CN105925582B - 非酒精性脂肪肝细胞核酸适体及其应用 - Google Patents

非酒精性脂肪肝细胞核酸适体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种非酒精性脂肪肝细胞核酸适体及其应用，非酒精性脂肪肝细胞核酸适体的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的DNA片段。本发明的非酒精性脂肪肝细胞核酸适体具有高特异性和高亲和力，可应用于制备非酒精性脂肪肝的治疗药物、制备检测非酒精性脂肪肝病的检测试剂盒和非酒精性脂肪肝组织切片成像。

Description

非酒精性脂肪肝细胞核酸适体及其应用
技术领域
本发明涉及核酸技术领域，尤其涉及一种非酒精性脂肪肝细胞核酸适体及其应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，是代谢综合征(MS)在肝脏的特征性表现。随着社会的经济发展，人们生活方式及饮食结构的改变，NAFLD患病率迅猛增高，发病年龄渐趋低龄化，已成为21世纪全球重要的公共健康难题之一。NAFLD已经成为欧美等发达国家和我国慢性肝病的首位病因，它不但可以导致肝硬化、肝癌及肝功能衰竭，更与MS、糖尿病(diabetes mellitus，DM)相关的心脑血管疾病的发生、发展及死亡密切相关。NAFLD的发病机制尚未明确阐明，可能是多因素复杂的病理生理机制，“二次”打击学说被认为是目前较为成熟的解释其发病机制的理论：初次打击主要是胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)。二次打击主要是反应性氧化代谢产物增多，导致脂质过氧化，细胞因子、线粒体解偶联蛋白被诱导活化，进而引起脂肪变性的肝细胞发生炎症、坏死，甚至进展至肝纤维化。目前，NAFLD的治疗主要包括健康宣传教育，改变生活方式，控制体质量，减少腰围，改善IR，纠正代谢紊乱，减少附加打击以免加重肝脏损害以及保肝抗炎药物防治肝炎和纤维化。尚无特异性的药物及方法，不能有效到达靶标。因此，建立和发展有效的特异性的靶向治疗方法是改善NAFLD病情，从而改善预后的关键。
核酸适体是指用指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成特殊的三维结构，如发夹、G-四聚体等，从而特异性地识别靶向物质并影响其生物活性。相比抗体，其具备以下优点：靶分子广、亲合力强、特异性高、修饰剪裁方便、无毒性和免疫原性、组织渗透性及稳定性好。2006年美国佛罗里达大学谭蔚泓(Weihong Tan)教授的研究团队在SELEX基础上发展了一项新的针对活细胞的筛选技术，也被称为细胞-SELEX(Cell-SELEX)。该技术以活细胞为筛选对象，从而确保了目标分子保持其天然构象，最大程度的保留了其生物功能。其基本原理是在体外人工合成一个寡核苷酸文库，包括RNA、ssDNA，通过寡核苷酸文库与目标分子的相互作用，结合PCR技术指数级放大与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或数十轮筛选过程，获得高亲和力和高特异性的核酸适体。近年来发展的核酸适体探针，尤其是细胞靶向的核酸适体，为NAFLD靶向治疗带来了新的希望和解决途径。
发明内容
目前，国内外尚无特异性针对NAFLD细胞的核酸适体的报道，本发明要解决的问题是首次提供一种高特异性和高亲和力结合NAFLD细胞的核酸适体以及该核酸适体的应用。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种非酒精性脂肪肝(NAFLD)细胞核酸适体，所述NAFLD细胞核酸适体的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的DNA片段。
上述的NAFLD细胞核酸适体，优选的，所述NAFLD细胞核酸适体还包括基于所述SEQID NO.1所示的DNA片段做切短，并具有G四聚体结构或者茎环结构的非酒精性脂肪肝细胞核酸适体。
上述的NAFLD细胞核酸适体，优选的，所述NAFLD细胞核酸适体还包括基于所述SEQID NO.1所示的DNA片段做延长，并具有G四聚体结构或者茎环结构的非酒精性脂肪肝细胞核酸适体。
上述的NAFLD细胞核酸适体，优选的，所述NAFLD细胞核酸适体还包括基于所述SEQID NO.1所示的DNA片段做碱基替换，并具有G四聚体结构或者茎环结构的非酒精性脂肪肝细胞核酸适体。
