CN105899525A - 光交联的形成抑制方法、及自交联体形成抑制型光响应性核酸 - Google Patents
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Abstract
通过将能够与具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的、嘧啶环的5位取代成R基(其中,R为‑CN、或‑CO‑R1,其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基),从而能够抑制具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基与能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间的光交联的形成,由此提供一种防止光响应性核酸探针失活的手段。
Description
技术领域
本发明涉及抑制具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基与能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间形成光交联的方法、以及自交联体形成抑制型光响应性核酸。
背景技术
分子生物学领域的基本技术包括核酸双链形成和检测,这不仅是基础研究,而且已经广泛用于医疗领域、工业领域、农业领域等。作为对于核酸双链形成和检测特别有用的技术,有使用了光响应性核酸的光交联技术。该光交联技术已经有多种应用,例如从反义核酸等核酸药品、SNPs的检测等医疗领域扩展到使用了核酸的DNA纳米技术领域。该使用光响应性核酸的光交联技术是本发明人的研究组开拓的领域,已经开发了多种光响应性人工核苷酸并提出了专利申请(专利文献1)。
作为该光交联技术的特别优选的应用,有高灵敏度的选择性核酸扩增方法(光钳夹法)(专利文献2)。该方法在用PCR进行核酸扩增前使用光响应性核酸作为钳夹探针,与被检物中为数众多的野生型(或正常型)的碱基序列的核酸进行光连结,形成不能解离的双链,从而对为数众多的野生型(或正常型)的碱基序列的核酸进行抑制使其无法用PCR扩增,结果能够高灵敏度、选择性地对被检物中的作为目标的数量较少的变异型碱基序列的核酸进行扩增。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2009/066447号
专利文献2:国际公开第2012/033190号
发明内容
发明要解决的问题
本发明人的研究组发现了如下问题:在上述光钳夹法中,原本应作为钳夹探针起作用的光响应性核酸的一部分失去功能、即所谓的失活,钳夹形成效率有时会变差。从光响应性核酸的高光反应效率来看,这种现象本来是不可能出现的。这样的光响应性核酸探针失活不仅仅引起光钳夹法的效率降低的问题,在光响应性核酸探针的全部应用中都可能成为问题。
因此,本发明的目的在于,提供一种防止光响应性核酸探针失活的手段。
用于解决问题的方案
本发明人进行了深入研究,结果获知:上述的光钳夹法中的光响应性核酸探针失活的原因在于,在光响应性核酸探针具有可在自身的碱基序列内部分地形成双链那样的碱基序列时,以在自身的碱基序列内形成了双链的状态进行光交联,即,光响应性核酸探针形成自交联体,从而丧失了原本希望的、与互补链形成双链而进行光交联的能力。
作为基于该见解的失活抑制手段,例如有如下手段:预先避免采用在自身的碱基序列内形成双链那样的碱基序列。但是,这样的手段会限制光响应性核酸探针的应用范围,在欲使用充分长的碱基序列时是一种特别苛刻的制约。
因此,本发明人为了避免这样的光响应性核酸探针的碱基序列的制约进行了进一步研究,结果发现:作为光响应核酸探针的光响应性核酸的光连结对象的碱基即胸腺嘧啶(T),即使在能够与互补链形成双链的范围内接受各种修饰,也可维持与光响应性核酸的光交联的形成能力,然而在制成为胸腺嘧啶的5位取代成吸电子性的氰基的5-氰基-2’-脱氧尿苷(CNT)时,与互补链形成双链不受影响,与光响应性核酸形成光交联的速度变得极小,从而完成了本发明。即,若导入将胸腺嘧啶的5位取代成吸电子性的氰基的5-氰基-2’-脱氧尿苷(CNT),则能够抑制光响应性核酸探针的失活。
此外,根据该见解,不仅抑制了光响应性核酸探针形成自交联体所致的失活,还防止了如下情况,因此能够广泛加以利用,所述情况为:在其附近具有与光响应性碱基附近的碱基序列互补的碱基序列的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基形成了不希望的光交联,结果导致无法形成所希望的光交联;或浪费光响应性核酸,而使目的反应的效率、收率降低。
因此,本发明涉及以下的(1)~(9)。
(1)一种抑制光交联的形成的方法,通过将能够与具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的、嘧啶环的5位取代成R基(其中,R为-CN、或-CO-R1,其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基),来抑制具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基与能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间的光交联的形成。
(2)根据(1)所述的方法,其中,光交联的形成是如下反应:
位于光响应性核酸的碱基序列中的具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基、与位于部分互补性核酸中的该互补性部分碱基序列中的能够与光响应性碱基进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间形成光交联的反应,其中,所述部分互补性核酸是具有与该光响应性核酸的碱基序列中的包含光响应性碱基的4个碱基长以上的部分碱基序列(光响应性部分碱基序列)互补的部分碱基序列(互补性部分碱基序列)的核酸,
所述方法通过使用部分互补性核酸来抑制光响应性核酸与部分互补性核酸之间的光交联的形成,部分互补性核酸中通过形成磷酸二酯键而导入下式(I)所示的修饰核苷酸来代替互补性部分碱基序列中的能够进行光交联的T或U的核苷酸中的至少1个以上,
(其中,式I中,
R为-CN、或-CO-R1,
其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基,
X表示在式I中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基。
(3)根据(1)~(2)中任一项所述的方法,其中,光响应性核酸将光响应性部分碱基序列和互补性部分碱基序列作为同一分子中不同的序列区域而含有,光响应性核酸的分子和部分互补性核酸的分子是同一分子,
抑制光响应性核酸与部分互补性核酸之间的光交联的形成的方法是如下方法:抑制通过光响应性碱基与能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间的光交联而形成光响应性核酸的自交联体的方法。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的方法,其中,式(I)中的R为-CN。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的方法,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基为具有3-乙烯基咔唑结构的光响应性碱基。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的方法,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基作为下式(II)所示的修饰核苷酸的碱基部分,通过上述修饰核苷酸的磷酸二酯键而被导入至光响应性部分碱基序列中,
(其中,式II中,Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
R2及R3各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
X表示在式II中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基)。
(7)根据(1)~(5)中任一项所述的方法,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基作为下式(III)所示的修饰核苷酸的碱基部分,通过上述修饰核苷酸的磷酸二酯键而被导入至光响应性部分碱基序列中,
(其中,式III中,
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基、或氢原子,
R2及R3各自独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢原子,
R4为氢原子、羟基、C1~C3的烷氧基、C1~C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6~C12的单环式或二环式的芳香族化合物的1价基团、C6~C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的1价基团、或下式所示的1价基团,
(其中,上述式中,Ra、R2及R3独立于式III中记载的Ra、R2及R3,表示选自作为式III中记载的Ra、R2及R3列举的基团中的基团)
R6表示氢原子、甲基、或乙基,
Q1表示在式III中与键合在Q1上的O成为一体而形成的磷酸基,
Q2表示氢原子)。
(8)根据(7)所述的方法,其中,式III中,下式(IIIa):
所示的骨架结构为下式:
所示的D-苏氨醇结构、
下式:
所示的L-苏氨醇结构、或下式:
所示的丝氨醇结构。
(9)根据(1)~(8)中任一项所述的方法,其中,部分互补性核酸的碱基序列中的全部T或U的核苷酸被式(I)所示的修饰核苷酸置换。
进而,本发明还包括以下的(11)~(18)。
(11)一种自交联体形成抑制型光响应性核酸,其含有:具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基、和代替能够进行光交联的T或U的核苷酸中的至少1个以上的、下式(I)所示的修饰核苷酸,
(其中,式I中,
R为-CN、或-CO-R1,
其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基,
X表示在式I中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基)。
(12)根据(11)所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,式(I)中的R为-CN。
