CN105906721A - 一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白、基因工程亚单位疫苗及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域,具体提供一种水痘‑带状疱疹病毒gB‑gE‑gH‑gL融合蛋白、基因工程亚单位疫苗及制备方法。该融合蛋白包括VZV gB胞外区、gE胞外区、gH截短片段和gL截短片段,其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明利用原核表达载体构建了能够表达VZV gB‑gE‑gH‑gL融合蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,将该融合蛋白纯化与可药用佐剂混合制成基因工程亚单位疫苗,与目前使用的VZV减毒活疫苗相比,该疫苗不仅能够诱导免疫小鼠产生更强的特异性体液免疫和细胞免疫,在豚鼠中也可以预防VZV经血流播散至背根神经节和肠道神经节的潜伏感染,有效地提高了VZV疫苗的安全性,因而是具有潜在临床应用价值的备选疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,特别是涉及到研究水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白、基因工程亚单位疫苗及制备方法。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)属疱疹病毒α亚科,为双链DNA病毒。VZV引起的水痘传染性极强,我国青少年血清中抗体的阳性率达到85%以上。成人若发生水痘则常常出现严重的内脏感染甚至全身感染。原发感染中病毒通过血液或皮肤-神经逆行途径进入神经元中建立潜伏感染,日后潜伏病毒的再激活可导致带状疱疹,据估计有1/3的成年人会至少发生一次带状疱疹,他们有可能出现非常痛苦的长期慢性疼痛。
由日本研发的VZV减毒活疫苗(vOka株)是目前预防水痘和带状疱疹有效而安全的方法,该疫苗目前已在欧洲、北美、以及包括我国在内的亚洲国家普遍应用。但是近来的研究发现该疫苗存在一些不足之处:1.VZV活疫苗的保护率不到80%,而且有少数疫苗接种者在密切接触水痘患者或VZV野毒株后,仍可能发生感染,称为“突破感染”。2.活疫苗病毒与野毒株一样可以在接种者体内的神经节中建立潜伏感染,导致病毒再激活感染的可能性增加。3.已经发现疫苗株与野毒株可以在体内发生基因重组形成新病毒引发感染。4.减毒活疫苗在免疫缺陷者中可能导致危险的全身感染。因此,研发保护效果更好、副作用更低的新一代VZV疫苗成为进一步降低水痘-带状疱疹病毒感染相关疾病发病率最有效的策略之一。
人们早已认识到,给予新近暴露于VZV的个体含高效价VZV抗体的免疫血清,可以有效地预防发病。这些免疫血清中针对病毒表面多种糖蛋白的抗体能够干扰VZV入侵细胞,以及病毒在体内细胞-细胞之间的扩散。因此用一种或几种这样的病毒糖蛋白制备的亚单位疫苗有可能取代减毒活疫苗。VZV基因组为约125kb的线性双链DNA分子,包含一个约100kb的独特长片段(UL)和约5.4kb的独特短片段(US),它们的两端连接着6.8kb的末端和内部重复序列。病毒基因组共含有70多个开放读码框,除了编码与病毒复制、转录、包装、释放等生物活性相关的蛋白分子以及与宿主细胞相互作用的蛋白以外,还编码gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL和gM共8种糖蛋白,这些糖蛋白在病毒的成熟与包装方面发挥着极为重要的作用。其中gE是病毒本身以及病毒感染的细胞中含量最高的糖蛋白,以AS01B为佐剂的gE亚单位疫苗在1/2期临床试验中已经显示了有效的免疫效果。gB与gE一样是激发机体CD4和CD8T淋巴细胞的主要抗原,因此也被认为是亚单位疫苗的候选者之一。在处于感染后恢复期的水痘和带状疱疹患者的血清中,除了含有大量的gE抗体以外,还存在针对病毒糖蛋白gB、以及gH、gL二聚体的中和性抗体。近年的研究表明gB、gH/gL二聚体是VZV入侵细胞所必需。gH和gL在细胞内分别合成以后,一起发生折叠形成一个密切的二聚体结构。在病毒导致的受染细胞胞膜的融合过程中,gB与gH/gL二聚体的融合,而这个融合可以被gB或gH/gL二聚体的抗体所抑制。针对gH/gL的中和抗体可以有效地防止病毒在细胞与细胞之间的扩散。gH共有795个氨基酸,分为H1A/B-H2-H3几个区域,gL只有160个氨基酸。蛋白结晶结构分析表明,gH/gL二聚体的抗原表位由gH的A环、B环以及gL的第三个螺旋Lα3构成,其中位于A环内的D288/W291、F292为关键。
