CN105919994A - 白术内酯iii在制备增强免疫功能的药物及保健品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了白术内酯III在制药领域及保健品领域中的新用途。具体为白术内酯III在制备增强免疫功能的药物及保健品中的应用。白术内酯III能够促进淋巴细胞的增殖,在制备增强淋巴细胞免疫功能药物中的应用,具有潜在价值。此外,白术内酯III能够通过促进免疫相关分子白细胞介素‑2、白细胞介素‑12、γ‑干扰素的分泌,来增强机体的免疫能力,在制备促进免疫相关分子的分泌、治疗免疫缺陷疾病的药物或保健品中,具有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体而言,涉及白术内酯III在制备增强免疫功能的药物及保健品中的应用。
背景技术
白术属菊科植物,其药用部位为白术Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎,主产于浙江、安徽、湖北等省。白术性味甘、苦、温,具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效,是常用的补益中药,有“南术北参”的美称。现代药理学研究表明,白术有利尿、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病和抗衰老等活性。
白术主要的化学成分为多糖、白术内酯类成分、氨基酸、树脂和挥发油类等物质。多糖类成分含有白术多糖、甘露聚糖等;挥发油在白术根茎中约含1.4%,其主要成分为苍术酮(atratylon)、苍术醇等;内酯类成分有白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III、白术内酯IV等。
白术内酯III是白术的主要活性成分,是白术发挥其抗炎、抑瘤、调节胃肠道功能和促进营养物质吸收等作用的重要成分。白术内酯III是一种倍半萜类化合物,其化学结构式如下:
免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成,是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统。其中,免疫细胞是免疫系统发挥免疫功能的基础。淋巴细胞是免疫细胞的重要组成部分,在体内分布广泛,包括T细胞、B细胞和NK细胞等亚类,分别介导机体的细胞免疫、体液免疫及对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤作用等重要免疫学功能。机体免疫功能的高低直接影响机体的抗病能力。提高机体免疫力在很多疾病的治疗中发挥重要作用。许多疾病都需要通过增加免疫细胞数量来提高机体免疫力。研究表明,一些免疫复方可以通过激活免疫细胞而增强机体免疫力。
发明内容
本发明的目的在于提供白术内酯III的新用途,即白术内酯III在制备与免疫功能相关的药物中的应用。
本发明涉及白术内酯III在制备增强免疫功能的药物中的应用。
涉及白术内酯III在制备增强淋巴细胞免疫功能的药物中的应用。
涉及白术内酯III在制备增强脾脏淋巴细胞免疫功能的药物中的应用。
涉及白术内酯III在制备治疗免疫缺陷疾病的药物中的应用。
涉及白术内酯III在制备促进淋巴细胞增殖的药物中的应用。
涉及白术内酯III在制备促进脾脏淋巴细胞增殖的药物中的应用。
涉及白术内酯III在制备促进免疫相关分子的分泌的药物中的应用。
涉及白术内酯III在制备增强免疫功能保健品中的应用。
其中,免疫相关分子包括白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、γ-干扰素(IFN-γ)。
其中,增强免疫功能药物中还可以包括辅料,辅料选自增溶剂、助溶剂、乳化剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、渗透压调节剂、稳定剂、矫味剂、助悬剂、渗透促进剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、包合剂、包衣材料中的任意一种或几种。
淋巴细胞在免疫系统中有着极其重要的作用,是机体免疫功能的主要承担者。检测中药单体或相关化合物是否具有促进淋巴细胞增殖的能力是评价该化合物是否具有增强免疫功能性质的重要依据。MTT实验是检测淋巴细胞体外增殖的经典实验,是一种可靠、简便的检测细胞增殖的技术,在判定药物影响机体免疫功能的研究中被广泛应用。本发明用白术内酯III体外直接作用于脾脏淋巴细胞进行药理活性研究。
采用MTT法研究白术内酯III对小鼠淋巴细胞增殖的影响发现,在浓度为5μg/mL时,白术内酯III促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖的作用与阳性对照刀豆蛋白A(5μg/mL)和脂多糖(20μg/mL)的作用相似。其中,刀豆蛋白A,为促细胞有丝分裂素,主要对T淋巴细胞有激发作用;脂多糖脂是革兰氏阴性菌外膜的主要成分,对人体免疫反应极其重要。由此可见,白术内酯III能够促进脾脏淋巴细胞的增殖,并有剂量依赖性。
