CN105891305A

CN105891305A - 一种卷烟烟气冷凝物生物安全性的检测方法

Info

Publication number: CN105891305A
Application number: CN201610422264.5A
Authority: CN
Inventors: 张亮
Original assignee: SHENZHEN TOBACCO INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN TOBACCO INDUSTRY Co Ltd
Priority date: 2016-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2016-08-24

Abstract

一种卷烟烟气冷凝物生物安全性的检测方法，为解决烟气检测方法不完善的问题，本发明采用彗星实验，选用中华仓鼠尾部细胞进行彗星实验，通过测定其尾部DNA百分含量(％tail DNA)评价细胞DNA损伤程度，用CASP彗星图像分析软件进行分析，本发明的有益效果在于：为深入研究吸烟烟气中的致突变物质对人体健康的危害作用，为吸烟与健康研究提供更全面的科学依据。

Description

一种卷烟烟气冷凝物生物安全性的检测方法

技术领域

本发明涉及一种卷烟烟气冷凝物生物安全性的检测方法。

技术背景

单细胞凝胶电泳试验(SCGE)也称为彗星试验，是一种快速有效检测单个细胞DNA损伤的技术，该试验与其他检测DNA损伤的方法相比具有很多优点：方法简便、快速、经济、灵敏，而且可以检测多种受试物引起的DNA损伤，在DNA损伤评价中得到广泛应用。卷烟主流烟气已报道的有害成分超过100种，且物质之间存在着协同和反协同作用，相互间的作用十分复杂，进入人体后，每种化合物的代谢途径和作用靶点各异，损伤机理也各不相同，所以依靠传统烟气化学分析方法，难以作为卷烟产品安全性评价的客观标准，而卷烟烟气生物安全性评价技术就是运用现代生物毒理学的原理和方法，可以更具体地对卷烟烟气的健康影响进行评价。

目前大多数国家的吸烟机普遍采用的吸烟方式和参数是国际标准化组织(ISO)定义的方式，即每口抽吸35mL，持续2s，每60s抽一口，但不同的抽吸方式对烟支的燃烧有很大影响，所以不同抽吸模式下卷烟烟气的化学成分也有很大的差别。ISO抽吸模式因不能代表吸烟者的实际吸烟行为而遭到多方批判：1)大多数吸烟者实际抽吸容量和频率高于ISO抽吸模式设置值；2)深度抽吸行为可能导致吸烟者摄取的烟气量高于ISO模式测试值；3)大部分吸烟者从抽吸浓香型卷烟转到抽吸淡味型时，存在增加抽吸容量等“补偿抽吸”的现象，引起实际烟气摄取量可能不同于ISO抽吸模式下的烟气摄取量；4)ISO抽吸模式不堵塞滤嘴通风孔，但吸烟者抽吸卷烟时会有意无意地用手指和嘴唇堵塞通风孔，导致实际摄取的烟气量增加。

鉴于此种形势，美国马萨诸塞州(Massachusetts)和加拿大卫生部(HealthCanada)对ISO的抽吸参数进行了修改，马萨诸塞州的方案考虑到通风孔的堵塞问题，采取封闭一半的通风孔，类似于模仿消费者抽烟时用手指夹住卷烟的通风区域所产生的堵塞现象；加拿大卫生部的方案则强调测量并报告每种卷烟产品的烟气最大释放量，采用此方案，用吸烟机测定的烟气量接近于消费者吸烟可能吸入的最大烟气量。三种抽吸模式的抽吸参数如以下表1所示：

表1 ISO,Massachusetts和Health Canada 3种抽吸方案

条件	ISO	Massachusetts	Health Canada
				每张滤片收集烟支数	5	4	3
抽吸容量/mL	35±0.3	45±0.3	55±0.3
				抽吸频率/s	60±0.5	30±0.5	30±0.5
通风孔	未封闭	50％封闭	100％封闭

近年来，对烟气有害成分的分析也越来越重视，所以许多国家和机构开展了不同抽吸模式对主流烟气中化学成分释放量影响的研究，而采用彗星试验来评估不同抽吸模式下卷烟烟气冷凝物(CSCs)对细胞的损伤目前还没有报道。

发明内容

本发明的目的是为了检测卷烟烟气冷凝物(CSCs)诱发中华仓鼠卵巢细胞DNA的损伤情况，选用尾部DNA百分含量(％tail DNA)评价细胞DNA损伤程度，用CASP彗星图像分析软件进行分析，旨在为应用彗星试验评价不同抽吸模式下卷烟主流烟气CSCs遗传毒性提供参考，为深入研究吸烟烟气中的致突变物质对人体健康的危害作用，为吸烟与健康研究提供更全面的科学依据。

