CN105921512B - 重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法，其是采用序列生物强化的修复策略，先接入芽孢杆菌和枝顶孢霉菌，处理一段时间后再接入黄孢原毛平革菌，使芽孢杆菌和枝顶孢霉菌、黄孢原毛平革菌联合作用，实现现场修复石油污染土壤或油泥，显著地提高了重度石油污染土壤或油泥的降解效率，大大缩短修复周期。

Description

重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法
技术领域
本发明属于重度石油污染土壤或油泥的修复技术领域，具体涉及对油田开采区利用微生物菌群修复处理石油污染的土壤或油泥的新方法。
技术背景
随着人类对石油产品需求量不断增大，石油的开采量也越来越大。在采用过程中，一旦发生石油泄露事故，便极易造成产油区附近土壤、沉积物及水体的污染。石油污染的土壤的主要类型包括石油开采过程中产生的落地原油污染；含油矿渣、污泥、垃圾的堆置；采油废水排放造成的土壤污染；石油泄露事件污染；大气污染及汽车尾气的排放(与大气中的颗粒物质结合、沉降进入土壤造成污染)；其他污染源，特别是石油开采过程中产生的落地原油，已成为石油污染土壤的重要来源。
目前，对于石油污染土壤的处理技术主要包括物理方法、化学方法与生物处理方法。与物理、化学修复污染土壤技术相比，生物修复技术具有成本低，不破坏植物生长所需要的土壤环境，污染物处理安全，无二次污染，处理效果好，操作简单等优点而备受亲莱。
在多种生物修复策略中，生物强化(Bioaugmentation)和生物刺激(Biostimulation)在实践中应用较多，尤其是生物强化。越来越多的实践事实证明，生物强化策略在特定条件下是有助于污染土壤的修复，尤其是在含氯废水或土壤的修复过程中。影响生物强化修复策略成功与否的主要因素有生物强化菌株对环境的耐受能力、对污染物的代谢潜力及污染物的生物可利用性等。除此之外，环境因子如温度、湿度、pH、透气性和营养物质含量等都是影响生物强化有效性的重要元素。
法德国家环境技术中心的Bouchez、Patureau等曾证明，强化微生物的使用不当很可能造成微生物在接种后很快便开始出现消亡，或者不能针对实际污染环境中的污染物种类进行有效的修复，此时的降解效果往往不理想。即便这些强化微生物没有很快地被吞噬掉，其对污染物的降解也很快进入了一个平台期，降解速率也不再提高，且微生物数量及活性也都开始下降，这种情况下便很难保证修复策略的成功。除此之外，Rodriguez、Pelaez等证明了生物强化修复策略中的重接种策略虽然提高了污染物的降解效率，然而其修复的起始污染水平往往较低，且在一定程度上增加了实际的修复成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法，是一种新的利用真菌-细菌菌群的序列生物强化的修复策略，可以显著地提高重度石油污染土壤或油泥的降解效率，特别是对于难降解的多环芳香烃效果明显。
本发明所涉及的三种菌分别为芽孢杆菌、枝顶孢霉菌以及黄孢原毛平革菌，其中：芽孢杆菌Bacillus sp.，菌株保藏号CCTCC NO:AB 2014248，属于已知固体菌剂，该菌菌落呈乳白色，菌落圆形，表面光滑、凸起，边缘整齐，背面颜色与正面一致，无色素分布。枝顶孢霉菌Acremonium sp.Y0997，菌株保藏号为CCTCC NO:M 2016117，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年3月14日，该菌菌落呈白色，菌落圆形，背面奶油色至赭黄色，菌丝无色，光滑且具隔膜，孢子囊梗直接从菌丝上长出，呈锥形多单生，分生孢子无色，光滑，形成簇状或链状，长纺锤形，两头尖，未见厚垣孢子。黄孢原毛平革菌Phanerochaetesp.F0996，菌株保藏号为CCTCC NO:M2016116，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年3月14日，该菌菌落白色，圆形，背面无色，菌落仅有少量凸起；菌丝为无色，蓬松棉絮状，随着培养时间的延长，绒毛状凸起逐渐变平，菌丝消失，形成粉末孢子。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明的一种重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法由以下步骤组成：
(1)采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀；
(2)将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的接种量为15～25g/kg土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为15～25g/kg土壤或油泥，混匀，再加入有机肥料和表面活性剂，加水至土壤或油泥的含水率达15～30％，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15～35℃下，现场处理20～40天；
(3)将黄孢原毛平革菌序列接入经步骤(2)处理的土壤或油泥中，接种量为35～50g/kg土壤，混匀，用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15～35℃下，现场处理20～30天，完成重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化。
上述重度石油污染土壤或油泥的总石油烃起始含量为50000～120000mg/kg土壤或油泥。