本发明中，核酸适体的特异性取决于核酸适体中特殊性的G四聚体结构或者茎环结构，所以其两端碱基部分延长或者切短，只要不影响其重要的茎环结构就可以特异性结合NAFLD细胞，达到NAFLD的生物医学检测以及靶向治疗的效果。
本发明参照下述核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：
S1、合成单链DNA随机寡核苷酸文库和引物；
S2、诱导分化NAFLD细胞，将NAFLD细胞与单链DNA随机寡核苷酸库孵育，进行Cell-SELEX筛选；
S3、将首轮筛选产物进行PCR扩增得到扩增产物；
S4、将所述步骤S3所得的PCR扩增产物以链霉亲和素琼脂糖珠为基质进行分离得到用于次轮筛选的单链DNA文库；
S5、以步骤S4所得的单链DNA文库为原始来源，重复步骤S2至S4，直至获得目的寡核苷酸序列。
上述的筛选方法，优选的，所述单链DNA随机寡核苷酸文库具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列。
SEQ ID NO.2：5’-CGACACCTCCAGACGC(25N)TCGTCCACTGTGCCTC-3’。
上述的筛选方法，优选的，引物包括SEQ ID NO.3所示的引物、SEQ ID NO.4所示的引物。
SEQ ID NO.3：5’-FITC-CGACACCTCCAGACGC-3’；
SEQ ID NO.4：5’-Biotin-GAGGCACAGTGGACGA-3’。
上述的筛选方法，优选的，所述SEQ ID NO.3所示的引物3’端带有FITC标记；所述SEQ ID NO.4所示的引物5’端带有生物素标记。
上述的筛选方法，优选的，所述步骤S2中所述Cell-SELEX筛选具体包括以下步骤：
S2-1、诱导分化NAFLD细胞，将所述NAFLD细胞与上述单链DNA随机寡核苷酸库进行孵育，使单链DNA序列与NAFLD细胞特异结合；
S2-2、将结合在NAFLD细胞上的单链DNA解离得到首轮筛选产物；.
上述的筛选方法，优选的，诱导分化NAFLD细胞的具体步骤为：将HepG2细胞接种于10cm培养皿，采用完全培养液(完全培养液的成分含10％FBS和100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素的高糖DMEM)，在37℃、5％的CO2条件下培养，每2天换液1次，当细胞密度达到60％～70％时开始诱导分化。倾去原培养液，改用终浓度含100mM油酸，50mM棕榈酸，1×10﹣6M地塞米松，1×10﹣12M胰岛素的诱导液继续培养细胞，每2天换培养液1次，直至1周，显微镜下可见90％以上细胞已经诱导分化为NAFLD细胞。
上述的筛选方法，优选的，所述步骤S2-1中所述孵育的温度为4℃，孵育时间为1h。
上述的筛选方法，优选的，所述步骤S2-2中所述解离的具体过程为：收集NAFLD细胞于去离子水中，于95℃加热15min，使单链DNA序列从NAFLD细胞的表面膜蛋白上解离下来，在4℃、14000rpm转速离心5min，取上清液得到首轮筛选产物。
上述的筛选方法，优选的，所述步骤S4具体为：
S4-1：将所述PCR扩增产物过DNA层析柱，使PCR扩增产物中的dsDNA吸附DNA层析柱的链霉亲和素琼脂糖珠上；
S4-2：将NaOH加入到DNA层析柱中，收集滤液。
上述的筛选方法是优选的，所述步骤S5中，重复次数为20次。
作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种采用前述的NAFLD细胞核酸适体在制备NAFLD治疗药物中的应用。
作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种采用前述的NAFLD细胞核酸适体在制备检测NAFLD的检测试剂盒中的应用。
作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种采用前述的NAFLD细胞核酸适体在NAFLD组织切片成像中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种NAFLD细胞核酸适体，目前，国内外尚无特异性针对NAFLD细胞的核酸适体的报道，本发明首次提供一种高特异性和高亲和力结合NAFLD细胞的核酸适体以及该核酸适体可应用于生物医学检测及靶向治疗。
