CN105837632A - 神经氨酸酶抑制剂及制备方法及在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

神经氨酸酶抑制剂及制备方法及在制备抗流感病毒药物中的应用 Download PDF

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CN105837632A CN201610338769.3A CN201610338769A CN105837632A CN 105837632 A CN105837632 A CN 105837632A CN 201610338769 A CN201610338769 A CN 201610338769A CN 105837632 A CN105837632 A CN 105837632A
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Abstract

本发明公开了神经氨酸酶抑制剂及制备方法及在制备抗流感病毒药物中的应用。通式（Ⅰ）‑（Ⅲ）中任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药，

Description

神经氨酸酶抑制剂及制备方法及在制备抗流感病毒药物中的 应用
技术领域
本发明涉及神经氨酸酶抑制剂及制备方法及在制备抗流感病毒药物中的应用。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒感染引起的急性呼吸道疾病，能在人或动物之间传播，是一种传染性极强、传播速度极快、散播范围广的疾病。流行性感冒是一种全球性的感染性疾病，严重影响着人类的正常生活，给人类社会的安定带来了极大的威胁，造成了难以估量的经济和生命损失。20世纪出现了多次流感大爆发，导致了数以万计的人死亡。目前为止，人类对流感病毒的预防和治疗主要是通过流感疫苗和药物。但流感病毒的亚型较多，容易发生变异；而且疫苗的开发与生产至少需要半年的时间，这都造成流感疫苗难以有效预防流感和控制疫情。因此研究开发流感病毒防治药物显得格外重要，受到了全球范围的高度重视，成为抗病毒药物研究开发的重点。
目前，在抗病毒药物研发领域，关于神经氨酸酶抑制剂的研究最为成熟，相对于其它抗流感病毒药物，神经氨酸酶抑制剂最为有效和安全，并且对所有流感病毒亚型均有良好的治疗效果。因此，抗流感病毒神经氨酸酶抑制剂的设计与合成一直都是人们研究的热点。Von Itzstein M等人在专利WO9116320中，及Colman PM等人在WO9206691中公开了与神经氨酸酶结合的化合物，并表明其具有体内抗病毒活性。美国Gilead Sciences公司在专利WO9626933中公开了可作为神经氨酸酶抑制剂的六元环化合物。此外，Xu等对近年来发展的神经氨酸酶抑制剂做了综述(Curr.Med.Chem.2007,14,2872-2891；J.Int.Pharm.Res.2010,37,241-248)。
迄今为止，已经上市的神经氨酸酶抑制剂药物有四种，分别是葛兰素史克公司1999年上市的扎那米韦(zanamivir，GG167)，罗氏公司1999年上市的奥司他韦(oseltamivir，GS4104)，2010年在日本上市的帕拉米韦(peramivir，RMJ270201)和拉尼米韦(laninamivir)。为了更好地应对流感病毒的变异，开发新型抗流感病毒神经氨酸酶抑制剂显得异常重要。然而，公开的文献中，未见有扎那米韦前体C-4位氨基磷酰化物、奥司他韦C-5位氨基磷酰化物以及帕拉米韦前体C-4位氨基磷酰化物的合成及其对流感病毒神经氨酸酶抑制活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供神经氨酸酶抑制剂及制备方法及在制备抗流感病毒药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
通式(Ⅰ)-(Ⅲ)中任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药，
其中：
R1和R2各自独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、正丁基、苯基和取代苯基中的一种。
所述的化合物具体选自中的任一种：
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二甲氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二异丙氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二丁氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(亚磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二甲氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二乙氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(1S,2S,3S,4R)-3-[(R)-1-乙酰氨基-2-乙基-丁基]-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-羟基-环戊烷-1-甲酸。
所述的药学上可接受的盐是由所述化合物中的碱性基团通过与有机酸或无机酸反应转换而成的盐。
所述的无机酸包括下列物质中的至少一种：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸；所述的有机酸包括下列物质中的至少一种：乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苯磺酸。
一种药物组合物，包括下列物质中的至少一种：a)化合物、b)该化合物在药学上可接受的盐、c)该化合物的水合物、d)该化合物的溶剂合物、e)该化合物的多晶型物、f)该化合物的互变异构体、g)该化合物的前药；其中，所述的化合物为所述的通式(Ⅰ)-(Ⅲ)中任一项所示的化合物。
还包括辅料。
所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
通式(Ⅰ)-(Ⅲ)所示的至少一种化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药在制备抗流感病毒药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明所述化合物经测定具备一定抑制流感病毒活性，有望用于制备抗流感病毒药物。
具体实施方式
通式(Ⅰ)-(Ⅲ)任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药，
其中：
R1和R2各自独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、正丁基、苯基和取代苯基中的一种。
优选的，所述的化合物具体选自下列物质中的任一种：
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二甲氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二异丙氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二丁氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(亚磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二甲氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二乙氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(1S,2S,3S,4R)-3-[(R)-1-乙酰氨基-2-乙基-丁基]-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-羟基-环戊烷-1-甲酸。
所述的药学上可接受的盐是由所述化合物中的碱性基团(例如胺基)通过与有机酸或无机酸反应转换而成的盐。