(13)根据(11)~(12)中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基为具有3-乙烯基咔唑结构的光响应性碱基。
(14)根据(11)~(13)中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基作为下式(II)所示的修饰核苷酸的碱基部分,通过上述修饰核苷酸的磷酸二酯键而被导入至光响应性部分碱基序列中,
(其中,式II中,Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
R2及R3各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
X表示在式II中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基)。
(15)根据(11)~(13)中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基作为下式(III)所示的修饰核苷酸的碱基部分,通过上述修饰核苷酸的磷酸二酯键而被导入至光响应性部分碱基序列中,
(其中,式III中,
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基、或氢原子,
R2及R3各自独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢原子,
R4为氢原子、羟基、C1~C3的烷氧基、C1~C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6~C12的单环式或二环式的芳香族化合物的1价基团、C6~C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的1价基团、或下式所示的1价基团,
(其中,上述式中,Ra、R2及R3独立于式III中记载的Ra、R2及R3,表示选自作为式III中记载的Ra、R2及R3列举的基团中的基团)
R6表示氢原子、甲基、或乙基,
Q1表示在式III中与键合在Q1上的O成为一体而形成的磷酸基,
Q2表示氢原子)。
(16)根据(15)所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,式III中,下式(IIIa):
所示的骨架结构为下式:
所示的D-苏氨醇结构、下式:
所示的L-苏氨醇结构、或下式:
所示的丝氨醇结构。
(17)根据(11)~(16)中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,自交联体形成抑制型光响应性核酸具有与光响应性部分碱基序列互补的部分碱基序列、即互补性部分碱基序列,所述光响应性部分碱基序列为包含光响应性碱基的4个碱基长以上的部分碱基序列,
能够进行光交联的T或U为位于该互补性部分碱基序列中的T或U。
(18)根据(11)~(17)中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,自交联体形成抑制型光响应性核酸的碱基序列中的全部T或U的核苷酸被式(I)所示的修饰核苷酸置换。
发明的效果
根据本发明,能够抑制光钳夹法等中使用的光响应性核酸探针的自交联体的形成而防止探针的失活。从而,光响应性核酸探针不再受到可选择的碱基序列、碱基序列长度的特别的制约而能够提高反应效率(收率)。进而,根据本发明,能够抑制以下情况:在其附近具有与光响应性碱基附近的碱基序列互补的碱基序列的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基形成不希望的光交联、结果导致不能形成希望的光交联、或光响应性核酸被浪费、目标反应的效率、收率降低,从而能够进一步拓宽光响应性核酸的应用范围。
附图说明
图1是示出对T和CNT的光反应性进行比较的变性PAGE结果的图。
图2是示出延长了光照时间的样品的变性PAGE分析结果的图。
图3是示出CNT与T的光反应性的差异的HPLC谱图及曲线图。
图4是示出含CNVK探针的光交联实验的光反应路线及其结果的图。
图5是示出利用CNT进行的含CNVK探针的失活抑制实验的结果的图。
图6是示出含CNVD探针的光交联实验的光反应路线的图。
图7是示出含CNVD探针的光交联实验的结果的图。
具体实施方式
以下列举具体实施方式对本发明进行详细说明。本发明不受以下列举的具体实施方式限定。
[光交联的形成]
具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基与属于嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、及胞嘧啶以高选择性形成光交联(专利文献1)。该光交联的形成反应为光反应,因此极快速、效率高,此外溶剂条件、温度条件可以包含生理性条件、在较宽范围内选择期望的条件。特别是,具有3-乙烯基咔唑结构的光响应性碱基通过[2+2]光环化反应与嘧啶碱基高效地进行光反应,形成光交联。
但是,这样的光交联的形成即使在嘧啶碱基进行了修饰时也会在短时间内高效地进行,因此迄今为止未能通过对嘧啶碱基进行修饰来实现维持形成碱基对所必需的互补性且抑制光交联的形成。例如,在嘧啶碱基变成甲基胞嘧啶、假尿嘧啶时该光交联的形成仍然进行。
[光交联的形成的抑制]