(2)本发明的NAFLD细胞核酸适体，以活细胞为靶细胞进行筛选，最大限度的保证靶蛋白的自然属性，所筛选的核酸适体具有高特异性和高亲和力、无毒，分子量小为(分子量为28147)，易于合成与标记，在生物医学检测以及靶向治疗方面将有重要的潜在应用价值。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为富集文库不同循环周期扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为流式细胞仪检测筛选进程中DNA随机寡核苷酸库对HepG2细胞的富集图。
图3为流式细胞仪检测筛选进程中DNA随机寡核苷酸库对NAFLD细胞的富集图。
图4为NFD-1核酸适体的测序结果图。
图5为第15轮筛选到的NAFLD细胞特异性核酸适体NFD-1的二级结构。
图6为流式细胞仪测定所得的第15轮DNA随机寡核苷酸库对NAFLD细胞对解离常数。在图中横坐标为DNA浓度(nM)，纵坐标为平均荧光强度。
图7为流式细胞仪测定所得核酸适体NFD-1对正负筛选细胞的偏移。
图8为温度对核酸适体NFD-1的影响，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数，紫色曲线为4℃，蓝色曲线为37℃。
图9为蛋白酶处理细胞后对核酸适体NFD-1的影响，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数，绿色曲线为trypsin处理后30min，蓝色曲线为Proteinase K处理后30min。
图10为NAFLD细胞核酸适体对不同石蜡切片的特异性结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1：体外筛选与NAFLD细胞特异性结合的核酸适体
(1)第1轮筛选：
1.1、NAFLD细胞的诱导分化：
将HepG2细胞接种于10cm培养皿，采用完全培养液(完全培养液中含10％FBS、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素的高糖DMEM)，在37℃、5％的CO2条件下培养，每2天换液1次，当细胞密度达到60％～70％时开始诱导分化。倾去原培养液，改用终浓度含100mM油酸、50mM棕榈酸、1×10﹣6M地塞米松和1×10﹣12M胰岛素的诱导液继续培养细胞，每2天换培养液1次，直至1周，显微镜下可见90％以上细胞已经诱导分化为NAFLD细胞。
1.2、使用20nmol的高通量的单链DNA随机寡核苷酸库(1015数量级)文库溶解于500μL结合缓冲液(结合缓冲液采用以下方法制备得到：将4.5g右旋葡萄糖、100mg tRNA、1g牛血清蛋白、5mL溶度为5M氯化镁同时溶解于1L DPBS溶液中，于4℃冰箱冷藏，保存时间不超过2个月，以下所使用的缓冲液均采用同样方法制备得到)中得到DNA悬浮液。将DNA悬浮液在95℃加热5min，立即置于冰上冷却直到使用。
单链DNA随机寡核苷酸库为：
5’-CGACACCTCCAGACGC(25N)TCGTCCACTGTGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)，其中25N为25个碱基的随机序列。
引物1：5′-FITC-CGACACCTCCAGACGC-3′(SEQ ID NO.3)；
引物2：5′-Biotin-GAGGCACAGTGGACGA-3′(SEQ ID NO.4)。
1.3、在一个100mm×20mm的培养皿中约包含有超过5×106个细胞培养细胞(即由HepG2细胞诱导分化的NAFLD细胞)，而在一个60mm×15mm的培养皿中约包含有1×106个HepG2细胞。将细胞培养至90％聚合度时，进行第一轮筛选。
具体步骤为：
1.3.1、用洗涤缓冲液(洗涤缓冲液采用以下方法制备得到：4.5g右旋葡萄糖，5mL溶度为5M氯化镁溶解于1L DPBS溶液中，于4℃冰箱冷藏，保存时间不超过2个月，以下所使用的洗涤缓冲液均采用同样方法制备得到)洗涤培养皿中的细胞3次，然后加入1000μL步骤(1)中的DNA悬浮液，使DNA悬浮液能够充分覆盖培养皿表面，在4℃摇床(50rpm)上缓孵育1h。
1.3.2、孵育后用5mL洗涤缓冲液轻轻洗涤3次，每次3min，以去除不能特异性结合的细胞培养细胞(即由HepG2细胞诱导分化的NAFLD细胞)的单链DNA序列，洗涤过程中尽量避免细胞脱落。
