CN105878264A - miR-21及其抑制剂在制备促进牙周组织再生药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR‑21在制备促进牙周组织再生的药物中的应用，以及miR‑21抑制剂在制备促进牙周组织再生的药物中的应用，所述miR‑21抑制剂是指miR‑21的反义核酸，或具有miR‑21反义核酸序列的重组质粒或病毒载体，或抑制miR‑21表达的化学合成物。本发明还公开了一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的所述miR‑21抑制剂，以及药学上可接受的载体。miR‑21及其抑制剂在制备相关药物中具有广阔的应用前景。

Description

miR-21及其抑制剂在制备促进牙周组织再生药物中的应用

技术领域

本发明涉及miR-21及其抑制剂在制备促进牙周组织再生药物中的应用。

背景技术

牙齿缺失修复及牙周组织再生是口腔医学研究的重点和目标之一。现阶段，临床大多数利用义齿(如固定义齿、活动义齿及种植义齿等)修复牙齿缺失，恢复患者口腔的功能和容貌。但这些修复手段仅达到赝复体修复，却无法达到真正意义上的生物修复。近年来，关于牙齿干细胞及组织工程技术的研究进展给牙齿和牙周组织生物学再生带来了新的福音。特别是2004年Seo等利用单细胞克隆技术，从牙周膜中成功分离、鉴定出了一种新的成体干细胞即牙周膜干细胞，为口腔生物修复提供了新希望。这类干细胞是一种口腔临床中易于获得的间充质来源的成体干细胞；也是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的间充质干细胞。它可表达间充质干细胞的表面标志物，具备自我更新及多向分化能力；可表现出很高的增殖和克隆形成能力。在体外经过适当的诱导能够形成骨、软骨、神经、脂肪、血管等多种组织；可潜在分化为成骨细胞或成牙骨质细胞，并能在体内移植后形成牙骨质-牙周膜-牙槽骨样结构物，为牙齿和牙周组织生物再生提供了可能。

microRNA(miRNA,miR)是作为一类大小约18-25个核苷酸长度(bp)的非编码单链RNA分子，广泛存在于真核生物体内，具有细胞特异性和组织特异性，是在转录后水平来调控基因表达的重要因子。miRNAs基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分落于基因间隔区(inter genic region,IGR)，它们的转录独立于其他的基因，具有本身的转录调控机制，成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。miRNA是在细胞核内形成前体，在胞浆内经Dicer酶作用，产生成熟的miRNA，成熟的miRNA与mRNA的非编码区结合抑制mRNA翻译成蛋白从而发挥调控作用，参与生命过程的重要进程，包括细胞分化、细胞增殖与凋亡、生物发育、疾病的发生、发展等，并在复杂组织的再生活动中有重要作用。目前，已有多项研究发现miRNA参与调控成骨细胞分化。Mizuno等发现在BMP-4诱导小鼠骨髓间质干细胞ST2分化为成骨细胞的过程中，过表达miR-125b可降低细胞增殖从而抑制ST2细胞向成骨细胞分化。Luzi等研究表明miR-26a在诱导的人脂肪组织衍生的干细胞向成骨细胞分化的后期发挥抑制效应。Huang等研究结果提示miR-204/211通过抑制Runx2蛋白翻译来减少其表达，从而阻止间充质祖细胞和BMSC向成骨分化。miR-141和miR-200a则是通过对骨生成转录因子Dlx5的翻译抑制参与成骨细胞分化过程。研究还发现了一些正性调控成骨分化的miRNA，miR-29b和miR-210已被证实在成骨细胞分化中具有正调控作用。随着对miRNAs研究的不断深入，其在牙齿间充质干细胞成骨向分化中的作用也逐渐被揭示。Hung等研究发现miR-146a通过下调NF-κB信号通路促进牙周膜干细胞的成骨向分化。Zhou等则发现伊班膦酸盐诱导牙周膜干细胞成骨向分化的过程中，miR-18a,miR-133a,miR-141及miR-19a均发生了改变，参与了调控过程。

miR-21是一类具有多种调控功能的miRNA，通过pubmed数据库查阅关于miR21的相关研究(截至到2016年3月)，发现miR21的研究主要集中在肿瘤、心血管、免疫、遗传类疾病等领域。如在HeLa细胞中抑制miR-21时细胞增长明显；在乳腺癌中miR-21呈高表达，且反义miR-21寡核苷酸抑制细胞生长和肿瘤的增长；在心脏肥大鼠中miR-21在心肌细胞显著增高，敲除miR-21可抑制心肌细胞的肥大。

