CN105861368A - 一株粪产碱菌及其降解赭曲霉毒素a的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株粪产碱菌及其降解赭曲霉毒素A的应用。该粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF‑0D1，其保藏编号为CGMCC No.12100。本发明还提供了含有该保藏菌株的生物脱毒剂及其制备方法。此外，本发明还提供了所述菌株或生物脱毒剂在降解赭曲霉毒素A中的应用。

Description

一株粪产碱菌及其降解赭曲霉毒素A的应用
技术领域
本发明涉及一株粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，该菌可用来降解食品或饲料中赭曲霉毒素A。
背景技术
赭曲霉毒素(Ochratoxin A，OTA)是一种真菌产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于食品和饲料中，具有肾毒性、致癌性、致畸性、神经毒性和免疫毒性等，对动物和人体健康有很大的危害。
对饲料和食品中OTA污染控制的主要措施有物理、化学及生物脱毒技术。利用吸附、加热和辐射等物理方法不能有效地控制食品或饲料中OTA的含量。化学法主要通过氧化、酸碱等作用可以有效降解转化OTA，但营养成分被极大的破坏，并造成化学试剂残留对健康危害的不确定性。此外，物理和化学法也因处理操作困难、处理成本高等问题难以扩大应用。生物法脱毒主要利用微生物本身或其代谢产物来降解OTA，具有作用条件温和、处理效率高、不会造成营养物质流失等优点，且能有效避免化学法和物理法导致的试剂残留和副产物安全性等问题，具有十分良好的应用前景。微生物或酶因其反应的准确性、有效性和环保性而长久以来是人们关注的热点。目前，OTA的降解菌和降解酶的研究已取得一定的进展，其中细菌有乳酸杆菌Lactobacillus sp.、枯草杆菌Bacillus subtilis、乙酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus、红串红球菌Rhodococcus erythropolis等，真菌有黑曲霉Aspergillus niger、烟曲霉Aspergillus fumigatus、炭黑曲霉Aspergilluscarbonarius、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、柠檬形克勒克氏酵母Kloeckeraapiculatas等。目前，未见关于粪产碱菌降解赭曲霉毒素A的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株可以降解赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)的粪产碱菌，利用该菌降解OTA的方法安全简便、绿色无残留。
本发明的另一个目的是利用所述粪产碱菌制成各种降解赭曲霉毒素A的 产品。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一株粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，菌名为ASAGF-0D1，分类名为：粪产碱菌Alcaligenes faecalis，已于2016年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.12100。与其它生物的情况一样，本发明具有降解赭曲霉毒素A的粪产碱菌Alcaligenes faecalis仍然易发生变异。因此，可以利用本领域已知的物理和化学诱变方法得到该菌株的突变株。这些突变株，只要保留了赭曲霉毒素A降解能力这样一个特征，也属于本发明的一部分。
粪产碱菌ASAGF-0D1的培养方法：用LB固体培养基于30℃培养；液体培养时摇床的转速为220r/min。该菌在LB培养基预培养30h后，以1‰的接种量接种于50mL培养基中进行摇瓶发酵培养，即获得粪产碱菌ASAGF-0D1的发酵液。
所述发酵培养基的配方：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，琼脂1.5％，加蒸馏水至1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
粪产碱菌ASAGF-0D1的形态学特征和生理生化特性。(表1)
表1粪产碱菌ASAGF-0D1的形态学特征和生理生化特性。