1.3.3、用细胞刮子刮离培养皿中的细胞，收集细胞于500μL的不含DNA的去离子水中；然后转移到1.5mL离心管中，保证所有的细胞均已转移到离心管中。将离心管在95℃加热15min，使与细胞表面膜蛋白结合的DNA序列解离下来。然后在4℃下以14000rpm转速离心5min。收集离心后的上清液，此为第1轮筛选产物。
(2)PCR扩增第1轮筛选产物：
将步骤(1)中制得的第1轮筛选产物进行PCR扩增得到扩增产物。
其中扩增引物为：
引物1：5′-FITC-CGACACCTCCAGACGC-3′(SEQ ID NO.3)；
引物2：5′-Biotin-GAGGCACAGTGGACGA-3′(SEQ ID NO.4)。
PCR反应体系总体积为1000μL，具体成分列于表1中。
表1：PCR反应体系表
将上述PCR反应体系混合均匀后用移液枪平均分装到5个0.5mL PCR管中(60孔热循环仪)，每管200μL。
PCR扩增参数为：变性：95℃30s；退火：58.0℃30s，延伸：72℃30s。分别循环变性、退火、延伸步骤4，6，8，10，12个周期，然后进行最后一次延升：72℃3min。
同时设置1管同为12个循环周期的阴性对照，表2为PCR反应体系和阴性对照的成分表。
表2：PCR反应体系表和阴性对照成分表
将扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行评估，其中琼脂凝胶电泳选用含有0.06％溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶来进行分离。将分别将阴性对照品、不同循环周期的PCR产物以及标准液(Ladder)按照表3的成分进行配制，然后充分混匀后加入凝胶孔中，在100V电压下电泳30min，然后在紫外成像仪下观察分析电泳条带。
表3：琼脂糖疑腚电泳成分配制表
图1为富集文库不同循环周期扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，图中标号1为标准液(Ladder)，标号2为阴性对照，标号3为4个循环周期的PCR产物，标号4为6个循环周期的PCR产物，标号5为8个循环周期的PCR产物，标号6为10个循环周期的PCR产物，标号7为12个循环周期的PCR产物。从图1中可知：标号7的PCR产物最多，证明循环周期为12的PCR效果最佳。
(3)富集文库扩增PCR：
将凝胶电泳中标号7的PCR产物切割下来，进行PCR扩增，PCR反应体系总体积为1000μL，表4为PCR扩增的反应体系具体成分。
表4：PCR扩增的反应体系成分表
PCR扩增参数为：变性：95℃30s；退火：58.0℃30s，延伸：72℃30s。分别循环变性、退火、延伸步骤12个周期，然后进行最后一次延升：72℃3min。
扩增后将得到1000μL扩增产物，一般而言从第3轮起开始固定用于下一轮筛选的富集单链DNA产物为50～100pmol，1000μL的扩增产物已足够用于下一轮筛选。多余的产物可用于流式检测筛选时富集的过程和冰冻备用。
(4)ssDNA的制备：
4.1、在空白的DNA层析柱一端塞入滤膜(滤膜孔径为0.02μm)，在另一端接注射器。将200μL链霉亲和素琼脂糖珠悬浮液通过注射器注入DNA层析柱，加压注射器活塞过滤掉链霉亲和素琼脂糖珠缓冲液。用2mL的DPBS缓慢洗涤滤膜上的琼脂糖珠，并重复洗涤3次。
4.2、采用步骤4.1的注射器吸取步骤(3)中得到的扩增产物，加压活塞过滤扩增产物中的液体，因PCR产物中的互反义链含有生物素，所以dsDNA能吸附在链霉亲和素琼脂糖珠上；为最大限度的回收扩增PCR产物。用2.0mL的离心管收集过滤的PCR扩增产物中的液体，再次过滤。然后加入2.5mL 1×DPBS洗去残存液体和未标记的非特异性DNA。
4.3、用注射器吸取500μL 200mM的NaOH，加压活塞，用2.0mL的离心管收集过滤液，即ssDNA溶液。
(5)ssDNA脱盐：
5.1、准备NP5脱盐柱，上方加入一漏斗.加入15mL的去离子水冲洗脱盐柱。
5.2、在NP5脱盐柱中加入步骤(4)中收集到的ssDNA溶液500μL，让溶液缓慢流出，ssDNA则留在NP5脱盐柱中。
5.3、再加入1000μL不含DNA的去离子水，留在NP5脱盐柱中的ssDNA将和去离子水一起流出，收集滤液。
5.4、在260nM的紫外吸收波长测定滤液中ssDNA浓度。
5.5、用真空干燥机中干燥样品，DNA沉淀溶解于结合缓冲液中，调整其浓度为1000nM，储存于-20℃冰箱中备用。
(6)第2轮筛选：
我们引入了负筛选，即用HepG2细胞作为负细胞。第2轮筛选的随机文库为第1轮筛选获得的文库，文库与HepG2细胞诱导的NAFLD细胞孵育后接着与HepG2细胞孵育，两种细胞均为5×106个，再接着进行PCR扩增，其余步骤与第一轮筛选相同。