上述芽孢杆菌的活菌含量为4.0×108～6.0×109CFU/g，枝顶孢霉菌的活菌含量是7.2×107～8.5×109CFU/g，黄孢原毛平革菌的活菌含量是5.6×107～8.0×109CFU/g。
上述步骤优选(2)为：将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的接种量为15～20g/kg土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为17～23g/kg土壤或油泥，混匀，再加入有机肥料和表面活性剂，其中有机肥料的添加量为500～2000mg/kg，表面活性剂的添加量为1 000～2 500mg/kg，加水至土壤或油泥的含水率达20～25％，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在17～35℃下，现场处理30～35天。
上述步骤(3)优选是：将培养好的黄孢原毛平革菌序列接入重度石油污染土壤或油泥中，接种量为38～45g/kg土壤，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在17～35℃下，现场处理20～30天，完成重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化。
本发明还提供了一种重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法，其是由以下步骤组成：
(1)采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀；
(2)将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的接种量为15～25g/kg土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为15～25g/kg土壤或油泥，混匀，再加入有机肥料和表面活性剂，加水至土壤或油泥的含水率达15～30％，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15～35℃下处理20～40天；
(3)取与步骤(2)等量的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌，重复接入步骤(2)处理后的土壤或油泥中，混匀，在用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，补水搅拌维持土壤或油泥的含水率稳定，在15～35℃下处理20～30天，完成重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理。
步骤(2)优选是：将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的接种量为15～20g/kg土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为17～23g/kg土壤或油泥，混匀，再加入有机肥料和表面活性剂，其中有机肥料的添加量为800～1200mg/kg，表面活性剂的添加量为1200～1600mg/kg，加水至土壤或油泥的含水率达15～30％，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在25～35℃下处理30～35天。
步骤(2)进一步优选是：将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的接种量为15～20g/kg土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为17～23g/kg土壤或油泥，混匀，再加入有机肥料、磷酸二氢钾、尿素和表面活性剂，其中有机肥料的添加量为800～1200mg/kg，表面活性剂的添加量为1200～1600mg/kg，加水至土壤或油泥的含水率达20％，土壤或油泥中C：N：P＝100:10:1，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在25～35℃下处理30～35天。
本发明的重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法，是一种新的真菌-细菌菌群的序列生物强化修复技术，具体利用芽孢杆菌及枝顶孢霉菌与黄孢原毛平革菌对重度石油污染土壤或油泥进行序列强化处理，能够极显著地的提高TPH及PAHs的降解效率，并且大大缩短了修复周期，试验结果表明：试验土壤或油泥中总石油烃(Total petroleumhydrocarbon，TPH)起始含量为110000～120000mg/kg，经过50～70天的修复处理后，土壤或油泥中TPH含量为10000～34500mg/kg，降解效率达到了91％～97％，对5种难降解的多环芳香烃：萘(Naphthalene，NAP)、芴(Fluorene，FLO)、菲(Phenanthrene，PHE)、蒽(Anthracene，ANT)及荧蒽(Fluoranthene，FLA)的降解效果也比较显著，降解率均达到了90％以上，分别为97.95％，99.20％，97.05％，95.89％和93.87％。
附图说明
图1为采用一次强化处理的对比例及采用序列强化处理的实施例1土壤中TPH降解结果；
图2为处理60天空白例土壤或油泥中石油烃组分的气相色谱与质谱联用分析结果；