发明人在前期研究中发现，牙齿矫正的过程中，miR-21能够正向调控由于机械拉伸诱导的牙周膜干细胞成骨向分化。然而，上述的研究主要集中于miRNA对牙周膜干细胞成骨向分化的影响，但分化增殖后能否附着于牙根，即能否与牙本质或已有的牙骨质实现连接，从而实现牙周组织的再生，目前还未有系统的深入研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供miR-21及其抑制剂在制备促进牙周组织再生药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供miR-21在制备促进牙周组织再生药物中的应用。

上述应用中，所述牙周组织再生具体为牙槽骨再生。

本发明的第二方面，提供miR-21抑制剂在制备促进牙周组织再生药物中的应用。

上述应用中，miR-21抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可以降低miR-21的活性、抑制miR-21的表达或抑制miR-21的转录和加工的物质均可用于本发明。

作为优选的，所述miR-21抑制剂是指miR-21的反义核酸，或具有miR-21反义核酸序列的重组质粒或病毒载体，或抑制miR-21表达的化学合成物。

所述miR-21的反义核酸如SEQ ID NO.1所示。

anti-miR21：5，-CCGGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3，(SEQ ID NO.1)

上述应用中，所述牙周组织再生具体为牙槽骨再生。

本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的所述miR-21抑制剂，以及药学上可接受的载体。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

所述“药学上可接受的载体”为常规的给药载体，包括各种赋形剂或稀释剂等。

miR-21作为一种重要的调控分子，本发明人对此进行了长期的研究，前期研究发现miR-21能够以ACVR2B作为靶基因，调控由于机械拉伸诱导的牙周膜干细胞成骨向分化，其中，miR-21的表达量上调能够促进牙周膜干细胞的成骨向分化。然而，由牙周膜干细胞成骨向分化后能否实现牙周组织再生，目前仍不清楚。而且作为miR-21调控的靶基因有多种，不同的靶基因相应的调控不同的信号通路，调控过程十分复杂。在没有相应靶基因和信号通路研究的基础上，是很难对miR-21的应用方向进行推测的。本发明人通过miR-21调控牙周膜干细胞体内组织再生的机制研究发现，上调miR-21能够抑制体内牙周组织再生；相反，下调miR-21能够促进体内牙周组织的再生；并通过生物信息学靶点预测，确定SMAD5是miR-21调控牙周组织再生的靶基因。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种miR-21及其抑制剂的用途，用于在体内促进牙周组织再生，可以通过改变miR-21的基因表达来达到预防和/或治疗牙周疾病的目的。miR-21及其抑制剂在制备相关药物中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：上调或下调miR21后体内组织再生能力的变化；

图2：上调或下调miR21后体内组织再生能力及SMAD5的表达变化。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：miR-21调控牙周膜干细胞体内组织再生的机制研究

实验方法如下：

1.质粒构建

根据miR-21序列(hsa-miR-21,UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)设计引物，引物由上海吉凯基因化学技术公司合成并纯化。退火后连接至线性化的pGenesil-1质粒(购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司)，构建miR-21的表达载体Lenti-miR21(过表达)及anti-miR21(沉默)慢病毒，分别用来增强、抑制miR-21的表达。

miR-21

Silencing：

anti-miR21：5，-CCGGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3，(SEQ ID NO.1)

Overexpression：

Lenti-miR21：5，-CGGCCGCGACTCTAGTTATCAAATCCTGCCTGACTG-3，(SEQ IDNO.2)