但是,根据本发明,对于能够与具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基,通过将嘧啶环的5位取代成R基(其中,R为-CN或-CO-R1,其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的、C1~C12的烃基),从而取代后的修饰碱基能够被维持在不损害用于形成碱基对所必须的互补性的状态下抑制光交联的形成。该光交联的形成的抑制是极其显著的,即使在使利用胸腺嘧啶(T)的光交联的形成反应以超过90%的效率达成的条件(光照时间)下,也可将光交联的形成反应抑制在1%左右(参照实施例)。
[用于光交联的形成的双链形成]
光响应性碱基与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间的光交联是如下形成的,即,在光照之前,包含光响应性碱基的碱基序列与包含胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的碱基序列基于其互补性形成双链,配置为可进行光交联反应的形态,在该状态下接受光照,从而光反应顺利进行,从而形成所述光交联。因此,在优选实施方式中,包含胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的部分碱基序列,与包含光响应性碱基的光响应性核酸的碱基序列中的包含光响应性碱基的部分碱基序列(光响应性部分碱基序列)是互补的碱基序列(互补性部分碱基序列)。在优选的实施方式中,光响应性部分碱基序列与互补性部分碱基序列是指以能够形成双链区域的程度而稳定化的序列,例如,至少具有4个碱基长、优选5个碱基长、进而优选6个碱基长、进而优选7个碱基长、进而优选8个碱基长的长度。
[光交联的形成抑制性修饰碱基及修饰核苷酸]
代替能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基而导入从而抑制光交联的形成的修饰碱基(光交联的形成抑制性修饰碱基),是嘧啶环的5位取代成R基(其中,R为-CN或-CO-R1,其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的、C1~C12的烃基)的修饰碱基,具有该修饰碱基作为碱基部分的修饰核苷酸(光交联的形成抑制性修饰核苷酸)为下式(I)所示的修饰核苷酸。
式I中,R为-CN、或-CO-R1,优选-CN(氰基)。R1只要是使R成为吸电子性基团的R1就可以使用,例如为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基。作为这样的基团,可以列举例如C1~C3的烷基、环己基、苯基、苄基、甲苯基、萘基。
式I中,X表示在式I中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,Y表示羟基,Z表示氢或羟基。
[光交联的形成抑制性修饰碱基及修饰核苷酸的合成]
上述的光交联的形成抑制性修饰碱基及修饰核苷酸可以通过公知的手段来合成,可以如下制造:在合成其阿米迪特(amidite)体后,通过使用DNA合成仪等之类的公知手段,制造导入了这些物质来代替能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的核酸(修饰核酸)。此外,根据期望,可以在暂时制造含有胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基、或其它修饰碱基的核酸(修饰核酸)后,对其进行修饰反应而使其转变为光交联的形成抑制性修饰碱基,从而能够制造导入了光交联的形成抑制性修饰碱基来代替能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的核酸(修饰核酸)。
[具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基]
具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基优选为具有3-乙烯基咔唑结构的光响应性碱基,进而优选下式(II)所示的修饰核苷酸的碱基部分。
式II中,Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
R2及R3各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
X表示在式II中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基。
在优选的实施方式中,式II的Ra为氰基、酰胺基、羧基、烷氧基羰基或氢,优选氰基、酰胺基、羧基、烷氧基羰基或氢,进而优选氰基、酰胺基、羧基或烷氧基羰基。烷氧基羰基可以优选使用C2~C7的烷氧基羰基、进而优选C2~C6的烷氧基羰基、进而优选C2~C5的烷氧基羰基、进而优选C2~C4的烷氧基羰基、进而优选C2~C3的烷氧基羰基、特别优选C2的烷氧基羰基。
在优选的实施方式中,式II的R2及R3各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、烷氧基羰基或氢,优选氰基、酰胺基、羧基、烷氧基羰基或氢,进而优选氰基、酰胺基、羧基或烷氧基羰基。烷氧基羰基可以优选使用C2~C7的烷氧基羰基、进而优选C2~C6的烷氧基羰基、进而优选C2~C5的烷氧基羰基、进而优选C2~C4的烷氧基羰基、进而优选C2~C3的烷氧基羰基、特别优选C2的烷氧基羰基。