具体步骤为：在1个100mm×20mm的培养皿中约包含有超过5×106个HepG2细胞诱导的NAFLD细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，加入第1轮筛选获得的单链DNA文库(即步骤(5)中获得的ssDNA)，使DNA悬浮液能够充分覆盖培养皿表面，在4℃摇床上孵育1h(50rpm)。孵育后用5mL洗涤缓冲液轻轻洗涤3次，每次3min，去除不能特异性结合靶细胞的单链DNA序列，洗涤过程中尽量避免细胞脱落。用细胞刮子刮离细胞，收集细胞于500μL不含DNA的去离子水中并转移到1.5mL离心管中，保证所有的细胞均已转移到离心管中。将离心管在95℃加热15min，使与细胞表面膜蛋白结合的DNA序列解离下来。在4℃14000rpm条件下离心5min。收集包含DNA的洗脱液上清，此上清液再与100mm×20mm的培养皿中约包含有超过5×106个HepG2细胞孵育1h(50rpm)。孵育后用5mL洗涤缓冲液轻轻洗涤3次，每次3min，收集洗涤液离心并进行PCR扩增。
(7)第3轮筛选：
我们从第3轮起固定用于筛选的文库量为50pmol，同时逐渐减少阳性细胞的数量(第1轮和第2轮时用100mm×20mm的培养皿.而到第3轮以后时可以改在60mm×15mm的培养皿上进行筛选)，延长洗涤时间和增加洗涤缓冲液的量，减少孵育时间(从1h逐渐减少至30min)，加结合缓冲液中FBS的量(从10％逐渐增加至20％)。负筛选的细胞均保持在5×106个，孵育时间保持在1h，其余与第2轮筛选相同。
具体步骤为：在1个60mm×15mm的培养皿中约包含有超过1×106个HepG2细胞诱导的NAFLD细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，加入第二轮筛选获得的单链DNA文库，使DNA悬浮液能够充分覆盖培养皿表面，在4℃摇床上孵育30min(50rpm)。孵育后用5mL洗涤缓冲液轻轻洗涤3次，每次3min，去除不能特异性结合靶细胞的单链DNA序列，洗涤过程中尽量避免细胞脱落。用细胞刮子刮离细胞，收集细胞于500μL不含DNA的去离子水中并转移到1.5mL离心管中，保证所有的细胞均已转移到离心管中。将离心管在95℃加热15min，使与细胞表面膜蛋白结合的DNA序列解离下来。在4℃14000rpm条件下离心5min。收集包含DNA的洗脱液上清，此上清液再与100mm×20mm的培养皿中约包含有超过5×106个HepG2细胞孵育1h(50rpm)。孵育后用5ml洗涤缓冲液轻轻洗涤3次，每次3min，收集洗涤液离心并进行PCR扩增。
(8)第4至第20轮筛选：其筛选方法与第3轮筛选一致，每次筛选均是用上一轮筛选获得的文库。
(9)流式细胞术监测文库富集：
流式细胞术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞。流式细胞仪通常以激光作为发光源。被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。在筛选过程中，FITC标记的的ssDNA用于检测筛选的进度。
检测步骤如下：
样本准备：供试样本：选取1×106个生长状态良好的经诱导分化的NAFLD细胞，待细胞生长丰度达到90％左右时用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，再用非酶消化液37℃消化细胞10min，轻轻吹打细胞，将细胞制成单个细胞悬液。再次用洗涤缓冲液洗涤细胞2次(4℃，1150rpm，4min)，计数细胞，将细胞悬液浓度调整至1×106个/mL，分装于流式细胞仪管。每管加入250nM的待检测的各轮筛选富集产物，混匀后于4℃孵育30min。孵育结束后再次用洗涤缓冲液洗涤2次(4℃，1150rpm，4min)，最后将每管细胞悬浮于200mL结合缓冲液中，上机检测。
阴性对照：另准备1×106个HepG2细胞，加入250nM DNA文库，作为阴性对照。
图2、3为流式细胞仪检测筛选进程中DNA寡核苷酸序列对NAFLD细胞的富集图。在图中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数，绿色曲线为初始DNA随机核苷酸序列库，蓝色曲线为第15轮DNA富集寡核苷酸序列，黄色曲线为第20轮DNA富集寡核苷酸序列。
