CN110403953A - miRNA-21的抑制剂在乙型肝炎治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miRNA‑21的抑制剂在乙型肝炎治疗中的应用，本发明首次发现miR‑21可以促进HBV的复制和表达，其抑制剂能够用于HBV的治疗，为HBV的治疗提供一种耐突变根治HBV慢性感染的药物，有很好的应用价值很推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及乙型肝炎技术领域，更具体地，涉及miRNA-21的抑制剂在乙型 肝炎治疗中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病 原体，属嗜肝DNA病毒科，该科病毒包含正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝DNA病 毒属两个属，引起人体感染的是正嗜肝DNA病毒属。HBV感染是全球性的公共 卫生问题。
目前公认抗HBV的药物主要是干扰素-α和核苷类药物。1957年，Isaacs和Linchenman首次发表关于干扰素α(IFN-α)的研究，是第一个用于治疗失代偿 性肝硬化外的慢性己型肝炎病人的药物。干扰素-α分为常规的IFN-α以及聚乙 二醇干扰素α-2α，其作用机制为直接作用干扰病毒DNA的合成，降解病毒的 mRNA，在细胞内阻断病毒感染，同时刺激宿主的免疫应答。然而其流感样副作 用(如高热，寒颤，低血压，肌痛等)影响其长期疗效。拉米夫定、阿德福韦酷、 替比夫定、恩替卡韦和替诺福韦为目前治疗HBV有效常用的核苷类药物，主要通 过影响病毒的生命周期，而非瞄准病毒转录的模板来达到治疗目的，但是，干扰 素-α只对部分患者有效，且有流感样等副作用。
核苷类药物HBV的作用机制是抑制病毒DNA聚合酶和逆转录酶活性，并竞 争性抑制HBV DNA链的合成，干扰邻近感染病毒细胞的cccDNA合成。核苷 类药物不仅可以治疗肝硬化的病人，且它的副作用比较小，故为治疗HBV慢性 感染的一线药物。但长期用药容易出现病毒耐药性突变、逃逸、停药反跳等现象。 以上药物均不能彻底清除体内病毒的cccDNA，故无法根治HBV慢性感染。
因此目前急需一种有效的HBV的药物。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种miRNA-21的抑制剂在 乙型肝炎治疗中的应用。
本发明的第一个目的是提供miR-21的抑制剂在制备抑制HBV的复制和/或 表达的表达中的应用。
本发明的第二个目的是提供miR-21的抑制剂在制备治疗HBV药物中的应 用。
本发明的第三个目的是提供miR-21作为HBV治疗靶点中的应用。
本发明的第四个目的是提供miR-21作为治疗HBV药物的筛选靶点中的应 用。
本发明的第五个目的是提供一种治疗HBV的药物。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明要求保护以下内容：
miR-21的抑制剂在制备抑制HBV的复制和/或表达的表达中的应用。
miR-21的抑制剂在制备治疗HBV药物中的应用。
miR-21作为HBV治疗靶点中的应用。
miR-21作为治疗HBV药物的筛选靶点中的应用。
一种治疗HBV的药物，含有miR-21的抑制剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次发现miR-21可以促进HBV的复制和表达，其抑制剂能够用于 HBV的治疗，为HBV的治疗提供一种耐突变根治HBV慢性感染的药物，有很 好的应用价值很推广前景。
附图说明
图1为重组载体双酶切鉴定。
图2为转染24h后细胞荧光表达情况(×50)。
图3为各组细胞miRNA-21相对表达量。
图4为各组细胞c-myc mRNA表达量。
图5为各组细胞c-myc蛋白表达情况。
图6为各组细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实 施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试 验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 pmR-21真核过表达载体的构建
一、实验方法
通过miRBase数据库查找pre-miRNA-21序列及其上下游各100bp侧翼序列, 用Oligo7软件设计引物。其中正向引物为：5′-TCG AGA ATTCAT TGG GGT TCG ATC TTA ACAG-3′，反向引物为:5′-TCG AGG ATC CCA CAA AAG ACT CTA AGT GCC-3′(最前端序列护碱基，下划线序列分别为EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位 点)，扩增片段长度为328bp。提取HepG2.2.15细胞的DNA作为模板，用PCR 扩增miRNA-21前体序列。
反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环。 纯化后的pre-miRNA-21和pmR-mCherry质粒双酶切后用T4连接酶于16℃过夜 连接。将连接后的产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,进行卡那霉素抗性平板筛 选。16h后挑取阳性菌落摇菌扩大培养,提取质粒进行双酶切，以1％琼脂糖凝胶 电泳分离回收。最后选取电泳阳性组的菌株送检进行测序作鉴定。