本发明还提供了一种生物脱毒剂，它的活性成分为粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)ASAGF-0D1，或其细胞内溶物，例如胞内蛋白，所述粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)ASAGF-0D1保藏编号为CGMCC No.12100。该生物脱毒剂可以是液体剂型也可以是固体剂型，并通过现有技术中已公开的制备方法来制备。具体地，本发明提供了一种上述生物脱毒剂的制备方法，该方法包括：
将保藏编号为CGMCC No.12100的粪产碱菌ASAGF-0D1活化，多级扩培，当菌体处于稳定期时，收集发酵液，制备成液体型生物脱毒剂。优选地，该发酵液经自然沉降、离心、过滤等不影响菌体活性的方法浓缩后得到浓度较高的菌悬液；更优选地，所述菌悬液还可以加入营养液或营养液和保护剂的混合液，制备成液体型生物脱毒剂。进一步地，也可以利用本领域现有方法制备将该液体型生物脱毒剂制成固体型生物脱毒剂，例如加入吸附剂等。
本发明制备生物脱毒剂的方法还可以包括：将保藏编号为CGMCC No.12100的粪产碱菌ASAGF-0D1活化，多级扩培，当菌体处于稳定期时，收集发酵液，该发酵液经自然沉降、离心、过滤等不影响菌体活性的方法浓缩后得到浓度较高的菌悬液或菌体细胞，利用均质、超声等现有的方法进行破碎，除去菌体细胞碎片等杂质后通过浓缩获得浓度较高的蛋白液，制得液体型生物脱毒剂。进一步地，也可以利用本领域现有方法制备将该液体型生物脱毒剂制成固体型生物脱毒剂，例如加入吸附剂等。
上述生物脱毒剂可采用本领域的常规包装技术包装，依据具体环境条件保存。
本发明还要求保护所述粪产碱菌ASAGF-0D1或上述生物脱毒剂在降解赭曲霉毒素A中的应用。
本发明的优点在于：本发明提供的粪产碱菌ASAGF-0D1对OTA具有降解作用，降解产物为赭曲霉毒素α，毒性降低至少1000倍，无免疫毒性，OTA在大鼠体内的半衰期为103h，而赭曲霉毒素α缩短至9.6h。本发明提供的粪产碱菌ASAGF-0D1或其细胞内溶物对赭曲霉毒素A的降解率均可达到100％，且降解反应为不可逆的生物降解。此外，本发明提供的粪产碱菌ASAGF-0D1 可用于制备赭曲霉毒素A的生物脱毒剂，可应用于大规模赭曲霉毒素A污染废弃物的脱毒处理。
附图说明
图1温度对粪产碱菌ASAGF-0D1脱毒率的影响。
图2不同处理对粪产碱菌ASAGF-0D1脱毒能力的影响。
图3 OTA标准品和经粪产碱菌ASAGF-0D1细胞內溶物处理的OTA样品的色谱图。注：A-內溶物；B-OTA标准品；C-经细胞內溶物处理的OTA样品。
图4经粪产碱菌ASAGF-0D1內溶物处理的OTA样品的总离子峰、OTα和OTA的提取离子图。注：A-总离子峰；B-OTα的提取离子图；C-OTA标准品的提取离子图。
图5经粪产碱菌ASAGF-0D1內溶物处理的OTA样品的OTα二级质谱图。图6粪产碱菌ASAGF-0D1的扫描电镜照片(×30000)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF-0D1分离、纯化与鉴定
从北京市昌平区北七家国家粮食局科学研究院中试基地中采集土样，以96孔深孔板为培养载体，采用微量富集培养方法，首先将样品在无菌水中制成菌悬液，以10％的接种量接种于OTA-LB液体培养基中，培养基中OTA终浓度为1μg/ml，培养7天后再以10％接种量移种，培养基中OTA浓度不变。经过连续5次移种后，检测OTA含量，以未接菌含相同OTA浓度的OTA-LB培养基为阴性对照。将具有降解OTA的菌悬液按稀释涂布法以合适的稀释度涂布在LB琼脂平板，30℃培养72h后，挑取分离程度良好且菌落形态不同的单菌落，在OTA浓度为1μg/ml的OTA-LB培养基中进行脱毒试验，检测OTA的含量，经过反复的筛选最终获得一株能够降解OTA的菌株，编号为0D-1。挑取0D-1单菌落于LB液体培养基中，培养至对数期中期时，用50％的甘油与培养物等体积混合后置于-80℃保存。其中LB培养基的配方：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，琼脂1.5％，加蒸馏水至1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
采用形态学、生理生化和16S rDNA序列分析等分类法对降解菌株进行分 类鉴定。
0D1的形态学特征和生理生化特性见表1。
16S rDNA序列分析：利用引物27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增，长度为1460bp的16S rDNA序列(16S rDNA如序列表中SEQ ID No.3所示)与Genbank数据库中已有序列进行BLAST比对，该序列与粪产碱菌16S rDNA同源性很高(99.0％)。