在本发明优选的实施方式中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基为下式(III)所示的修饰核苷酸的碱基部分。
式III中,
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基、或氢原子,
R2及R3各自独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢原子,
R4表示氢原子、羟基、C1~C3的烷氧基、C1~C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6~C12的单环式或二环式的芳香族化合物的1价基团、C6~C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的1价基团、或下式所示的1价基团:
(其中,上述式中,Ra、R2及R3独立于式III中记载的Ra、R2及R3,表示选自作为式III中记载的Ra、R2及R3列举的基团中的基团),
R6表示氢原子、甲基、或乙基,
Q1表示在式III中与键合在Q1上的O成为一体而形成的磷酸基,
Q2表示氢原子。
式III中的Ra、R2及R3可以各自独立地为式II中记载的Ra、R2及R3。
例如,作为式III的R4,可以使用下面列举的基团。(其中,波浪线表示游离化合价的位置。)
在优选的实施方式中,式III中,下式(IIIa):
所示的骨架结构为下式:
所示的D-苏氨醇结构、下式:
所示的L-苏氨醇结构、或下式:
所示的丝氨醇结构。
上述式III所示的修饰核苷酸若为天然的核苷酸、式II的修饰核苷酸,则作为核糖(或脱氧核糖)结构的糖骨架的部分成为用上述式IIIa所示的骨架结构代替的结构。因此,式III所示的修饰核苷酸也可以称为光响应性人工核苷酸类似物。令人惊讶的是,式III的修饰核苷酸即使存在这样的骨架结构差异,在引入核酸时,在光响应性方面也作为光响应性碱基起作用。本发明人已经基于该发现提出了日本专利申请(日本特愿2013-70381)。
[自交联体形成的抑制]
在光响应性碱基与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基包含于不同的核酸分子而形成不同的核酸分子间的光交联时,本发明的光交联的形成抑制当然也是有用的;在光响应性碱基与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基包含于同一核酸分子而形成核酸分子内的自交联时尤其有用。可以认为,例如,光钳夹法中使用的光响应性核酸探针根据其核酸分子内的碱基序列,会在核酸分子内部分地形成双链,在该部分地形成的双链区域内,若光响应性碱基和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基位于能够进行光交联的位置时,光响应性核酸探针会在自身分子内部形成自交联而无法参与原本希望的光交联反应,结果导致探针的利用效率(收率)非常差。这种情况下,若可抑制光响应性核酸探针的自交联体的形成,则可防止探针的损失,利用效率(收率)变得良好。即,在优选的实施方式中,光响应性部分碱基序列与互补性部分碱基序列包含于同一核酸分子中,从而抑制自交联体的形成。
[全部胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的置换]
根据本发明,通过将核酸分子中的能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基中的至少1个以上置换为光交联的形成抑制性修饰碱基,从而对于该胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基能够实现光交联抑制。因此,只要置换了至少1个,就落入了本发明的范围内。
另一方面,用本发明的光交联的形成抑制性修饰碱基进行了置换的核酸与置换前的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的核酸相比,Tm值不变,在使双链形成能力维持不变方面是优异的。即,利用本发明的光交联的形成抑制性修饰碱基进行的置换不影响双链形成能力,无需将置换数设为最小,能够将对象核酸分子的全部胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基都用光交联的形成抑制性修饰碱基进行置换。在对全部胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基进行置换时,在完全无需对互补链结构进行研究、通过彻底置换彻底抑制全部不希望的光交联的形成方面是有利的。例如,在制造多种碱基序列的光响应性核酸探针时特别有利。
[光交联的形成抑制的反应条件]
根据本发明,能够在目前已知的光交联的形成条件下抑制光交联的形成。例如,为了进行光交联而照射的光通常包含350~380nm的范围、优选360~370nm的范围、进而优选366nm的波长的光,特别优选366nm的单波长的激光,能够在这些光照条件下抑制光交联的形成。
实施例
以下列举实施例对本发明进行详细说明。本发明不受以下例示的实施例限定。
[含CNVK的ODN的合成]
下式:
所示的核苷酸(CNVK)的阿米迪特体的合成按照以下的Scheme1(路线1)来进行。合成按照专利文献1(国际公开公报WO2009/066447号)公开的顺序来进行。