采用ELISA法研究白术内酯III对小鼠脾脏淋巴细胞中免疫相关分子IL-2、IL-12和IFN-γ分泌的影响发现,白术内酯III对这三种免疫相关分子的分泌均有促进作用。
其中,IL-2主要由活化的T淋巴细胞产生,是机体免疫调节网络中重要的调节分子,在抑制肿瘤细胞生长及免疫调节方面发挥着重要的作用。IL-2具有促进T细胞增殖分化、活化B淋巴细胞、增强T细胞和NK细胞活性、诱导干扰素生成的作用。小鼠脾脏淋巴细胞经白术内酯III作用后,小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2的能力显著增强,说明白术内酯III能够增强机体的免疫功能。
IL-12是一种具有多种生物学活性的免疫细胞生长刺激分子,主要由树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞产生。IL-12能促进T淋巴细胞和NK细胞的分化与增殖,促进T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞分子,调控细胞免疫。由此可见,白术内酯III通过促进脾脏淋巴细胞分泌IL-12,能够增强机体的免疫功能。
IFN-γ主要由活化的T淋巴细胞产生,是机体免疫调节网络中重要的调节分子,在抑制肿瘤细胞生长及免疫调节方面发挥着重要的作用。IFN-γ可增强抗原提呈细胞与T淋巴细胞的相互作用,进而增强T淋巴细胞辅助抗体产生。IFN-γ水平的高低是机体细胞免疫的重要标志。由此可见,白术内酯III通过促进脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,能够增强机体的免疫功能。
由此可见,适宜剂量的白术内酯III有利于提高机体免疫能力,在免疫缺陷相关疾病的治疗和保健药物的应用中,具有实际应用价值。
从以上结论可以得出本发明的有益效果为:
(1)本发明对已知化合物白术内酯III发掘了新的医疗用途,开拓了白术内酯III在增强免疫功能的药物中的新的应用领域。
(2)本发明的白术内酯III安全无毒,药理活性强,具有很好的药用前景。
(3)本发明的产品原料菊科植物白术,来源丰富、价格价廉、在《本草纲目》中被列为“上品”,是常用的补益中药,未见毒副作用,其中白术内酯III的含量高。白术内酯III的制备工艺简单,且可采用现代制药工艺做成口服剂型、注射剂型、片剂、胶囊剂、颗粒剂等,使用方便,疗效好。
(4)包含白术内酯III的药物能够通过促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,来激活脾脏淋巴细胞的免疫功能,进一步来提高机体的免疫能力。
(5)包含白术内酯III的药物能够通过促进免疫相关分子IL-2、IL-12和IFN-γ的分泌,来增强机体的免疫能力。
此外,由白术内酯III制成的免疫增强剂有助于提高患有免疫缺陷病的患者的免疫能力,同时,也可作为保健品用于增强机体的免疫能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为白术内酯III对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响;图中:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001与对照组相比
图2为白术内酯III对小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2的影响;图中:*P<0.05;**P<0.01与对照组相比
图3为白术内酯III对小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-12的影响;图中:*P<0.05;**P<0.01与对照组相比
图4为白术内酯III对小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的影响;图中:*P<0.05;**P<0.01与对照组相比
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
白术内酯III能够通过促进淋巴细胞增殖、以及促进包括白细胞介素-2、白细胞介素-12和γ-干扰素在内的免疫相关分子的分泌,来进一步增强机体的免疫功能,因此,白术内酯III可以用来制备增强免疫功能的药物。
白术内酯III能够促进包括白细胞介素-2、白细胞介素-12和γ-干扰素在内的免疫相关分子的分泌,而这些免疫相关因子是机体免疫调节网络中重要的调节分子。因此,白术内酯III可以用来制备增强淋巴细胞免疫功能的药物或者保健品。
淋巴细胞主要分布于全身各处的淋巴结中,而脾脏是机体重要的免疫器官,含有大量免疫细胞,具有调节机体细胞免疫和体液免疫的作用。因此,白术内酯III可以用来制备增强脾脏淋巴细胞免疫功能的药物或者保健品。