从图2中可知：第15轮富集序列与负筛选细胞有较强荧光信号，提示其与负筛选细胞均有结合，但与正筛选细胞的结合能力更强，第18轮富集序列的荧光信号较第15轮结果有所减低，且与负筛选细胞的信号减低更多，说明此时序列中与正筛选细胞结合的序列占了绝大多数，文库已经得到富集。第20轮富集序列荧光信号进一步降低，与负细胞的荧光信号基本回复到阴性对照，可能丢失了某些与正筛选细胞结合的序列。
从图3中可知：第15轮富集序列与正筛选细胞有较强荧光信号，提示其与正筛选细胞均有结合，第18轮富集序列的荧光信号较第15轮结果有所减低，文库已经得到富集。第20轮富集序列荧光信号进一步降低，可能丢失了某些与正筛选细胞结合的序列。
(10)测序：
本实施例采用454测序方法。454测序技术依靠DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
具体步骤如下：
10.1文库制备：将454测序引物5’端与PCR引物连接。
10.2、乳液PCR扩增：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，然后磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他影响。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后的片段被回收纯化用于测序实验。
10.3、测序反应：携带ssDNA的珠子与其他反应物混合后放入PTP板中。PTP孔的直径(29μm)只能容纳一个珠子(20μm)。然后将PTP板放置在GS FLX中开始测序。每添加一个与模板链互补的核苷酸都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获，由此一一对应，准确、陕速地确定待测模板的碱基序列。
10.4、数据分析：测序结束后，每个序列的引物部分被去除，中间的随机序列部分应用Clustal 1.83软件进行比对进行同源序列分析。
图4为NFD-1的测序结果。由图中可知，NFD-1的DNA片段为：
5’-CGACACCTCCAGACGCACGCTCGACACGACACCTCCAGACCGCCTCGTCCACTGTGCCTC-3’(SEQ ID NO.1)。
图5为第15轮筛选到的NAFLD细胞特异性核酸适体NFD-1的二级结构。
(11)亲和力测定：
用流式细胞技术测定所筛选到的核酸适体与靶细胞的亲和力，具体步骤如下：
11.1、将合成的核酸适体和结合缓冲液配置成浓度分别为：250nM，125mM，62.5nM，31.25nM，15.625mM，6.25nM，1nM，0.25mM的梯度浓度溶液。
11.2、选取生长状态良好，处于对数生长期，细胞丰度达到90％以上诱导分化的NAFLD细胞，去除培养基，用洗涤缓冲液于4℃洗涤2次。
11.2、加入3mL的非酶消化液(非酶消化液不含胰蛋白酶等蛋白消化酶类，其成分包括：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、1％酚红溶液。)于37℃消化5～15min不等，当细胞变圆漂浮时终止消化，轻斜培养皿，去除非酶消化液。
11.4、加入5mL洗涤缓冲液，慢慢吹打重悬细胞，收集细胞于15mL离心管中，1150rpm离心3min，重复洗涤3次。
11.5、计数细胞，收集细胞于流式管中，每管含细胞数1×106个，体积为100μL结合缓冲液。
11.6、将FITC标记的NFD-1核酸适体和随机文库与1×106细胞在4℃孵育30min.终浓度为250nM。
11.7、用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，用结合缓冲液200μL重悬细胞，上机检测。
11.8、计算相对荧光强度时，用所测的平均荧光强度减去对照随机文库的荧光信号强度后，使用Sigmaplot软件计算核酸适体的解离常数，核酸适体的解离常数通过公式Y＝Bmax X/(Kd+X)。
图6为流式细胞仪测定所得的第15轮DNA随机寡核苷酸库对NAFLD细胞对解离常数。在图中横坐标为DNA浓度(nM)，纵坐标为平均荧光强度。
从图6中可知：NFD-1与NAFLD细胞的解离常数在nmol级别，说明NFD-1具有与靶细胞较强的结合能力。亲和性是核酸适体的一个重要特性，常用平衡解离常数表示。一个好的核酸适体与靶细胞常具有较强的亲和性，即具有较小的解离常数。
(12)流式细胞仪测定所得核酸适体NFD-1对正负筛选细胞的偏移。