二、实验结果
重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后,可见质粒大片段和插入的基因小片 段两条条带(图1)，其中小片段位于300bp与500bp之间,与pre-miRNA-21的PCR 产物大小一致。最终测序证实pre-miR-NA-21基因片段已经插入pmR-mCherry 质粒中,pmR-21重组载体构建成功。
实施例2 pmR-21重组载体转染HepG2.2.15细胞
一、实验方法
HepG2.2.15细胞培养于含15％FBS的高糖DMEM培养液中(同时添加200 mg/L的G418、10g/L L-谷氨酰胺及100 000IU/L青、链霉素),HepG2细胞培养于 含10％FBS和100000IU/L青、链霉素的高糖DMEM培养液中，置于37℃含5％ CO2的培养箱内。细胞稳定传代3次后，接种到6孔板中，每孔细胞密度为4×105个。种板24h后(汇合度约50％)取去经内毒素提取的pmR-21重组载体和 pmR-mCherry空质粒按试剂盒操作说明进行转染，分为实验组(转染pmR21重组 载体),空载体组(转染pmR-mCherry空质粒)、空白组(未转染质粒)、阳性对照组 (HepG2细胞)。每孔转染试剂Lipofectamine2000 5μL,质粒2.5μg,转染24h后荧光显微镜下观察载体上荧光蛋白表达效果。
二、实验结果
各组细胞形态正常,pmR-21重组载体组和空载体组观察到红色荧光，空白组 无荧光，见图2。流式细胞术检测转染效率为57.14％。
实施例3 miRNA-21qPCR相对定量检测
一、实验方法
转染24h后,Trizol法提取各组细胞总RNA,鉴定其完整性和纯度后以总RNA 为模板，设计针对miRNA-21成熟序列的特异性RT-PCR茎环引物,逆转录后进行 qPCR,以U6为内参照,反应条件为95℃预变性20s；95℃10s，60℃20s，70℃10s， 共40个循环。采用2-ΔΔct相对定量分析方法分析各组细胞miRNA-21的相对表 达量。
二、实验结果
以空白组miRNA-21校正后，空载体组与空白组表达量差异无统计学意义 (P>0.05)，实验组miRNA-21表达量高于空白组及空载体组,差异有统计学意义 (P<0.05)。见图3。
实施例4 c-myc mRNA水平的RT-PCR检测
一、实验方法
以总RNA为模板，逆转录成cDNA,以此为模板进行PCR扩增。c-myc上游 引物为5′-CGT CCT CGG ATT CTC TGC TC-3′，下游引物为5′-GCT GGT GCA TTT TCG GTT GT-3′，产物大小为380bp。内参为GAPDH,上游引物为5′-GCT CTC TGC TCCTCC TGT-3′，下游引物为5′-ATG AGT CCT TCC ACG ATAC-3′，产物 大小为540bp。反应条件均为：94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s， 共30个循环。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳后进行灰度值分析。
二、实验结果
实验组在转染24h后c-myc mRNA表达量高于空白组及空载体组，差异有 统计学意义(P<0.05)。见图4。
实施例5 Western blot检测c-myc蛋白表达水平
一、实验方法
在转染后72h取各组蛋白样品,BCA法测定蛋白浓度，变性后进行十二烷基 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，半干转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以浓 度为1∶1 500的一抗4℃过夜封闭、1∶2 000的二抗37℃封闭1h，TBST洗膜 后滴加ECL发光液显影，用灰度值分析条带。内参为β-actin。
二、实验结果
Western blot显示，与空载体组和空白组比较，实验组在转染72h后表达升 高(P<0.05)，与该基因mRNA检测结果一致，见图5。
实施例6 CCK-8法检测细胞增殖
一、实验方法
取转染24h后各组细胞,胰酶消化后接种到96孔板中，每孔1 000个细胞,培 养液200μL，每组接种4孔，分别于1～4d检测细胞增殖情况。检测时每孔加CCK-8 试剂20μL，培养1h后用酶标仪检测各孔450nm吸光度(A)值，绘制生长曲线图。 每组设3个复孔，重复3次。
二、实验结果
铺板48h后,实验组细胞生长速度快于空载体组和空白组(P<0.05),见图6。
综上所述，miR-21可以促进HBV的复制和表达，上调c-myc基因的表达并 促进细胞增殖。
Claims (5)
1.miR-21的抑制剂在制备抑制HBV的复制和/或表达的表达中的应用。
2.miR-21的抑制剂在制备治疗HBV药物中的应用。
3.miR-21作为HBV治疗靶点中的应用。
4.miR-21作为治疗HBV药物的筛选靶点中的应用。
5.一种治疗HBV的药物，其特征在于，含有miR-21的抑制剂。
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