此外,同样合成了下式:
所示的核苷酸(CNT)的阿米迪特体。
将合成的光响应性人工核酸3-氰基乙烯基咔唑核苷酸(CNVK)的阿米迪特体、5-氰基-2’-脱氧尿苷(CNT)的阿米迪特体用乙腈调整为100mM,利用ABI3400合成ODN。合成的ODN序列如下述表1所示。合成后,使用28%氨水在55℃下进行8小时脱保护。然后,用HPLC进行纯化,通过质谱确认其为目标序列。
[表1]
表1 实验中使用的ODN
序列(5’-3’) | 碱基数 | |
ODN 1 | TGCACNVKACGT | 9 |
ODN 2 | ACGTGTGCA | 9 |
ODN 3 | ACGTGCNTGCA | 9 |
ODN 4 | GTACNVKAGAGTGTA | 13 |
ODN 5 | GCNTACNVKAGAGCNTGCNTA | 13 |
ODN 6 | AGAGTACACTCTATACTGAG | 20 |
[CNVK和CNT的光反应性的分析]
将20μM ODN1和20μM ODN2或20μM ODN3在缓冲液(100mM NaCl、50mM二甲胂酸钠)中在90℃加热5分钟,然后缓慢地退火到4℃。然后,用UV-LED照射机在4℃下进行366nm的UV照射,通过变性PAGE对光照所产生的光交联体进行确认、分析。其结果如图1所示。
图1是示出对T和CNT的光反应性进行比较的变性PAGE结果的图。图1中,各泳道分别表示的是:M:10DNA Ladder Maker、泳道1~5:靶碱基为T的情况、泳道6~10:靶碱基为CNT的情况。光照时间分别为0s(秒)、0.1s、0.5s、1s、2s。ODN1和ODN2:杂交而形成双链,靶碱基T和CNVK通过光照而形成光交联,在电泳中检测到交联体,其中,靶碱基是指位于与位于光响应性碱基CNVK的5’侧的相邻位置的碱基互补的位置的碱基。ODN1和ODN3也是进行杂交而形成双链的序列,作为位于与位于CNVK的5’侧的相邻位置的碱基互补的位置的碱基(靶碱基),为CNT。
ODN1与ODN2组合时,即,靶碱基为T时,在光照2秒的情况下,作为原料的9mer的条带几乎消失。另一方面,在ODN1与ODN3组合时,即,靶为CNT时,即使光照2秒,也未确认到交联体的条带。由该结果可知,CNVK的交联碱基为T和CNT时,反应性有大的差异。为了调查在CNT为交联碱基时是根本不进行交联反应、还是缓慢地进行反应,进一步对延长光照时间的样品进行了变性PAGE分析。其结果如图2所示。
图2为示出延长光照时间的样品的变性PAGE分析结果的图。各泳道分别表示的是:M:10bp DNA Ladder Maker、及光照时间0秒、1秒、5秒、10秒、30秒、60秒、120秒、300秒。
如图2所示,在为ODN1与ODN3组合的情况下,通过极度延长光照时间,也能够隐约确认到光交联体样的条带。因此可知,将胸腺嘧啶的5位取代成氰基的CNT与胸腺嘧啶(T)相比,与CNVK的交联速度极其缓慢。
为了进行更定量的讨论,进行了HPLC分析并基于ODN3的减少量算出了光交联率。其结果如图3所示。
图3中,图3的(A)示出了ODN1和ODN3的交联反应的HPLC分析,关于光照时间0s(秒)、0.1s、0.5s、1s、2s、5s,分别示出以保留时间(分钟)为横轴的谱图。图3中,图3的(B)示出对ODN2(T)和ODN3(CNT)的光反应性进行比较的曲线图,横轴表示光照时间(秒)、纵轴表示光交联率(%)。图3的(B)中,上侧的近似曲线表示ODN2(T)、下侧的近似曲线表示ODN3(CNT)。
由HPLC的结果也可以获知,在以秒为单位的光照下,CNT与CNVK的光交联反应几乎不进行。由ODN3的由于光照而产生的减少量算出光交联率的结果是:在靶为T时1秒的光照时间下为90%以上,与此相对,在靶为CNT时1秒的光照下为1%左右。通过曲线拟合求出近似曲线,结果获知,在靶为CNT时,以靶为胸腺嘧啶时的约1/80的速度缓慢地进行光交联反应。
[含CNVK探针的失活的抑制]
我们也认为,CNVK由于其光响应能力高,因此将不是最稳定的结构而是暂时形成的双链状态交联。我们认为,特别是自交联结构的形成是使含CNVK探针失活的一个重要原因。从上述获得的CNT与CNVK的光响应性低的见解出发,进行了含CNVK探针的失活的抑制实验。
在一系列实验之前,首先,关于碱基序列,筛选出可形成自交联的序列,并决定使用ODN4的序列来进行实验。
将20μM探针ODN(ODN4或ODN5)和20μM ODN6在缓冲液(100mMNaCl、50mM二甲胂酸钠)中在90℃加热5分钟,然后缓慢地退火到25℃。泳道5、6中,在样品制作后在90℃下加热5分钟并立即转移到25℃进行骤冷。泳道7、8中,设为20μM探针ODN和4μM ODN6,将探针的量设为靶的5倍。对于这些样品,使用UV-LED照射机在25℃下进行10秒钟的366nm的UV照射。然后,通过变性PAGE进行分析。将这些操作的流程及结果示于图4。
图4是示出含CNVK探针的光交联实验的光反应路线和其结果的图。图4的(A)是示出基于光交联的含CNVK探针的光反应路线的说明图。图4的(B)是示出该实验的变性PAGE结果的图。图4的(B)中,各泳道中,泳道M为10bp DNA Ladder Maker、泳道1和2中为仅探针、泳道3和4中为探针和靶、泳道5和6中为对探针和靶进行了骤冷、泳道7和8为相对于靶加入了5倍量(5当量)的探针。泳道2、4、6、8中进行光照,泳道1、3、5、7中不进行光照。