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)对革兰氏阴性好氧菌的描述，结合0D-1形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，将该菌鉴定为Alcaligenes faecalis。
本发明0D-1菌株已于2016年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.12100。实施例2赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素α的检测方法
HPLC-FLD检测方法：
检测方法参照Bragulat et al.(Bragulat,M.,Abarca,M.,&F.(2001).An easy screening method for fungi producing ochratoxin A in pureculture.Int J Food Microbiol,71(2),139-144.)的方法并改进。具体如下：吸取600μL样品，于14000r/min下离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，用HPLC-FLD进行分析或将样品于4℃保存。
检测条件:Agilent 5TC-C18(2)反相色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈:水:乙酸(57:41:2)；等度洗脱，流速：1mL/min，进样量：20μL；柱温：30℃；；激发波长330nm，发射波长460nm。
UPLC-MS/MS检测方法：
色谱条件：Waters Cortecstm UPLC C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.6μm)，流动相A为甲醇，B为含0.1％甲酸和1mM乙酸铵的水溶液，洗脱梯度：0～2min，90％B；2～3min，90％B～80％B；3～4min，80％B～79％B；4～5min，79％B～74％B；5～7min，74％B；7～10.5min，74％B～40％B；10.5～13.5min，40％B；13.5～14.5min，40％B～5％B；14.5～17min，5％B；17～18min，5％B～90％B；18～21min，90％B；进样量：2μL；流速：0.3mL/min；柱温：40℃。
质谱条件：加热电喷雾离子源(HESI)温度为300℃；毛细管电压为3.2kV；离子传输管温度为320℃；鞘气为35unit，辅助气为10unit；full scan/ddms2扫 描模式：采集范围为200～800Da，正离子采集；一级质谱分辨率为70000FWHM，二级质谱分辨率为17500FWHM；碰撞池能量(NCE)为35eV；tSIM扫描模式：正离子采集，分辨率70000FWHM，质荷比宽度为4Da。
实施例3粪产碱菌ASAGF-0D1用于降解赭曲霉毒素A
粪产碱菌ASAGF-0D1培养：挑取粪产碱菌ASAGF-0D1(保藏号：CGMCC No.12100)单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，培养温度30℃，转速220r/min，培养时间30h。发酵结束后，将发酵液保存于4℃备用。
取制备的粪产碱菌ASAGF-0D1发酵液50μL，接种于50mL OTA-LB培养基中，培养温度为30和37℃每隔12h取样测定OTA含量并计算脱毒率。试验重复至少3次。
其中LB培养基的配方：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，琼脂1.5％，加蒸馏水至1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
其中OTA-LB培养基制备方法：将一定体积的赭曲霉毒素A母液(0.1mg/mL)转移至无菌三角瓶中，用氮吹仪于50℃下吹干，加入一定体积的LB培养基充分溶解，配成赭曲霉毒素A终浓度为1μg/mL的OTA-LB培养基后按需分装。
其中OTA的HPLC-FLD检测方法参见实施例2。
检测结果：37℃下培养时，粪产碱菌ASAGF-0D1反应36h，降解率为100％；25℃下培养时，反应36h，降解率为71％，反应48h，降解率为98％，反应72h，降解率为100％。(图1)
实施例4粪产碱菌ASAGF-0D1降解机理的初步研究