免疫缺陷疾病是一组由于免疫系统发育不全或遭受损害所致的免疫功能缺陷引起的疾病。而经发明人的研究发现,白术内酯III能够通过促进淋巴细胞增殖、以及促进包括白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、γ-干扰素(IFN-γ)在内的免疫相关分子的分泌,这就说明白术内酯III对免疫缺陷疾病也有一定的治疗作用,可用来制备治疗免疫缺陷疾病的药物或者保健品。
实施例1
采用菊科植物白术的干燥根茎1kg,粉碎后,用90%的甲醇提取,提取物溶于水后分别以石油醚、氯仿和正丁醇萃取得到石油醚部分、氯仿部分和正丁醇部分。氯仿部分经硅胶柱色谱分离纯化得到白术内酯III 500mg,经HPLC检测,纯度为98%以上,经UV、IR、MS、NMR等表征技术测得其波谱数据与现有技术一致。
取100mg的白术内酯III,加入到1000mL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,加热溶解,制成浓度为0.1mg/mL的PBS缓冲溶液,用0.22微米滤膜过滤后,装入药瓶中密封,制成产品。
实施例2
用实施例1的方法得到白术内酯III,取500mg的白术内酯III,加入到1000mL的pH为7.4的PBS缓冲溶液中,加热溶解,混合均匀后,用0.22微米滤膜过滤后,分装成浓度为1mg/2mL/支的注射液于药瓶中密封,制成产品。
实施例3
用实施例1的方法得到白术内酯III,取500mg的白术内酯III,加入到250mL的pH为7.4的PBS缓冲溶液中,加热溶解,混合均匀后,用0.22微米滤膜过滤后,分装成浓度为4mg/2mL/支的注射液于药瓶中密封,制成产品。
实施例4
按本领域普通技术人员公知的方法制备白术内酯III片剂,其中片剂中所含白术内酯III的含量为5%-10%,也可按实际需要加大或者减少白术内酯III的含量。
用实施例1的方法制得白术内酯III,取70g白术内酯III、500g纤维素、400g无水乳糖、200g硬脂酸镁和30g氧化硅,按公知的制片技术和设备进行制片,即取上述配方中的白术内酯III、纤维素、无水乳糖和氧化硅在混合机内充分混合,再筛入硬脂酸镁继续混合,随后用压片机将上述原料冲压成片。
实验例
淋巴细胞在免疫系统中有着极其重要的作用,T淋巴细胞主要介导细胞免疫,B淋巴细胞主要介导体液免疫。可以通过研究淋巴细胞的增殖活性反映机体的免疫状态。脾脏是机体重要的免疫器官,含有大量免疫细胞,主要为T淋巴细胞和B淋巴细胞,具有调节机体细胞免疫和体液免疫的作用。检测脾脏淋巴细胞体外增殖反应,可间接反映机体细胞免疫功能,作为一种可靠、简便的检测技术,在判定药物对机体免疫功能影响的研究中被广泛应用。本发明用实施例1中的白术内酯III体外直接作用于脾脏淋巴细胞,结果显示,白术内酯III可以显著促进淋巴细胞的增殖、以及促进淋巴细胞免疫相关分子的分泌。
为了更好的了解本发明的实质,下面将用白术内酯III在增强脾脏淋巴细胞免疫功能方面的药理实验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
本实验所用的主要试剂、细胞和仪器:
白术内酯III(Atractylenolide III),20mg,HPLC≥98%,购自上海瑶韵生物科技有限公司。刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)购自Sigma公司。RPMI1640培养基购于Gibco公司。青霉素硫酸链霉素(双抗)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)均购自北京索莱宝科技有限公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。其它试剂均为分析纯。用于测定小鼠白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、γ干扰素(IFN-γ)的酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒购自Elabscience公司。
无特定病原体(SPF)级昆明种小鼠,雌、雄性,3日龄,体重20-25g,购自河南省实验动物中心,合格证号为SCXK(豫)2010-0002。
倒置显微镜,ECLIPSE TS100-F,日本NIKON公司。酶标仪(SUNRISE-BASIC TECAN Tecan Austria GmbH)。96孔板离心机(ThermoFisher Scientific)。
做实验前先制备含小鼠脾脏淋巴细胞的脾细胞悬液备用,具体制备方法如下:
小鼠摘眼球放血后脱颈处死,置于75%酒精中浸泡约5min,于超净台中无菌取出脾脏,用磷酸盐(PBS)缓冲溶液除去表面血渍和纤维组织,放入已加PBS缓冲溶液的培养皿中,将脾脏剪成小块,用针桶栓充分研磨后经200目尼龙网过滤,以转速为1000rpm/s离心5min,收集细胞;弃去上清液,裂解红细胞(加入9mL灭菌双蒸水重悬细胞,作用15s,再加入1mL9%NaCl溶液重悬细胞),以转速为1000rpm/s离心5min,收集细胞;弃去上清液,用完全RPMI-1640细胞培养液(含10%灭活的胎牛血清,青霉素、硫酸链霉素)重悬细胞,轻轻吹匀制成脾细胞悬液,并调整脾细胞悬液的细胞浓度至5.0×l06个/mL,置于4℃冰箱中,冷藏备用。