图3为处理60天对比例土壤或油泥中石油烃组分的气相色谱与质谱联用分析结果；
图4为处理60天实施例1土壤或油泥中石油烃组分的气相色谱与质谱联用分析结果；
图5为不同生物强化处理组轻链与重链石油烃组分的降解结果；
图6为不同生物强化处理组脂肪烃、芳香烃与极性组分的降解结果；
图7为不同生物强化处理组5种芳香烃组分的降解结果。
具体实施方式
现结合试验和实施例对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施方式。
本发明所涉及的三种菌分别为芽孢杆菌、枝顶孢霉菌以及黄孢原毛平革菌，其中：
芽孢杆菌Bacillus sp.，菌株保藏号CCTCC NO:AB 2014248，属于已知固体菌剂，该菌菌落呈乳白色，菌落圆形，表面光滑、凸起，边缘整齐，背面颜色与正面一致，无色素分布。
枝顶孢霉菌Acremonium sp.Y0997，菌株保藏号为CCTCC NO:M 2016117，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年3月14日，其18SrDNA序列为：
该菌菌落呈白色，菌落圆形，背面奶油色至赭黄色，菌丝无色，光滑且具隔膜，孢子囊梗直接从菌丝上长出，呈锥形多单生，分生孢子无色，光滑，形成簇状或链状，长纺锤形，两头尖，未见厚垣孢子。
黄孢原毛平革菌Phanerochaete sp.F0996，菌株保藏号为CCTCC NO:M2016116，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年3月14日，其18SrDNA序列为：
该菌菌落白色，圆形，背面无色，菌落仅有少量凸起；菌丝为无色，蓬松棉絮状，随着培养时间的延长，绒毛状凸起逐渐变平，菌丝消失，形成粉末孢子。
实施例1
利用上述三种菌对重度石油污染土壤进行序列生物强化处理，具体方法由以下步骤组成：
(1)将油井附近采集的重度石油污染土壤置于处理池中，敲粹、混匀，粒径为30～40mm左右；
(2)将培养好的芽孢杆菌及枝顶孢霉菌菌剂混合接入污染土壤中，混匀，再加入有机肥料和表面活性剂，加水调节土壤含水率，将处理池表面覆盖塑料薄膜，并适量通气，每周补水维持土壤或油泥含水量稳定，在15～35℃下，现场处理20～40天。
(3)将黄孢原毛平革菌序列接入污染的土壤中，混匀，用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，补水维持土壤含水量稳定，在15～35℃下，现场处理20～30天，完成重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化。
按照该方法进行实验，具体的工艺条件和降解效率参见表1和表2所示。表1为各实施例的工艺条件
表2为各实施例的强化降解率
实施例2
利用上述三种菌对重度石油污染土壤进行序列生物强化处理，具体方法由以下步骤组成：
(1)采集重度石油污染土壤置于处理池中，将其敲碎，混匀；
(2)将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤中，混匀，再加入有机肥料和表面活性剂、磷酸二氢钾、尿素，加水至土壤或油泥的含水率达15～30％，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15～35℃下处理20～40天；
(3)取与步骤(2)等量的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌，重复接入步骤(2)处理后的土壤中，混匀，在用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，补水搅拌维持土壤的含水率稳定，在15～35℃下处理20～30天，完成重度石油污染土壤的序列生物强化处理。
按照该方法进行实验，具体的工艺条件和降解效率参见表3和表4所示。
表3为各实施例的工艺条件
表4为各实施例的强化降解率
项目 实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6
TPH 75.34％ 85.62％ 78.20％ 80.29％ 72.49％ 73.56％
轻链(Light) 81.78％ 88.33％ 85.26％ 87.26％ 81.52％ 80.87％
重链(Heavy) 65.77％ 69.80％ 71.33％ 74.52％ 62.11％ 50.73％
脂肪烃(SAT) 84.76％ 89.27％ 86.53％ 87.29％ 85.57％ 81.32％
芳香烃(AR) 71.49％ 77.05％ 77.78％ 79.42％ 75.74％ 71.06％
极性组分(PL) 59.70％ 64.29％ 65.01％ 67.28％ 60.44％ 55.79％
萘(NAP) 93.21％ 96.74％ 95.11％ 95.27％ 92.78％ 90.67％
芴(FLO) 98.50％ 98.85％ 98.62％ 98.67％ 96.56％ 92.78％
菲(PHE) 91.14％ 94.37％ 93.89％ 94.28％ 89.90％ 87.41％
蒽(ANT) 88.92％ 91.45％ 91.25％ 91.46％ 89.04％ 88.05％
荧蒽(FLA) 81.78％ 87.78％ 83.47％ 84.22％ 85.56％ 82.97％
上述实验中的处理对象重度石油污染土壤可以用重度石油污染油泥来替换，其处理效果接近。
上述实施例中所用的表面活性剂是生物可兼容性表面活性重油清洗剂KD-L315，属于市售产品。