在本专利中我们利用基因重组技术,将VZVgB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位、gL蛋白的氨基酸第23-160位通过柔性Linker连接,构建了VZVgB-gE-gH-gL融合基因,插入原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化得到了VZV gE-gB-gH-gL融合蛋白。以此作为抗原制备的VZV亚单位疫苗在小鼠体内可以产生特异性免疫应答,在我们建立的VZV感染豚鼠模型中显示可以产生保护作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种水痘-带状疱疹病毒基因工程亚单位疫苗,其主要是由一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白作为抗原制备而成。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,所述融合蛋白为按水痘-带状疱疹病毒gB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位和gL蛋白的氨基酸第23-160位的顺序重组构建而得。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,所述融合蛋白的基因编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制备方法,包括以下步骤:
(1)将水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合基因连接入表达载体中,构建成表达重组质粒;
(2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌,构建能表达水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的重组基因工程菌;
(3)用该重组基因工程菌表达出水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,对其进行纯化。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制备方法,步骤(1)所述表达载体为pET30a(+)。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制备方法,步骤(2)所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亚单位疫苗,所述疫苗的抗原为前述的水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白。
本发明所述的水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亚单位疫苗的制备方法,将纯化后的水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白与可药用佐剂混合制成疫苗。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亚单位疫苗的制备方法,所述可药用佐剂为铝盐类佐剂、弗式完全佐剂、蜂胶佐剂、油水乳剂、细胞因子、CpG DNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物、脂质体中的至少一种。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白基因工程亚单位疫苗的制备方法,所述铝盐类佐剂为氢氧化铝。
本发明的有益效果在于:
本发明利用pET30a(+)表达性载体构建了能表达水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析,表达出了64kDa重组目的蛋白,纯化后融合蛋白经HPLC检测纯度达到95%以上。将重组蛋白纯化后与氢氧化铝佐剂混合制备成基因工程亚单位疫苗,免疫6周龄BALB/c小鼠,免疫小鼠血清中和抗体滴度在免疫后3、5、7周分别为1:316,1:315和1:299,可见以重组gB-gE-gH-gL融合蛋白为抗原的免疫小鼠可以产生更高滴度的中和抗体。以重组gB-gE-gH-gL融合蛋白为抗原的免疫小鼠淋巴细胞刺激指数在免疫后3、5、7周分别为3.9,3.9和4.1,比单纯的gE蛋白抗原能诱导更强的细胞免疫力。免疫后第7周对小鼠淋巴细胞在体外经灭活VZV刺激后,重组gB-gE-gH-gL融合蛋白组为276pg/mL,高于对照组(41.3pg/mL);而IL-4的浓度免疫组与对照组相比呈现2倍左右的提高,这些表明接种本亚单位疫苗可能形成较强的Th1型细胞免疫记忆。将该疫苗免疫豚鼠,30日后再从静脉输入体外感染VZV的豚鼠单个核细胞(PBMC),可以保护豚鼠不受VZV感染。
附图说明
图1为水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白模拟空间构象图;
图2为接种本发明中的疫苗后小鼠血清中和抗体滴度检测结果;
图3为接种本发明中的疫苗后小鼠淋巴细胞增殖效应检测结果;
图4为接种本发明中的疫苗后小鼠淋巴细胞接受特异性抗原刺激分泌IFN-γ和IL-4水平检测结果。
具体实施方式