12.1、用DNA合成仪合成筛选得到的序列，每条序列的5’用FITC标记。合成完毕后的核酸适体经过HPLC纯化后干燥备用；
12.2、取生长良好的经诱导分化的NAFLD细胞，倾去培养基，用PBS洗涤3次；
12.3、加入3mL的非酶消化液于37℃消化l0min，待细胞由扁平变圆，少数开始脱落时，终止消化；
12.4、加入5mL洗涤缓冲液，轻轻吹打重悬细胞，收集于15mL离心管中，计数细胞，分装于流式管中，每100μL溶液中加入1×106个靶细胞，1150rpm离心3min，再次用洗涤缓冲液洗涤3次；
12.5、将合成的5’端标记FITC的核酸适体和随机文库与细胞在4℃孵育30min，核酸适体的终浓度为250nM；
12.6、重复用洗涤缓冲液洗涤2次，最后用200μL结合缓冲液重悬浮细胞上机检测计数2×104个细胞。
图7为流式细胞仪测定所得核酸适体NFD-1对正负筛选细胞的偏移。在图7中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数。
用流式细胞仪检测其亲和性与特异性。通常，与对照ssDNA文库相比，如果荧光信号平均值超出10％即可认为与靶细胞有结合。从图7中可知：NFD-1对正筛选细胞显示出明显的信号前移，而对负筛选细胞基本没有移动，说明其对靶细胞亲和力高，而对负筛选无亲和力。
实施例2
考察温度对核酸适体NFD-1的影响。
因为筛选的条件是在4℃下进行的，所做的结合试验也是在4℃下进行的，但是人体的内环境温度是37℃，因此我们研究了在4℃和37℃温度下，核酸适体和靶细胞的亲和力有没有影响。
具体步骤如下：
(1)将合成的FITC标记的核酸适体和随机对照文库用结台缓冲夜配置成浓度为250nM的溶液，置于4℃保存。
(2)选取生长状态良好，处于对数生长期，细胞丰度达到90％以上诱导分化的NAFLD细胞，去除培养基，用洗涤缓冲液于4℃洗涤2次。
(3)加入3mL的非酶消化液于37℃消化5～15min不等，当细胞变圆漂浮时终止消化，轻斜培养皿，去除非酶消化液。
(4)加入5mL洗涤缓冲液，慢慢吹打重悬细胞，收集细胞于15mL离心管中，1150rpm离心3min，重复洗涤3次。
(5)计数细胞，收集细胞于流式管中，每管含细胞数1×106个，体积为100μL结合缓冲液；
(6)将FITC标记的各浓度核酸适体和随机文库与1×106个细胞分别在37℃和4℃孵育30min.终浓度为250nM。
用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，用结合缓冲液200μL重悬细胞，上机检测。
Cell-SELEX技术是在4℃条件下进行的，核酸适体与靶细胞的亲和力实验也是在4℃条件下进行。人体的体温却是37℃，不同的温度可能对核酸适体与靶细胞的亲和力产生影响，而筛选到的核酸适体要想获得更好的实验意义，需要在37℃条件下进行与靶细胞的亲和力实验。
图8为温度对核酸适体NFD-1的影响，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数，紫色曲线为4℃，蓝色曲线为37℃。从图8中可知：不论是在4℃还是在37℃条件下，NFD-1和靶细胞均具有相同的结合能力。
实施例3
考察蛋白酶处理细胞后对核酸适体NFD-1的影响。
(1)收集生长状态良好，处于对数生长期，细胞丰度达到90％以上诱导分化的NAFLD细胞，用蛋白酶K或胰蛋白酶于37℃分别消化30min，用洗涤缓冲液洗涤细胞3次。
(2)计数1×106个细胞，收集细胞于流式细胞管中，每管细胞中加入250nM核酸遁体100μL，于﹣4℃孵育30min。
(3)孵育结束后再次洗涤细胞3次，用200μL洗涤缓冲液重悬细胞，上机检测。
通过Cell-SELEX技术筛选到的核酸适体通常和细胞膜上的蛋白特异性结合，为了验证NFD-1与细胞膜蛋白结合，我们选用trypsin和Proteinase K两种蛋白酶实验，我们用trypsin和Proteinase K两种蛋白酶与细胞孵育30min，破坏细胞膜上的膜蛋白，然后用NFD-1与经蛋白酶处理后的靶细胞孵育，用流式细胞术检验。
图9为蛋白酶处理细胞后对核酸适体NFD-1的影响，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数，绿色曲线为trypsin处理后30min，蓝色曲线为Proteinase K处理后30min。
从图9中可知：NFD-1与经蛋白酶处理后的靶细胞无荧光前移，说明NFD-1与经蛋白酶处理后的靶细胞无结合能力，进一步验证了NFD-1的靶标是细胞的膜蛋白。