实验例1
本实验例采用MTT法检测白术内酯III对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响。
(1)实验过程
取制备好的脾细胞悬液(5.0×l06个/mL),按照100μL/孔加入到96孔板中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。然后分别加入终浓度为160μg/mL,80μg/mL,40μg/mL,20μg/mL,10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,1.25μg/mL的白术内酯III;同时以终浓度为5μg/mL的ConA、20μg/mL的LPS为阳性对照,以等量的PBS作为阴性对照。每组重复5孔,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48h。
每孔加入20μl,5mg/mL的MTT溶液,置于37℃、5%CO2的培养箱中再次孵育4h,然后在3000rpm/s的转速下离心20min,弃去上清液;每孔加入DMSO 100μL,振荡10min使紫色结晶物完全溶解,用酶标仪于波长为570nm处测定每个孔的吸光度(A)值,并按照下式计算脾脏淋巴细胞的增殖率:
细胞增殖率=各组细胞A570/正常细胞A570×100%
本实验例所有数据均采用SPSS19.0进行处理,以Mean±SEM表示,两组之间比较采用t检验分析。
(2)实验结果
如图1所示,白术内酯III在1.25μg/mL时可促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖,但是与阴性对照组的差异并不显著(P>0.05);白术内酯III在2.5μg/mL-80μg/mL浓度范围内可明显促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,并且存在剂量依赖性(P<0.05,P<0.01,P<0.001),随着白术内酯III的浓度增高,小鼠脾脏淋巴细胞的增殖率逐渐增大。其中,在浓度为5μg/mL时,促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖的作用与阳性对照ConA(5μg/mL)和LPS(20μg/mL)的作用相似。白术内酯III浓度在80μg/mL时,对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的促进作用最显著(P<0.01)。结果表明,白术内酯III能够促进脾脏淋巴细胞的增殖,并有剂量依赖性。可见,适宜剂量的白术内酯III有利于促进脾脏淋巴细胞的增殖,白术内酯III在制备促进脾脏淋巴细胞增殖的药物和保健品的应用中,具有实际应用价值。
实验例2
本实验例采用ELISA法检测白术内酯III对小鼠脾脏淋巴细胞中免疫相关分子IL-2、IL-12和IFN-γ分泌的影响。
(1)实验过程
取制备好的脾细胞悬液(5.0×l06个/mL),按照500μL/孔加入到24孔板中,于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h。然后分别加入终浓度为160μg/mL,80μg/mL,40μg/mL,20μg/mL,10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,1.25μg/mL的白术内酯III;同时以终浓度为5μg/mL的ConA和20μg/mL的LPS为阳性对照,以等量的PBS缓冲溶液作为阴性对照。每组重复3孔,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48h。然后收集细胞培养上清液,于4℃下、在1000rpm/s的转速下离心20min。离心后,再次收集上清液,使用商品化的ELISA试剂盒检测第二次收集的上清液中免疫相关分子IL-2、IL-12、IFN-γ的含量。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行,采用酶联免疫检测仪在波长为450nm处检测吸光度值,并按照说明书计算出不同组别中IL-2、IL-12、IFN-γ这三种分子的含量。实验重复3次。
本实验例所有数据均采用SPSS19.0进行处理,以Mean±SEM表示,两组之间比较采用t检验分析。
(2)实验结果
如图2所示,白术内酯III在5μg/mL-160μg/mL的浓度范围内可明显提高小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2的水平,并存在剂量依赖性(P<0.05,P<0.01),但是白术内酯III浓度超过80μg/mL后对IL-2分泌的影响增加并不明显,IL-2的表达量并没随着浓度升高继续上升。