本发明的一种基于体外毒理学试验的不同抽吸模式下卷烟烟气冷凝物生物安全性检测方法，包括下列步骤：

1)收集卷烟烟气冷凝物(CSCs)：直线型吸烟机抽吸样品卷烟，玻璃纤维滤片收集烟气冷凝物，每张滤片收集5支卷烟。

2)单细胞悬液制备：制成密度为(1-5)×10⁶单细胞悬液，用苔盼蓝染色记数细胞活性(>80％)。

3)凝胶制片：第一层为正常熔点胶，再取单细胞悬液与低熔点琼脂糖混合，作为第二层胶，再铺一层低熔点琼脂糖于第二层胶上，作为第三层胶；

进一步的，所述的正常熔点琼脂糖制备方法为将0.1g正常溶点琼脂糖粉剂和20mL碳酸缓冲液煮沸后混匀即得；所述的低熔点琼脂糖的制备方法是将0.162g低溶点琼脂糖粉剂和25mL碳酸缓冲液煮沸后混匀即得。

进一步的，步骤3中凝胶制片三层的用量分别为第一层100μL的NMA，第二层是10μL单细胞悬液和75μL LMA，第三层为和75μL NMA。

4)细胞裂解：待胶凝固后，将载玻片至于新鲜配制的细胞裂解液中，裂解1h；所述的细胞裂解液为100mmol/L的Na₂EDTA、2.5mol/L的NaCl、0.5％的N一月桂酞肌氨酸钠、1％的Tritonx‐100、10mmol/L的tris‐HCl和pH为10、10％的DMSO。

5)电泳：取出载玻片后平行置于水平电泳槽中，玻片之间不留空隙，将新鲜配制的电泳液放入，电泳；所述的电泳液内包括有300mmol/L NaOH，1mmol/LNa₂EDTA，电泳电流为300mA，电泳电压为20V。

6)中和染色：用中和缓冲液浸泡三次，再用甲醇固定，最后用溴化乙锭染色；所述的中和缓冲液为PH为7.5的0.4mol/L Tris‐HC。

7)读片：荧光显微镜下，以590nm荧光激发波长，用CASP彗星分析软件分析200个细胞，计算尾部DNA百分比。

所述的检测方法用于ISO抽吸模式、MASS抽吸模式和HCl抽吸模式的检测。

本发明的有益效果在于，能快速准确的检测烟气中的致突变物质对人体健康的危害作用，为吸烟与健康研究提供更全面的科学依据。

附图说明

图1彗星实验中各剂量细胞示意图。

具体实施方式

1)卷烟样品焦油为8mg/支，设置三种不同的抽吸模式，分别为：ISO抽吸模式、MASS抽吸模式和HCl抽吸模式抽吸样品卷烟，玻璃纤维滤片收集不同模式下的卷烟烟气冷凝物，每张滤片收集5支卷烟，用二甲基亚砜(DMSO)振荡萃取。

2)主要试剂配方：

0.5％正常溶点琼脂糖(NMA)：

正常溶点琼脂糖粉剂 0.1g

碳酸缓冲液 20mL

煮沸后混匀

0.65％低溶点琼脂糖(LMA)：

低溶点琼脂糖粉剂 0.162g

碳酸缓冲液 25mL

煮沸后混匀

肝素Na：

肝素 0.2g

生理盐水 100mL

经115℃，0.12MPa高压灭菌15min后使用；

电泳缓冲液(电泳前新鲜配制需4℃冷藏30-60分钟)：

NaOH 12g

200mmol/L EDTA 5mL

定容至1000mL

溴化乙锭(EB)染色液(诱变剂，小心操作)：

澳化乙锭 1mg

去离子水 50mL

室温储存，临用时将储存液稀释10倍。

3)单细胞悬液制备：

实验中向每个1.5mL的离心管中各加入0.5mL单细胞悬液,(中华仓鼠)然后加入0.6％生理盐水(NS)作为阴性对照、0.6％DMSO作为溶剂对照；10μg/mL环磷酰胺(CTX)作为阳性对照；CSCs(卷烟烟气冷凝物)的浓度梯度为25、50、75、100、125μg/mL，加入以上受试物后，在37℃培养箱中孵化4h，用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次后再悬浮于磷酸盐缓冲溶液中，用苔盼蓝染色记数细胞活性(>80％)，采用加入S9诱导的方法。