Vector：pGC-LV-GFP。

2.将慢病毒Lenti-miR21、anti-miR21及相应空载体分别转染牙周膜干细胞

采用酶消化法培养裸鼠的牙周膜干细胞，将生长旺盛的第二或第三代牙周膜干细胞接种在60mm培养皿，培养成分为α-MEM培养基(含15％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)。分别将慢病毒Lenti-miR21、anti-miR21及相应空载体转染牙周膜干细胞。

3.牙周膜干细胞+HA/TCP复合体体内回植

裸鼠随机分为5组：(1)Lenti-miR空载体转染牙周膜干细胞+HA/TCP组；(2)Lenti-miR21(过表达)转染牙周膜干细胞+HA/TCP组；(3)anti-miR空载体转染牙周膜干细胞+HA/TCP组；(4)anti-miR21(沉默)转染牙周膜干细胞+HA/TCP组；(5)正常不加诱导的培养牙周膜干细胞+HA/TCP组。回植8w后，分别处死裸鼠。组织学观察：处死动物获取标本，固定，脱钙，进行HE染色，观察组织再生情况。结果如图1所示。

由图1可以看出，H&E染色显示体内回植8w后，上调miR21抑制体内牙周组织再生，下调miR21促进体内牙周组织再生能力的变化。

实施例2：生物信息学方法预测miR-21调控牙周组织再生的靶基因

用生物信息学的方法，通过miRNA靶基因预测软件(MiRanda、TargetScan、PicTar)在线服务站点，预测出miR-21参与调控的靶基因。所参考的数据库网址如下：

MiRandahttp://www.microrna.org；

TargetScanhttp://www.targetscan.org；

PicTarhttp://pictar.bio.nyu.edu；

根据GO功能分析，预测出13个与成骨分化功能相关的miR-21的靶基因(如表1所示)。经PCR验证后，筛选出4个表达差异最明显的靶基因：IL6R、SMAD5、CDK6、SOX2。

表1：

以往研究表明，SMAD5是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族细胞质内重要的信号转导分子。SMAD5属于受体激活型SMAD，它在BMPs诱导成骨的信号转导中起着不可忽视的作用。SMAD5可以将TGF-β信号直接迅速的从细胞膜传入细胞核内，从而使BMP的诱导成骨信号迅速的从受体向细胞核靶基因传递，调控细胞的成骨分化。

为进一步证明SMAD5是miR-21调控牙周组织再生的靶基因，我们进行如下实验：

1.质粒构建(方法同实施例1)；

2.将慢病毒Lenti-miR21、anti-miR21及相应空载体分别转染牙周膜干细胞(方法同实施例1)；

3.牙周膜干细胞+HA/TCP复合体体内回植

裸鼠随机分为5组(分组同前)，回植8w后，分别处死裸鼠。组织学观察：处死动物获取标本，固定，脱钙，进行免疫组化染色，观察组织再生情况及SMAD5着色(棕褐色)情况。结果如图2所示。

由图2可以看出，免疫组化染色显示体内回植8w后，上调miR21后，SMAD5表达降低，牙周组织再生能力减弱；下调miR21后，SMAD5表达升高，牙周组织再生能力增强。

实验结果表明，SMAD5是miR-21调控牙周组织再生的靶基因；经检测验证后，确认SMAD5是miR-21调控牙周组织再生的靶基因。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.miR-21在制备促进牙周组织再生药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述牙周组织再生是牙槽骨再生。

3.miR-21抑制剂在制备促进牙周组织再生药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述miR-21抑制剂是指miR-21的反义核酸，或具有miR-21反义核酸序列的重组质粒或病毒载体，或抑制miR-21表达的化学合成物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-21的反义核酸如SEQ ID NO.1所示。

6.如权利要求3、4或5所述的应用，其特征在于，所述牙周组织再生是牙槽骨再生。

7.一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的权利要求4所述miR-21抑制剂，以及药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为常规的给药载体，包括赋形剂或稀释剂。

9.包含权利要求7或8所述的药物组合物的临床制剂。