5)通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
2.3抗Dby shRNA慢病毒表达载体的包装
构建合格的抗Dby shRNA慢病毒表达载体需要进行慢病毒的包装才具有侵染细胞的能力。包装过程由苏州吉玛基因有限公司完成，对包装后的载体按照2.2的方法侵染293T细胞系，结果见附图6。慢病毒侵染293T细胞72h后进行慢病毒滴度的检测，4个抗Dby shRNA及NC的慢病毒表达载体包装后的慢病毒滴度均达到了1×108TU/mL的浓度，可以用于靶细胞的转染，检测结果见下表2：
2.4靶细胞的侵染
1)靶细胞铺板：24孔板，加入2.5×105个细胞/孔，加入0.5ml细胞完全培养液，37℃、5％CO2过夜培养；
2)稀释病毒：稀释液(靶细胞维持液培养基)400ul+终浓度5ug/mlPolybrene，将慢病毒原液按1:4、1:9、1:19加入到稀释液中；
3)移去步骤4.1中细胞培养液，加入步骤4.2中稀释后的病毒液，同时建立对照(blank、negative)，37℃、5％CO2过夜培养；
4)24小时后移去细胞侵染后的病毒液，加入0.5ml细胞完全培养液，37℃、5％CO2过夜培养；
5)根据细胞状态和类型，加入0.5ml细胞完全培养液，继续培养48小时；荧光倒置显微镜下观察结果。
按照上述方法对靶细胞MC3T3-E1细胞系进行抗Dby shRNA慢病毒表达载体的侵染，72h后在倒置荧光显微镜下观察计数不同抗Dby shRNA慢病毒表达载体对MC3T3-E1细胞系的侵染效果。结果表明4个抗Dby shRNA及NC的慢病毒表达载体均有较好的侵染效果，侵染效率均达到70％以上，能够用于验证shRNA对MC3T3-E1细胞系中Dby mRNA水平的干扰效果，结果见附图7。
3、抗Dby shRNA慢病毒表达载体的筛选
不同抗Dby shRNA慢病毒载体侵染MC3T3-E1细胞系96h后消化收集各组细胞，按照OMEGA公司的Total RNA Kit I试剂盒的方法抽提细胞总RNA，电泳检测抽提质量，微量核酸浓度仪测定RNA的浓度及纯度。质量合格的RNA进行反转录和定量PCR。结果表明MC3T3-E1细胞系转染不同抗Dby shRNA慢病毒表达载体后Dby mRNA表达量并不一致。其中shRNA4和NC组与空白对照组Dby mRNA表达量一致，shRNA1能够显著抑制Dby mRNA水平至对照组的14％(P<0.05)，shRNA2和shRNA3组Dby mRNA表达量反而显著高于对照组(P<0.05)。这说明shRNA1对MC3T3-E1细胞系的Dby mRNA干扰效率最高，可以以此序列作为参考合成相应的siRNA序列，在早期胚胎上对Dby mRNA的表达进行干扰，结果见附图8。
4、注射抗Dby基因的siRNA对胚胎Dby mRNA抑制效果
根据shRNA1的序列合成相应的siRNA序列如下表3，NC序列参考表1中的阴性对照。
siRNA合成后用DEPC水稀释到20μM，分装到RNase-free的200μL EP管中，每管20μL，-20℃可以保存6个月。每次注射前拿出当次所需管数解冻，避免反复冻融。
将20μM浓度的Nc-siRNA及siRNA注射到小鼠受精卵的雄原核，受精卵体外培养。24h后统计受精卵的卵裂率，48h后统计到达8细胞时期的胚胎数目。统计结果如下表4：
收集注射siRNA后体外发育到8细胞时期的胚胎，抽提胚胎RNA、反转录，通过定量PCR检测siRNA对小鼠早期胚胎中Dby mRNA水平的干扰效果。结果表明siRNA注射组小鼠8细胞时期胚胎的Dby mRNA水平被下降到对照组的6.1％，两组间差异极显著(P<0.01)。说明siRNA能够显著地下调小鼠早期胚胎中的Dby mRNA水平，结果见附图9。
5、注射抗Dby基因的siRNA对出生小鼠性别比例的影响
收集小鼠受精卵并进行Nc-siRNA及siRNA的雄原核显微注射，Nc-siRNA及siRNA显微注射的浓度20μM，分别注射300个受精卵左右，注射完毕收集受精卵进行活率检测，并将存活的受精卵移植至假孕受体母鼠的输卵管，采用双侧输卵管移植手术，每侧移植15个左右的胚胎，各移植10只受体母鼠。待小鼠出生后，进行经χ2检验与理论性别比例(33/33)检验，结果见表5：
结果表明，显微注射20μM siRNA至受精卵雄原核后，移植至10个受体母鼠内，共有8只母鼠妊娠，平均窝产仔数为8.25，后代小鼠中雌性为52只，雄性为14只，经χ2检验与理论性别比例(33/33)检验差异显著(P＜0.05)。结果表明，显微注射20μM siRNA可以显著提高雌性小鼠的出生比例，达到性别控制的目的。
在其他的实施例中，显微注射siRNA至受精卵雄原核的浓度还可以为15μM、25μM或30μM等其他浓度。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述方法通过RNA干扰技术来抑制Dby基因的表达，进而降低雄性小鼠的出生比例来进行小鼠的性别控制。
2.根据权利要求1所述的基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述RNA干扰技术是通过向小鼠受精卵雄原核注射抗Dby基因的siRNA来实现的。
3.根据权利要求2所述的基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求2所述的基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)选择Dby基因上的靶位点；
2)根据Dby基因上的靶位点序列设计合成shRNA，并构建抗DbyshRNA慢病毒表达载体；
3)用抗Dby shRNA慢病毒表达载体侵染靶细胞；
4)选用抗Dby shRNA慢病毒表达载体侵染靶细胞并检测靶细胞中Dby基因的mRNA表达水平，筛选出抑制效果好的shRNA1；
5)根据筛选出的shRNA1设计合成相应的siRNA，并将siRNA注射入小鼠胚胎，检测其对胚胎Dby mRNA的抑制效果；
6)将siRNA显微注射至小鼠受精卵，并将受精卵移植至代孕母鼠子宫内，待小鼠出生。
5.根据权利要求4所述的基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
6.根据权利要求5所述的基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述的siRNA显微注射的浓度为15-30μM。
7.根据权利要求4所述的基于抑制Dby基因表达来进行小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述的靶细胞是MC3T3-E1细胞系。
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