此次使用的含CNVK探针,在光照后,在稍微低于原料条带的分子量的一侧出现了新的条带。基于无光照时不出现、在仅添加含CNVK探针(ODN4)时也出现、在变性条件下的电泳中与ODN4的条带分别出现等,我们认为这是含CNVK探针(ODN4)由于自身分子内发生光交联而生成的自交联体的条带。
进而,使用将ODN4中所含的T全部置换成CNT的探针进行了同样的实验。其结果如图5所示。
图5为示出利用CNT进行的含CNVK探针的失活的抑制实验结果的图。图5的(A)中使用了通常的探针,图5的(B)中使用了CNT置换探针。各泳道中,泳道M为10bp DNA Ladder Maker、泳道1和2为仅探针、泳道3和4为探针和靶、泳道5和6为对探针和靶进行骤冷、泳道7和8为相对于靶加入了5倍量(5当量)的探针。泳道2、4、6、8中进行光照,泳道1、3、5、7中不进行光照。
如上述结果所示,通过将含CNVK探针(ODN4)所含的T置换为CNT,从而没有确认到自交联体的条带。此外,还能够清晰地确认到交联体的条带。从而,通过将含CNVK探针中所含的T置换成CNT,能够不抑制与含CNVK探针的靶ODN6形成双链以及光交联反应,仅抑制含CNVK探针(ODN5)内的自交联,抑制探针的失活。
含CNVK探针进行自交联的碱基序列仅限于极少部分序列。但是,我们认为,在以生物体内存在的各种序列为靶时、使用长链探针时等情况下,不希望的自交联是一种可能发生的现象。从而,通过将含CNVK探针中所含的T置换成CNT,能够抑制这类不希望的自交联的形成。将T置换成CNT不会损害探针的双链形成能力和光交联反应性,因此能够将全部T置换成CNT。此外,通过利用例如模拟对可形成一定程度的自交联的结构进行预测,还能够仅将预测会参与自交联的形成的位置的T置换成CNT。通过利用上述见解,能够将含CNVK探针用于更广阔的应用中,能够用于更广阔的序列中。
[Tm值]
ODN1和ODN2的Tm值、以及ODN1和ODN3的Tm值未看到可测定程度的差异。即,即使将T置换成CNT,也能够维持双链形成能力。
[含CNVD的ODN的合成]
基于Scheme2(路线2)进行了下式所示的核苷酸类似物(CNVD)的合成。进而,合成了核苷酸类似物(CNVD)的阿米迪特体,使用该阿米迪特体与上述CNVK同样地合成了ODN,并用于与CNT的光反应性的分析。
[CNVD与CNT的光反应性的分析]
使用代替CNVK而含有CNVD的ODN,与利用CNVK进行的上述实验同样地,将其与CNT的光反应性和T进行对比、分析。图6为示出含CNVD探针的光交联实验的光反应路线的图。图7为示出含CNVD探针的光交联实验的结果的图。如图7的结果所示,与T靶时相比,通过使用CNT,能够将CNVD的光交联反应抑制为约15%(光照时间为1秒的时刻的比较)。
产业上的可利用性
根据本发明,能够抑制光钳夹法等中使用的光响应性核酸探针的自交联体的形成,能够防止探针的失活。本发明是在产业上有用的发明。
Claims (13)
1.一种抑制光交联的形成的方法,通过将能够与具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基的、嘧啶环的5位取代成R基,来抑制具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基与能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间的光交联的形成,
其中,R为-CN、或-CO-R1,其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,光交联的形成是如下反应:
位于光响应性核酸的碱基序列中的具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基、与位于部分互补性核酸中的该互补性部分碱基序列中的能够与光响应性碱基进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间形成光交联的反应,其中,所述部分互补性核酸是具有与该光响应性核酸的碱基序列中的包含光响应性碱基的4个碱基长以上的部分碱基序列(光响应性部分碱基序列)互补的部分碱基序列(互补性部分碱基序列)的核酸,
所述方法是通过使用部分互补性核酸来抑制光响应性核酸与部分互补性核酸之间的光交联的形成的方法,所述部分互补性核酸是通过形成磷酸二酯键而导入下式(I)所示的修饰核苷酸来代替互补性部分碱基序列中的能够进行光交联的T或U的核苷酸中的至少1个以上而形成的,
其中,式I中,
R为-CN、或-CO-R1,
其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基,
X表示在式I中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基。
3.根据权利要求1~2中任一项所述的方法,其中,光响应性核酸在同一分子中作为不同的序列区域而含有光响应性部分碱基序列和互补性部分碱基序列,光响应性核酸的分子和部分互补性核酸的分子是同一分子,
抑制光响应性核酸与部分互补性核酸之间的光交联的形成的方法是如下方法:抑制通过光响应性碱基与能够进行光交联的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基之间的光交联而形成光响应性核酸的自交联体的方法。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,式(I)中的R为-CN。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基为具有3-乙烯基咔唑结构的光响应性碱基。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基作为下式(II)或式(III)所示的修饰核苷酸的碱基部分,通过上述修饰核苷酸的磷酸二酯键而被导入至光响应性部分碱基序列中,
