CN105879427A - 一种浒苔生物抗藻剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特点是：对浒苔藻体去除杂藻，用灭菌海水冲洗，于烘箱中烘干，用研钵研磨成粉末，过筛，备用。取浒苔粉末放入锥形瓶中，按重量份1份浒苔粉末中加入15～20份无水乙醇，超声常温下提取2～3h，静置，再用超声波法提取，得初提液。然后用离心法将初提液离心分离除去粉末残渣，收集提取液。将提取液用旋转蒸发法浓缩至膏状后溶于蒸馏水中溶解搅拌，静置，取其上清液；上清液用等量石油醚进行萃取，分层后取水相物，再用等量乙酸乙酯对水相物进行萃取，所得的乙酸乙酯相即为浒苔生物抗藻剂。本发明工艺简单，提取率高，无有机污染，实所用试剂廉价和毒性低，所得浒苔生物抗藻剂生态安全性好。

Description

一种浒苔生物抗藻剂的制备方法
技术领域
本发明属于海水赤潮治理领域，涉及到一种浒苔生物抗藻剂的制备方法。
背景技术
近些年来，我国近海海域富营养化现象越来越严重，尤其是赤潮发生频率较高，对近海生态环境和海水养殖业造成了严重影响。赤潮的发生可以导致海水中的溶解氧含量下降，导致水生动物大量窒息死亡，并且引发赤潮的某些藻类还会产生毒素，这种毒素在贝类和鱼类体内积累还会对食用者的健康产生影响。2014年国家海洋局对我国近海海域的生态环境监测结果显示，我国目前出现富营养化现象的海域面积约8.5万平方公里，局部海域中无机氮、活性磷酸盐、石油类等主要污染因子的污染状况依然严重，劣Ⅳ类水质的海域面积约5万平方公里，全年共发生赤潮56次，赤潮危害海域面积累计7290平方公里，与2013年相比，赤潮次数和累计面积均有所增加。频发的赤潮对海洋生态环境和养殖带来了一定的负面影响。
目前赤潮的治理方法主要有以下四种：物理方法、化学方法、生物方法和低温等离子体法。化学法和物理法治标不治本，只能暂时性杀死或除掉水体中的赤潮生物，赤潮可能会再次发生。等离子体技术尚不成熟，其中化学反应的方向可控性差，工业化应用尚少。生物法操作起来比较复杂，且还不够成熟，但其却是目前修复环境、改善生境比较理想的方法。而生物法中利用植物化感作用治理藻类污染因兼具化学法快捷、生物法相对安全的优点，近年来颇受人们青睐。
浒苔，也叫苔条、苔菜，是一种常见大型绿藻。虽然无毒，但大量繁殖的浒苔也能遮蔽阳光，死亡的浒苔也会消耗海水中的氧气，影响海底生物的生长，浒苔爆发还会严重影响景观，干扰旅游观光和水上运动的进行，现在被打捞处理的浒苔多用来制作有机肥料、饲料、食品、医药保健品等。
发明内容
本发明为解决现有技术存在的上述问题，提供一种浒苔生物抗藻剂的制备方法，通过提取浒苔化感物质制作的浒苔生物抗藻剂，可以快捷、安全地治理赤潮藻，同时，为浒苔资源化利用开辟新的方向。
本发明采用的技术方案是：一种浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）对浒苔藻体去除杂藻，用灭菌海水冲洗3～4次，于烘箱中40℃～60℃条件下烘干2～3h，用研钵研磨成粉末，过筛，备用；
（2）取浒苔粉末放入锥形瓶中，按重量份1份浒苔粉末中加入8～20份无水乙醇，超声常温下提取2～3h，静置8～12h，再用超声波法提取1～2h，得初提液，然后，用离心法在7000～8000转/分的转速下将初提液离心分离15～20min除去粉末残渣，收集提取液，然后，把粉末残渣再按上述方法提取一次，将提取所得提取液合并；
（3）将提取液用旋转蒸发法浓缩至膏状，水分含量降至30%～40%，将膏状物溶于4～6倍体积的蒸馏水中溶解搅拌15～20min，静置0.5～1h，取其上清液；上清液用等量石油醚进行萃取，分层后取水相物，再用等量乙酸乙酯对水相物进行萃取，所得的乙酸乙酯相即为浒苔生物抗藻剂，减压蒸馏后用二甲基亚砜（DMSO）定容，置于冰箱中冷藏备用。
所述步骤（1）中,所述过筛所用筛网的目数为60目。
所述步骤（1）中灭菌海水的制备方法为：天然海水经孔径0.45µm醋酸纤维滤膜过滤后，用高压灭菌锅在100℃～120℃的条件下灭菌15～20 min。
所述步骤（2）中,所述离心法采用的转速为7500转/分。
所述步骤（3）中, 所述冰箱中冷藏的温度为3～5℃。