为了验证本发明的技术效果，申请人做了大量的实验进行验证，现将芽孢杆菌和枝顶孢霉菌使用常规的一次强化策略进行处理作为对比例与实施例1的实验1降解处理效果进行对比，同时还以空白实验作为参照，具体如下：
对比例1
(1)将油井附近采集的污染土壤或油泥，敲粹、混匀，粒径30～40mm左右；
(2)将芽孢杆菌和枝顶孢霉菌菌剂按1:1的比例混合接种，将固体菌剂接入总石油烃起始含量为119260mg/kg的污染土壤或油泥中，菌剂活菌含量分别为5.3×109CFU/g、8.0×109CFU/g，接种量分别为40g/kg土壤，再加入有机肥料和表面活性剂。
(3)调节土壤或油泥含水率为20％。将处理池表面覆盖塑料薄膜，通气，每周补水维持土壤或油泥含水量稳定，在18～35℃下，现场处理60天。
空白例：
(1)与对比例1相同；
(2)向总石油烃起始含量为119260mg/kg的污染土壤或油泥中加入有机肥料和表面活性剂；
(3)与对比例1相同。
对上述对比例和空白例所处理后的土壤或油泥中总石油烃的降解情况进行检测，并与实施例1的实验1进行比较，其处理后的土壤或油泥中TPH含量如下表5所示。
表5为对比例和空白例所与实施例1的对比结果
由图1和表5可知，对比例菌株芽孢杆菌及枝顶孢霉菌一次强化处理组及实施例1的序列强化处理组的处理结果对比表明，采用序列强化处理组的实施例1与一次强化处理组对比例相比，有极显著提高，提高了约25.64％。试验结果表明，采用序列的生物强化方式可以极显著地提高总石油烃的降解效率。
对上述对比例所处理后的土壤或油泥中石油烃组分的降解情况进行检测，并与实施例1的实验1进行比较，处理后土壤或油泥中石油烃组分降解率分别如下表6、表7所示。
表6为对比例所处理后土壤或油泥中石油烃组分与实施例1的对比结果-1
由表6及图2、3、4、5的对比结果表明，采用了序列强化处理的实施例1的实验1(图4)与空白例(图2)、对比例(图3)的降解效果相比，轻、重链的降解效果都有极显著提高，分别提高了13.00％、19.61％。试验结果表明，采用序列的生物强化方式可同时显著地提高轻链和重链的降解效率。
表7为对比例所处理后土壤或油泥中石油烃组分与实施例1的对比结果-2
由表7及图6对比结果表明，采用了序列强化处理的实施例1的实验1对于脂肪烃组分、芳香烃组分及极性组分的降解效果均有极显著的提高，分别提高了14.38％、29.94％、42.37％。
对上述对比例所处理后的土壤或油泥中5种多环芳香烃组分的降解情况进行检测，并与实施例1的实验1进行比较，结果如下表8所示。
表8为对比例所处理后土壤或油泥中5种多环芳香烃组分与实施例1的对比结果
由表8及图7对比结果表明，处理30天时，不同处理组对萘(Naphthalene，NAP)、芴(Fluorene，FLO)、菲(Phenanthrene，PHE)的降解效率均达到90％以上，而对蒽(Anthracene，ANT)的降解效率最低。处理60天后，采用了序列强化处理的实施例1对5种PAHs的降解效率均达到90％以上，而采用了一次强化处理的对比例对蒽(Anthracene，ANT)及荧蒽(Fluoranthene，FLA)的降解也有提高，但没有实施例1处理组的强化作用显著。
综上所述，本发明的真菌-细菌菌群结合序列生物强化的方法对重度石油污染土壤或油泥的降解效率显著提高，特别是对难降解的石油烃组分和多环芳香烃组分均有较好的降解效果。

Claims (1)

1.一种重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化处理方法，其特征在于由以下步骤组成：
（1）采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀；
（2）将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的活菌含量为4.0×108~ 6.0×109CFU/g，接种量为20 g/kg土壤或油泥，枝顶孢霉菌的活菌含量是7.2×107 ~8.5×109 CFU/g，接种量为20 g/kg土壤或油泥，混匀，再加入有机肥料800mg/kg和表面活性剂1500mg/kg，加水至土壤或油泥的含水率达20%，混匀，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~35℃下，现场处理20~40天；
上述枝顶孢霉菌（Acremonium ）菌株名称为Acremonium sp.Y0997，菌株保藏号为CCTCC NO: M 2016117，保藏日期为2016年3月14日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；
（3）将黄孢原毛平革菌序列接入经步骤（2）处理的土壤或油泥中，黄孢原毛平革菌的活菌含量是5.6×107 ~ 8.0×109 CFU/g，接种量为40 g/kg土壤，或者取与步骤（2）等量的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌，重复接入步骤（2）处理后的土壤或油泥中，混匀，用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~35 ℃下，现场处理20~30天，完成重度石油污染土壤或油泥的序列生物强化；
上述的黄孢原毛平革菌（Phanerochaete）菌株名称为Phanerochaete sp.F0996，菌株保藏号为CCTCC NO: M 2016116，保藏日期为2016年3月14日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
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