其中,式II中,Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
R2及R3各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
X表示在式II中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基;
其中,式III中,
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基、或氢原子,
R2及R3各自独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢原子,
R4表示氢原子、羟基、C1~C3的烷氧基、C1~C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6~C12的单环式或二环式的芳香族化合物的1价基团、C6~C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的1价基团、或下式所示的1价基团,
其中,上述式中,Ra、R2及R3独立于式III中记载的Ra、R2及R3,表示选自作为式III中记载的Ra、R2及R3列举的基团中的基团;
R6表示氢原子、甲基、或乙基,
Q1表示在式III中与键合在Q1上的O成为一体而形成的磷酸基,
Q2表示氢原子。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中,部分互补性核酸的碱基序列中的全部T或U的核苷酸被式(I)所示的修饰核苷酸置换。
8.一种自交联体形成抑制型光响应性核酸,其含有:
具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基、和
代替能够进行光交联的T或U的核苷酸中的至少1个以上的、下式(I)所示的修饰核苷酸,
其中,式I中,
R为-CN、或-CO-R1,
其中,R1为饱和或不饱和的、链状或分支的、环式或非环式的C1~C12的烃基,
X表示在式I中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基。
9.根据权利要求8所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,式(I)中的R为-CN。
10.根据权利要求8~9中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基为具有3-乙烯基咔唑结构的光响应性碱基。
11.根据权利要求8~10中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,具有光交联性的乙烯基结构的光响应性碱基作为下式(II)或式(III)所示的修饰核苷酸的碱基部分并通过上述修饰核苷酸的磷酸二酯键而被导入至光响应性部分碱基序列中,
其中,式II中,Ra为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
R2及R3各自独立地为氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢,
X表示在式II中与键合在X上的O成为一体而形成的磷酸基,
Y表示羟基,
Z为氢或羟基;
其中,式III中,
Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基、或氢原子,
R2及R3各自独立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2~C7的烷氧基羰基、或氢原子,
R4表示氢原子、羟基、C1~C3的烷氧基、C1~C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6~C12的单环式或二环式的芳香族化合物的1价基团、C6~C12的单环式或二环式的杂环系芳香族化合物的1价基团、或下式所示的1价基团,
其中,上述式中,Ra、R2及R3独立于式III中记载的Ra、R2及R3,表示选自作为式III中记载的Ra、R2及R3列举的基团中的基团;
R6表示氢原子、甲基、或乙基,
Q1表示在式III中与键合在Q1上的O成为一体而形成的磷酸基,
Q2表示氢原子。
12.根据权利要求8~11中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,自交联体形成抑制型光响应性核酸具有与光响应性部分碱基序列互补的部分碱基序列即互补性部分碱基序列,所述光响应性部分碱基序列为包含光响应性碱基的4个碱基长以上的部分碱基序列,
能够进行光交联的T或U为位于该互补性部分碱基序列中的T或U。
13.根据权利要求8~12中任一项所述的自交联体形成抑制型光响应性核酸,其中,自交联体形成抑制型光响应性核酸的碱基序列中的全部T或U的核苷酸被置换成式(I)所示的修饰核苷酸。
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