实施例4
考察NAFLD细胞核酸适体对不同细胞系的结合能力。
检测所筛选到的核酸适体的特异性，使用流式细胞技术检测核酸适体与其他细胞的结合情况。实验过程中所使用的细胞种类包括：人肝细胞癌亚型LH86和Huh7，CEM(T淋巴细胞白血病细胞)，Ramos(B淋巴细胞白血病细胞)、H23(非小细胞肺癌细胞)、A549(肺癌细胞亚型)、H661(大细胞肺癌)、CAOV3(卵巢腺癌)、NAFLD、CK562、MCF-7、HepG2、H23。
步骤如下：
(1)选取生长状态良好，处于对数生长期，细胞丰度达到90％以上的各细胞系，去除培养基.用洗涤缓冲液于4℃洗涤2次。
(2)加入3mL的非酶消化液于37℃消化5～15min不等，当细胞变圆漂浮时终止消化，轻斜培养皿，去除非酶消化液。
(3)加入5mL洗涤缓冲液，慢慢吹打重悬细胞，收集细胞于15mL离心管中，1150rpm离心3min，重复洗涤3次。
(4)计数细胞，收集细胞于流式管中，每管含细胞数1×106个，体积为100μL结合缓冲液。
(5)将FITC标记的核酸适体和文库与1×106个细胞在4℃孵育30min，终浓度为250nM。
(6)用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，用结合缓冲液200μL重悬细胞，上机检测。
(7)FACScall流式细胞仪检测荧光强度，计数2×104个细胞，使用FITC标记的随机ssDNA文库作为对照。通过计算核酸适体与文库对照位移比例来评价核酸适体与细胞的结合能力。
表5：NAFLD细胞核酸适体对不同细胞系的结合能力结果表。
-：0、<10；+：10～35％；++：35～60％；+++：60～85％；++++：>85％。
从表5中可知：NFD-1与HepG2细胞无结合能力，与HepG2细胞诱导分化的NAFLD细胞有较强的结合能力，与人肝细胞癌亚型(LH86)，T淋巴细胞白血病细胞(CEM)，B淋巴细胞白血病细胞(Ramos)，非小细胞肺癌细胞(H23)，肺癌细胞亚型(A549)，乳腺癌(MCF-7)，卵巢腺癌(CAOV3)，人肝细胞癌亚型(Huh7)等均无结合能力。提示筛选到的核酸适体具有较强的特异性。
实施例5
考察NAFLD细胞核酸适体NFD-1对石蜡切片的特异性。
(1)脱蜡：将石蜡切片浸入二甲苯中3次，每次10min。
(2)水化：已脱蜡的切片依次浸入无水乙醇、95％乙醇和70％乙醇中，每次浸没10min。
(3)抗原复性：水化的切片用TE Buffer(pH8.0)洗涤后，于沸腾TE Buffer中放置15min。
(4)所述用随机DNA序列封闭非特异性结合：在切片的组织上滴加浓度为1μmol/L的随机序列200μL，低温(4℃)环境下在水平摇床孵育30min。
(5)所述用带荧光信号CY3的核酸适体SYL3C进行孵育：切片的相应组织滴加浓度为250nmol/L的核酸适体150μL，室温环境下在水平摇床孵育60min。
(6)洗涤非特异性结合：将切片置于50mL离心管中，倒入40mL D-PBS进行洗涤，低温(4℃)环境下在水平摇床洗涤3次，每次15min。荧光显微镜下观察结果；同时取来源于同一个组织的石蜡切片用带荧光信号CY3的NFD-1孵育，方法参照经典免疫荧光法。成像结果与SYL3C所得成像结果进行对比。
除了在细胞层面分析核酸适体NFD-1的亲和力和特异性外，我们进一步在组织层面分析其亲和力和特异性。图10为NAFLD细胞核酸适体对不同石蜡切片的特异性结果。从图10中可知：NFD-1对组织切片也具有较好的亲和力及特异性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (4)

1.一种非酒精性脂肪肝细胞核酸适体，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝细胞核酸适体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的非酒精性脂肪肝细胞核酸适体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。
3.一种权利要求1所述的非酒精性脂肪肝细胞核酸适体在制备检测非酒精性脂肪肝的检测试剂盒中的应用。
4.一种权利要求1所述的非酒精性脂肪肝细胞核酸适体在非酒精性脂肪肝组织切片成像中的应用。
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