为更好理解本发明,下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述,以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。
申请人在从水痘患者皮肤水疱液中分离获得水痘-带状疱疹病毒,通过PCR扩增出gB、gE、gH、gL基因片段,再通过嵌套PCR将gB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位和gL蛋白的氨基酸第23-160位通过柔性Linker连接并插入pET30a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),构建重组基因工程菌,通过对工程菌的诱导、超声破碎、蛋白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产方法制备出了VZV基因工程重组亚单位疫苗。
实施例1 gB-gE-gH-gL融合蛋白的制备
步骤一gB-gE-gH-gL融合蛋白的原核表达
将从水痘患者皮肤水疱中采集的水疱液接种至MRC-5细胞上,进行VZV病毒的分离培养,等到细胞出现病变后,收集细胞,通过酚:氯仿:异戊醇法提取DNA,作为PCR扩增的模板;
根据Genebank中VZV Dumas(X04370.1)株的序列分别设计VZV gB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位、gL蛋白的氨基酸第23-160位的嵌套式PCR引物,每两个蛋白之间用GGGGS连接,在最终gB-gE-gH-gL融合基因两端保留NdeI和NocI酶切位点;
通过T4DNA连接酶将gB-gE-gH-gL融合基因通过NdeI和NocI酶切位点插入pET30a(+)载体(或pQE30载体),将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(或M15宿主菌),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测显示在64kDa处出现蛋白表达。
步骤二gB-gE-gH-gL融合蛋白的纯化
融合蛋白以不可溶的包涵体形式表达,诱导表达后的菌体经超声破碎后离心得到包涵体,包涵体使用8M尿素溶解,随后使用GE公司的Ni-HTA进行亲和层析复性纯化,纯化后融合蛋白经HPLC检测纯度达到95%以上,其模拟空间构象如图1所示。
实施例2亚单位疫苗的免疫效果检测
将纯化后的gB-gE-gH-gL融合蛋白用BCA法检测蛋白浓度,用PBS稀释至0.5mg/mL,无菌过滤,备用;按现行《中国药典》进行无菌检验,用鲎试剂方法进行内毒素检测,内毒素含量不高于100EU/mL方可使用;
将gB-gE-gH-gL融合蛋白与等体积的氢氧化铝佐剂或弗氏完全佐剂1:1混合,充分乳化,对6周龄BALB/c小鼠进行腹腔免疫接种,25μg/只小鼠;初次免疫2周后,加强免疫一次,剂量同第一次;同时接种相同剂量的重组VZV gE蛋白和PBS作为对照。
在接种后第3、5、7周各处死3只小鼠,通过空斑形成抑制实验检测小鼠血清中和抗体效价,通过脾淋巴细胞增殖实验和检测抗原刺激后脾淋巴细胞分泌INF-γ和IL-4的情况评价特异性细胞免疫力。
步骤一、空斑形成抑制实验检测小鼠血清中和抗体效价
收集小鼠血清,于56℃灭活30min,按1:50稀释后作为原液,再按1:2,1:4…倍比稀释至1:128,取200μL稀释后血清与200μL滴度为5000PFU/mL的VZV病毒混合,37℃孵育1小时。然后将混合液接种至长满单层MRC-5细胞的24孔板中,于37℃,5%CO2的温箱中培养48~72小时。以空白对照(含非免疫小鼠的血清)中空斑的数量来计算病毒的滴度,以能抑制50%病毒病变的免疫血清稀释度作为中和抗体效价(NT50)。结果如图2所示,以重组gE蛋白为抗原的免疫小鼠血清中和抗体滴度在免疫后3、5、7周分别为1:101,1:119和1:92;而以重组gB-gE-gH-gL融合蛋白为抗原的免疫小鼠血清中和抗体滴度在免疫后3、5、7周分别为1:316,1:315和1:299;可见以重组gB-gE-gH-gL融合蛋白为抗原的免疫小鼠可以产生更高滴度的中和抗体。
步骤二、细胞免疫力检测
免疫后第3、5、7周分别处死3只小鼠,无菌分离脾淋巴细胞,将细胞总浓度调整为5×106/mL。每孔100μL细胞悬液,加入96孔板,每只小鼠8孔,其中4孔加入1×104PFU灭活VZV作为试验组,4孔加入培养基作为阴性对照组,置于37℃,5%CO2培养箱中培养48h。对第7周的小鼠每孔分别取100μL培养上清液进行IFN-γ和IL-4含量测定。同时每孔加入20μL MTT(5mg/mL)以后继续培养4h。弃去培养上清,每孔加入100μL DMSO,使结晶溶解以后读取OD570值。试验组OD570值与对照组OD570值之间的比值即为刺激指数(SI),刺激指数越大表示淋巴细胞增殖能力越强。结果如图3所示,以重组gE蛋白为抗原的免疫小鼠淋巴细胞刺激指数在免疫后3、5、7周分别为2.4,2.5和2.4;而以重组gB-gE-gH-gL融合蛋白为抗原的免疫小鼠淋巴细胞刺激指数在免疫后3、5、7周分别为3.9,3.9和4.1,因此以重组gB-gE-gH-gL融合蛋白为抗原的免疫小鼠比单纯的gE蛋白抗原能诱导更强的细胞免疫力。免疫后第7周对小鼠淋巴细胞在体外经灭活VZV刺激后,如图4所示,细胞培养上清中重组gE蛋白组IFN-γ平均含量为123.7pg/mL,重组gB-gE-gH-gL融合蛋白组为276pg/mL,均高于对照组(41.3pg/mL);而IL-4的浓度免疫组与对照组相比呈现2倍左右的提高,不同抗原免疫组之间没有显著性差异。这些表明接种本亚单位疫苗可能形成较强的Th1型细胞免疫记忆。