IL-2主要由活化的T淋巴细胞产生,是机体免疫调节网络中重要的调节分子,在抑制肿瘤细胞生长及免疫调节方面发挥着重要的作用。IL-2具有促进T细胞增殖分化、活化B淋巴细胞、增强T细胞和NK细胞活性、诱导干扰素生成的作用。小鼠脾脏淋巴细胞经白术内酯III作用后,小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2的能力显著增强,进一步证实白术内酯III能够增强机体的免疫功能。
如图3所示,白术内酯III在5μg/mL-80μg/mL的浓度范围内可显著提高小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-12的水平,并存在剂量依赖性(P<0.05,P<0.01),IL-12的浓度在白术内酯III作用量为80μg/mL时最高(P<0.01)。当白术内酯III的浓度超过80μg/mL后IL-12的表达水平并没有继续上升。
IL-12是一种具有多种生物学活性的免疫细胞生长刺激分子,主要由树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞产生。IL-12能促进T淋巴细胞和NK细胞的分化与增殖,促进T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞分子,调控细胞免疫。由此可见,白术内酯III通过促进脾脏淋巴细胞分泌IL-12,能够增强机体的免疫功能。
如图4所示,白术内酯III在5μg/mL-160μg/mL浓度范围内可显著提高小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的水平(P<0.05,P<0.01),并在浓度80μg/mL时IFN-γ表达水平达到最高值。
IFN-γ主要由活化的T淋巴细胞产生,是机体免疫调节网络中重要的调节分子,在抑制肿瘤细胞生长及免疫调节方面发挥着重要的作用。IFN-γ可增强抗原提呈细胞与T淋巴细胞的相互作用,进而增强T淋巴细胞辅助抗体产生。IFN-γ水平的高低是机体细胞免疫的重要标志。由此可见,白术内酯III通过促进脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,能够增强机体的免疫功能。
本实验例通过检测白术内酯III作用后脾脏淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-12、IFN-γ的含量,发现经白术内酯III作用后,小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-γ的能力显著增强,进一步证实白术内酯III能提高机体的免疫功能。可见,适宜剂量的白术内酯III有利于提高机体免疫能力,白术内酯III在制备免疫缺陷相关疾病的药物和保健品的应用中,具有实际应用价值。
本发明对已知化合物白术内酯III发掘了新的医疗用途,开拓了白术内酯III在增强免疫功能、治疗免疫缺陷疾病的药物或保健品中的新的应用领域。白术内酯III通过促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,来激活脾脏淋巴细胞的免疫功能,可见白术内酯III在制备增强淋巴细胞免疫功能药物中的应用中,具有潜在价值。白术内酯III能够通过促进免疫相关分子IL-2、IL-12和IFN-γ的分泌,来增强机体的免疫能力,可见白术内酯III在制备促进免疫相关分子的分泌、治疗免疫缺陷疾病的药物或保健品中,具有实际应用价值。此外,白术内酯III的制备工艺简单,原料来源丰富,且可采用现代制药工艺做成口服剂型、注射剂型、片剂、胶囊剂、颗粒剂等,使用方便,疗效好,应用价值广泛。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.白术内酯III在制备增强免疫功能的药物中的应用。
2.白术内酯III在制备增强淋巴细胞免疫功能的药物中的应用。
3.白术内酯III在制备增强脾脏淋巴细胞免疫功能的药物中的应用。
4.白术内酯III在制备治疗免疫缺陷疾病的药物中的应用。
5.白术内酯III在制备促进淋巴细胞增殖的药物中的应用。
6.白术内酯III在制备促进脾脏淋巴细胞增殖的药物中的应用。
7.白术内酯III在制备促进免疫相关分子的分泌的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述免疫相关分子包括白细胞介素-2和白细胞介素-12。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述免疫相关分子包括γ-干扰素。
10.白术内酯III在制备增强免疫功能保健品中的应用。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN105919994B (zh) | 2018-11-23 |
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