粪产碱菌ASAGF-0D1培养：取实施例3中的制备的粪产碱菌ASAGF-0D1发酵液50μL，接种于50mL LB液体培养基中，培养温度30℃，转速220r/min，培养时间30h。所述发酵培养基的配方：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，琼脂1.5％，加蒸馏水至1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。发酵结束后，将发酵液保存于4℃备用。
取上述粪产碱菌ASAGF-0D1发酵液，离心(8000r/min，4℃，10min)，分别收集菌体和上清。收集的菌体用0.85％生理盐水冲洗2次后重悬(108～109CFU/mL)，分为3等份，一份不做任何处理，一份使用高压灭菌锅灭活(121℃，20min)，一份使用高压均质机均质破碎(30kpsi，4℃)后离心(12000r/min，4℃，10min)，收集上清液，得到细胞內溶物。
发酵液上清降解赭曲霉毒素A：取200μL的赭曲霉毒素A，使用氮吹仪吹 干后，加入20mL的发酵液上清溶解(OTA终浓度为1μg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h测定OTA的含量，并计算脱毒率。
菌体降解赭曲霉毒素A：取200μL的赭曲霉毒素A，使用氮吹仪吹干后，加入20mL的菌体悬液溶解(OTA终浓度为1μg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h测定OTA的含量，并计算脱毒率。
灭活菌体降解赭曲霉毒素A：取200μL的赭曲霉毒素A，使用氮吹仪吹干后，加入20mL灭活菌体溶液溶解(OTA终浓度为1μg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h测定OTA的含量，并计算脱毒率。
细胞內溶物降解赭曲霉毒素A：取200μL的赭曲霉毒素A母液，使用氮吹仪吹干后，加入20mL的內溶物溶解(OTA终浓度为1μg/mL)，在第0.6、12、24、36和48h测定OTA的含量，并计算脱毒率。
其中HPLC-FLD的检测方法参见实施例2。
检测结果：发酵液上清具有微弱的降解能力；灭活菌体没有降解OTA的能力；未经处理的菌体培养24h的降解率为59％，培养48h时，降解率为76％；细胞內溶物培养0.6h的降解率为100％，这说明降解赭曲霉毒素A的活性物质主要存在于菌体内。(图2)。
实施例5赭曲霉毒素A降解产物分析
以实施例5所述制备內溶物，取200μL的赭曲霉毒素A母液，使用氮吹仪吹干后，用20mL的內溶物溶解赭曲霉毒素A(终浓度为1μg/mL)，反应1h后用HPLC-FLD和UPLC-MS/MS检测分析。
检测结果：经HPLC-FLD检测OTA的保留时间为9.453min，反应1h，OTA降解率为100％；在4.824min出现一新峰，可能为OTA的降解产物(图3-A，3-B，3-C)，经UPLC-MS/MS分析，该峰的保留时间分别为10.54min(图4-C)，结合其二级质谱裂解碎片信息(图5)可以确定此为OTα的离子峰。因此，H1菌株的降解产物中确含OTα。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一株粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF-0D1，其保藏编号为CGMCC No.12100。
2.一种生物脱毒剂，它的活性成分为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF-0D1或其细胞内溶物，所述粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ASAGF-0D1保藏编号为CGMCCNo.12100。
3.根据权利要求2所述的生物脱毒剂，其特征在于，所述生物脱毒剂为液体型或固体型。
4.一种权利要求2所述的生物脱毒剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：将保藏编号为CGMCC No.12100的粪产碱菌ASAGF-0D1活化，多级扩培，当菌体处于稳定期时，收集发酵液，制得液体型生物脱毒剂；或
将保藏编号为CGMCC No.12100的粪产碱菌ASAGF-0D1活化，多级扩培，当菌体处于稳定期时，收集发酵液，然后破碎菌体，获得细胞内溶物，制得液体型生物脱毒剂。
5.根据权利要求4所述的生物脱毒剂的制备方法，其特征在于，该方法还包括将液体型生物脱毒剂制成固体型生物脱毒剂的步骤。
6.权利要求1所述的粪产碱菌ASAGF-0D1在降解赭曲霉毒素A中的应用。
7.权利要求2或3所述的生物脱毒剂在降解赭曲霉毒素A中的应用。
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