本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
1、本发明提供的一种浒苔生物抗藻剂的制备方法，首先是采用反复超声浸提与离心法，利用乙醇、石油醚、乙酸乙酯进行三级萃取，大大提高浒苔生物抗藻剂的提取率；其次为步骤（1）中使用灭菌海水冲洗，减少干燥过程中菌类对浒苔品质的影响。
2、本发明通过大量实验研究，摸索出浒苔生物抗藻剂最佳的提取流程，本发明提取工艺简单，提取率高，无有机污染，实验所用试剂廉价和毒性低，所得浒苔生物抗藻剂生态安全性好。而浒苔与多种赤潮藻类间存在着化感克生作用，本发明提取浒苔化感物质制作的浒苔生物抗藻剂，可以快捷、安全地治理赤潮藻，同时，为浒苔资源化利用及在赤潮防治上的应用开辟新的方向。
具体实施方式
本发明提供一种浒苔生物抗藻剂制备方法的具体实施方式，其具体实施步骤如下：
（1）对浒苔藻体去除杂藻，用灭菌海水冲洗3～4次，于烘箱中40℃～60℃条件下烘干2～3h，用研钵研磨成粉末，过筛，备用；
（2）取浒苔粉末放入锥形瓶中，按重量份1份浒苔粉末中加入15～20份无水乙醇，超声常温下提取2～3h，静置8～12h，再用超声波法提取1～2h，得初提液，然后，用离心法在7000～8000转/分的转速下将初提液离心分离15～20min除去粉末残渣，收集提取液，然后，把粉末残渣再按上述方法提取一次，将提取所得提取液合并；
（3）将提取液用旋转蒸发法浓缩至膏状，水分含量降至30%～40%，将膏状物溶于4～6倍体积的蒸馏水中溶解搅拌15～20min，静置0.5～1h，取其上清液；上清液用等量石油醚进行萃取，分层后取水相物，再用等量乙酸乙酯对水相物进行萃取，所得的乙酸乙酯相即为浒苔生物抗藻剂，减压蒸馏后用二甲基亚砜（DMSO）定容，置于冰箱中冷藏备用。
下面通过两个具体实施案例来进一步详细说明本发明。
实施例1：
浒苔藻体去除杂藻，用灭菌海水冲洗3次，于烘箱中50℃条件下烘干2.5h，用研钵研磨成粉末，过60目筛；取10g浒苔粉末放入500ml锥形瓶中，加入100ml无水乙醇，超声常温下提取2h，静置10h，再用超声波法提取2h，然后用离心法在7500转/分的转速下离心分离20min除去粉末残渣，收集提取液；然后把粉末残渣再按上述方法提取一次，将提取所得提取液合并，将提取液用旋转蒸发法浓缩至膏状，将膏状物溶于蒸馏水，取其上清液，上清液用等量石油醚进行萃取，分层后取水相物，再用等量乙酸乙酯对水相物进行萃取，将所得的乙酸乙酯相减压蒸馏所得提取物用二甲基亚砜（DMSO）定容至25mL，所得浓度以400g.L-1表示，4℃冰箱备用。
取一定量制备的浒苔生物抗藻剂放入锥形瓶中，然后加入f/2 培养液和东海原甲藻藻液，培养混合液总体积为 20mL。东海原甲藻的接种密度为 4.5×104cells.mL-1。每个处理设置 3 组平行实验，实验共进行9天，每24小时调查一次。实验结果见表1：
表1
名称 对照组 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 浓度7
浒苔生物抗藻剂加入量µL 0 1 5 10 20 25 50 100
浒苔生物抗藻剂浓度g.L-1 0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.5 1 2
72小时抑制率% 0 3.9 30.2 88.5 180.4 210.7 藻密度为0，无法计算 藻密度为0，无法计算
第9天藻密度/104cells.mL-1 70.9 71.3 42.1 6.2 0 0 0 0
实施例2：
浒苔藻体去除杂藻，用灭菌海水冲洗3次，于烘箱中50℃条件下烘干2h，用研钵研磨成粉末，过60目筛；取5g浒苔粉末放入500ml锥形瓶中，加入100ml无水乙醇，超声常温下提取2h，静置12h，再用超声波法提取2h，然后用离心法在7500转/分的转速下离心分离15min 除去粉末残渣，收集提取液；然后把粉末残渣再按上述方法提取一次，将提取所得提取液合并，将提取液用旋转蒸发法浓缩至膏状，将膏状物溶于蒸馏水，取其上清液，上清液用等量石油醚进行萃取，分层后取水相物，再用等量乙酸乙酯对水相物进行萃取，将所得的乙酸乙酯相减压蒸馏所得提取物用二甲基亚砜（DMSO）定容至10mL，所得浓度以500g.L-1表示，4℃冰箱备用。