4)制片：

将磨砂玻璃泡酸洗净，烘箱内烘干。第一层为正常熔点琼脂糖(NMA)，取0.5％的NMA 100μL，铺在磨砂玻璃上，盖上盖玻片(24×32mm)，置冰盒(0℃)内5min，待其固化，作为第一层胶；先将LMA(0.65％低溶点琼脂糖)预热至37℃，再取10μL单细胞悬液(约1×10⁴个细胞)与75μL LMA混合，去掉盖玻片，将混悬液铺于第一层胶上，盖上盖玻片，置冰盒(0℃)内10min，待其固化，作为第二层胶；去掉盖玻片，再铺75μL 0.5％NMA于第二层胶上，盖上玻片，置冰盒(0℃)内10min，待其固化，作为第三层胶。

5)细胞裂解：

待胶凝固后去掉盖玻片，将载玻片至于4℃新鲜配制的细胞裂解液(100mmol/LNa₂EDTA、2.5mol/L NaCl、0.5％N一月桂酞肌氨酸钠、1％Tritonx-100、10mmol/L tris-HCl，pH 10、10％DMSO)中，裂解1h。

6)电泳：

取出载玻片后平行置于水平电泳槽中，载玻片之间不留空隙，将在4℃冰箱中预冷1h后新鲜配制的电泳液(300mmol/L NaOH，1mmol/LNa₂EDTA)放入，放置20min，300mA，20V条件下电泳20min。

7)中和染色：

用中和缓冲液(0.4mol/L Tris-HCl，PH 7.5)浸泡三次，再用甲醇固定3min，最后用溴化乙锭(50μL、20mg/L)染色，盖上盖玻片。上述所有过程均在黄光下暗室内完成，以避免紫外线所诱发的DNA损伤。

8)读片：

200倍荧光显微镜(OLYMPUS-BX51)下，以590nm荧光激发波长，用数码摄像机(OLYMPUS-DP50)随机拍摄。用CASP彗星分析软件分析200个细胞(每个平行片100个，每份两个平行片)，计算尾部DNA百分比。

9)实验结果：结果如表2所示

表2 彗星试验结果

剂量组平均尾部DNA百分含量均高于DMSO对照组，且有显著的剂量效应关系，且在各剂量组下ISO<MASS<HCI.。

Claims

1.一种卷烟烟气冷凝物生物安全性的检测方法,其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)收集卷烟烟气冷凝物：用滤片收集卷烟烟气冷凝物；

(2)单细胞悬液制备：准备密度为(1-5)×10⁶单细胞悬液，用苔盼蓝染色记数细胞活性，细胞活性>80％；

(3)凝胶制片：第一层铺上正常熔点琼脂糖，待其固化后在第一层上铺上单细胞悬液与低熔点琼脂糖，两者的比例为2:15；第二层固化后再于第二层上铺上低熔点琼脂糖；

(4)细胞裂解：待三层胶凝固后去掉盖玻片，将载玻片至于细胞裂解液中；

(5)电泳：裂解完毕后，取出载玻片后平行置于电泳槽中，载玻片之间不留空隙，放入电泳液，电泳18-20min；

(6)中和染色：电泳后先用中和缓冲液浸泡，再用甲醇固定，最后用溴化乙锭染色；

(7)读片：荧光显微镜下读片，对细胞进行分析，计算尾部DNA百分比以判断细胞的损伤程度。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的正常熔点琼脂糖制备方法为将0.1g正常溶点琼脂糖粉剂和20mL碳酸缓冲液煮沸后混匀即得；所述的低熔点琼脂糖的制备方法是将0.162g低溶点琼脂糖粉剂和25mL碳酸缓冲液煮沸后混匀即得。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3中凝胶制片三层的用量分别为第一层100μL的NMA，第二层是10μL单细胞悬液和75μL LMA，第三层为和75μL NMA。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的中和缓冲液为PH为7.5的0.4mol/L Tris-HC。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的细胞裂解液为100mmol/L的Na₂EDTA、2.5mol/L的NaCl、0.5％的N一月桂酞肌氨酸钠、l％的Tritonx-100、10mmol/L的tris-HCl和pH为10、l0％的DMSO。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的电泳液内包括有300mmol/LNaOH，1mmol/LNa₂EDTA，电泳电流为300mA，电泳电压为20V。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法用于ISO抽吸模式、MASS抽吸模式和HCl抽吸模式的检测。