实施例3攻毒保护试验
在体外培养出可以适应豚鼠细胞的VZV毒株,再用该毒株体外感染豚鼠外周血淋巴细胞,然后将感染了VZV的豚鼠淋巴细胞回输至豚鼠,28天后可在豚鼠的肠道神经节和背根神经节中建立潜伏感染。利用该模型进行攻毒保护试验,将8周龄雌性Hartley豚鼠12只分成两组,每组6只,第一组为免疫组,用本发明制备的VZV基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫14天后进行第二次免疫,每次每只100μg,皮下注射),第二组为生理盐水对照组,注射同等体积的无菌生理盐水。第二次免疫28天后制备感染VZV的豚鼠PBMC,步骤如下:在6孔板中加入MRC-5细胞培养至细胞长满单层,加入5×105PFU VZV继续培养24h,向其中加入3×106个豚鼠PBMC,室温200×g离心45min,将6孔板置于33℃,5%CO2培养箱中继续培养20小时,轻轻吹起PBMC,室温420×g离心5min,弃上清,用新鲜的生理盐水重悬细胞,调整细胞浓度至3×106/50μL,将50μL感染了VZV的豚鼠PBMC经眼静脉窦回输至豚鼠血液循环,28天后处死豚鼠,从肠组织和脊柱分别分离肠道神经节和背根神经节,提取DNA,通过巢式PCR检测VZV ORF29和ORF40基因,只要其中一个基因检测为阳性即认为存在VZV感染,均为阴性即认为无VZV感染。结果如表1所示,接种疫苗后豚鼠神经节中检测不出VZV DNA,而未接种疫苗的豚鼠均能检测到VZV DNA,表明疫苗具有较好的保护作用。
表1 VZV基因工程亚单位疫苗免疫后攻毒保护试验结果
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白为按水痘-带状疱疹病毒gB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位和gL蛋白的氨基酸第23-160位的顺序重组构建而得。
2.根据权利要求1所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白的基因编码核苷酸序列如SEQ ID
NO:2所示。
4.一种权利要求3所述的水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合基因连接入表达载体中,构建成表达重组质粒;
(2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌,构建能表达水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的重组基因工程菌;
(3)用该重组基因工程菌表达出水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白,对其进行纯化。
5.根据权利要求4所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述表达载体为pET30a(+)。
6.根据权利要求4所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亚单位疫苗,其特征在于:所述疫苗的抗原为权利要求3所述的水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白。
8.一种权利要求7所述的水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亚单位疫苗的制备方法,其特征在于:将纯化后的水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白与可药用佐剂混合制成疫苗。
9.根据权利要求8所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亚单位疫苗的制备方法,其特征在于:所述可药用佐剂为铝盐类佐剂、弗氏完全佐剂、蜂胶佐剂、油水乳剂、细胞因子、CpG DNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物、脂质体中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的一种水痘-带状疱疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白基因工程亚单位疫苗的制备方法,其特征在于:所述铝盐类佐剂为氢氧化铝。
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