取一定量制备的浒苔生物抗藻剂放入锥形瓶中，然后加入f/2 培养液和东海原甲藻藻液，培养混合液总体积为 20mL。东海原甲藻的接种密度为 5.5×104cells.mL-1。每个处理设置 3 组平行实验，实验共进行9天，每24小时调查一次。实验结果见表2：
表2
名称 对照组 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 浓度7
浒苔生物抗藻剂加入量µL 0 1 5 10 20 25 50 100
浒苔生物抗藻剂浓度g.L-1 0 0.025 0.125 0.25 0.5 0.625 1.25 2.5
72小时抑制率% 0 4.5 34.7 94.5 211 藻密度为0，无法计算 藻密度为0，无法计算 藻密度为0，无法计算
第9天藻密度/104cells.mL-1 74.5 75.2 39.0 5.4 0 0 0 0
本发明实施例对象为东海原甲藻，实施例对本发明作进一步的说明，旨在便于对本发明的理解，但对其不起任何限定作用。
本发明将浒苔生物抗藻剂加入东海原甲藻的培养液中，确定了浒苔生物抗藻剂对东海原甲藻的最佳抑制浓度。使用时，使水体中浒苔生物抗藻剂浓度在0.4～1.0 g.L-1（代表1L有机溶剂中含有0.4～1.0g浒苔干粉末中所有的浒苔生物抗藻剂）来控制东海原甲藻灾害。实验时东海原甲藻的接种密度为 4×104～6×104cells.mL-1。
近5年的中国海洋环境状况公报显示，东海原甲藻为赤潮藻第一优势种，引发的赤潮次数最多，造成的损失巨大，所以，本发明制备的浒苔生物抗藻剂对东海原甲藻的抑制或灭杀作用意义重大。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）对浒苔藻体去除杂藻，用灭菌海水冲洗3～4次，于烘箱中40℃～60℃条件下烘干2～3h，用研钵研磨成粉末，过筛，备用；
（2）取浒苔粉末放入锥形瓶中，按重量份1份浒苔粉末中加入8～20份无水乙醇，超声常温下提取2～3h，静置8～12h，再用超声波法提取1～2h，得初提液，然后，用离心法在7000～8000转/分的转速下将初提液离心分离15～20min除去粉末残渣，收集提取液，然后，把粉末残渣再按上述方法提取一次，将提取所得提取液合并；
（3）将提取液用旋转蒸发法浓缩至膏状，水分含量降至30%～40%，将膏状物溶于4～6倍体积的蒸馏水中溶解搅拌15～20min，静置0.5～1h，取其上清液；上清液用等量石油醚进行萃取，分层后取水相物，再用等量乙酸乙酯对水相物进行萃取，所得的乙酸乙酯相即为浒苔生物抗藻剂，减压蒸馏后用二甲基亚砜定容，置于冰箱中冷藏备用。
2.按照权利要求1所述的浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中,所述过筛所用筛网的目数为60目。
3.按照权利要求1或2所述的浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中灭菌海水的制备方法为：天然海水经孔径0.45µm醋酸纤维滤膜过滤后用高压灭菌锅在100℃～120℃的条件下灭菌15～20 min。
4.按照权利要求1或2所述的浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中,所述离心法采用的转速为7500转/分。
5.按照权利要求3所述的浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中,所述离心法采用的转速为7500转/分。
6.按照权利要求1或2所述的浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中, 所述冰箱中冷藏的温度为3～5℃。
7.按照权利要求5所述的浒苔生物抗藻剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中,所述冰箱中冷藏的温度为3～5℃。
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