优选的，所述的无机酸包括下列物质中的至少一种：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸；所述的有机酸包括下列物质中的至少一种：乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苯磺酸。
优选的，一种药物组合物，包括下列物质中的至少一种：a)化合物、b)该化合物在药学上可接受的盐、c)该化合物的水合物、d)该化合物的溶剂合物、e)该化合物的多晶型物、f)该化合物的互变异构体、g)该化合物的前药；其中，所述的化合物为上述通式(Ⅰ)-(Ⅲ)任一项所示的一种化合物；
进一步优选的，所述的化合物为前述具体化合物中的至少一种；
还包括辅料。
所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
本发明的药物组合物可制成各种剂型：按照剂型的分散系统进行分类：具体来说，可以制成以下剂型：溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬型、气体分散型、微粒分散型、固体分散型；按照形态分类，具体来说，可以制成以下剂型：液体剂型(如芳香水剂、溶液剂、注射剂、合剂、洗剂、搽剂等)，气体剂型(如气雾剂、喷雾剂等)，固体剂型(如散剂、丸剂、片剂、膜剂等)，半固体剂型(如软膏剂、栓剂、糊剂等)；按照给药途径分类：具体来说，可以制成以下剂型：经胃肠道给药的剂型、不经胃肠道给药的剂型。
通式(Ⅰ)-(Ⅲ)任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药在制备抗流感病毒药物中的应用。
优选的，前述具体化合物中的至少一种或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药在制备神经氨酸酶抑制剂中的应用；
优选的，前述具体化合物中的至少一种或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药在制备抗流感病毒药物中的应用。
化学试剂与仪器
核磁共振波谱在Bruker Avance 400核磁共振仪上测定，ppm为化学位移(δ)的单位，除特殊说明外，以TMS为内标。ESI-HRMS用Finnigan Shimadazu LCMS-IT-TOF测定；ESI-MS在Agilent 6120液-质联用仪器上测定。旋光度用Perkin-Elmer Polarimter 341自动旋光仪测得，格式以(浓度g/100mL溶剂)方式。
正相柱层析硅胶采用青岛海洋化工公司生产的硅胶(200-300目)，反相柱层析硅胶为北京慧德易科技有限责任公司的C18硅胶。TLC使用GF254高效硅胶板，检测方法有紫外灯、碘缸、高锰酸钾显色剂和DNP显色剂等。
反应所用溶剂均为AR级。试剂未经说明，均是购买后直接使用。溶剂纯化方法参照Purification of Laboratory Chemicals,Butterworth Heinemann:Oxford,1997。反应试剂由上海阿拉丁试剂、Alfa Aesar、百灵威、Sigma Aldrich等试剂公司生产。
实施例1(2S,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二甲氧基磷酰氨基)-2-[(2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸的制备
1、(2S,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-氨基-2-[(2R)-1,2,3-三乙酰氧基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸甲酯A的制备
制法参见：J.Chem.Perkin Trans I 1995,1173-1180.具体操作如下：初始原料唾液酸1在氯化氢的甲醇溶液中，进行酯化反应得到化合物2；化合物2在吡啶溶液中，用DMAP作为催化剂和乙酸酐反应得到五乙酰化产物3；化合物3在乙酸乙酯中，用TMSOTf关环得到化合物4；化合物4在TMSN3作用下得到化合物5，化合物5经过催化还原得到化合物A。
2、(2S,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二甲氧基磷酰氨基)-2-[(2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸2-3的制备
0℃下，将亚磷酸二苯酯(234mg,1mmol)溶于四氯化碳(3mL)中，10min后慢慢加入三乙胺(1mL)和A(100mg，0.2mmol)的混合物，保持0℃反应1h，反应基本完全，柱层析分离得化合物B，产率56％。将化合物B溶于1N NaOH(1mL)和MeOH(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，脱除溶剂，柱层析分离得化合物2-3，产率86％。白色固体，熔点：163.7-165.2℃.(c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,D2O)δ:6.03(s,1H),4.34(d,J＝9.4Hz,1H),4.10(d,J＝7.8Hz,2H),3.92(m,2H),3.74(dd,J＝21.6,10.7Hz,8H),2.10(s,3H).31P NMR(162MHz,D2O)δ:12.57.13CNMR(100MHz,D2O)δ:174.54,165.42,143.80,112.98,76.49,69.90,68.03,63.04,53.88,50.17,48.99,22.18.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+calcd.for[C13H23N2O10PNa]:421.0983；found421.0998.
实施例2(2S,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-[(2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸2-1的制备
0℃下，将亚磷酸二乙酯(138mg,1mmol)溶于四氯化碳(3mL)中，10min后慢慢加入三乙胺(1mL)和A(100mg,0.2mmol)的混合物，保持0℃反应1h。反应基本完全，柱层析分离得化合物C，产率88％。将产物C溶于1N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后，加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，旋干滤液得化合物2-1，产率85％。白色固体，熔点：166.3-167.8℃. (c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,D2O)δ:5.86(d,J＝1.9Hz,1H),4.24(d,J＝10.0Hz,1H),4.02(m,4H),3.84(m,3H),3.61(t,J＝8.1Hz,3H),2.03(d,J＝3.0Hz,3H),1.27(dd,J＝12.6,6.0Hz,6H).31P NMR(162MHz,D2O)δ:10.04.13C NMR(100MHz,MeOD)δ:174.57,166.95,147.13,111.84,78.29,71.25,70.19,64.91,64.03,51.44,50.84,22.95,16.51.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+calcd.for[C15H27N2O10PNa]:449.1296；found 449.1296.
实施例3(2S,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二异丙氧基磷酰氨基)-2-[(2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸2-2的制备
0℃下，将亚磷酸二异丙酯(166mg,1mmol)溶于四氯化碳(3mL)中，10min后慢慢加入三乙胺(1mL)和A(100mg,0.2mmol)的混合物，保持0℃反应1h。反应基本完全后，柱层析分离得化合物D，产率63％。将化合物D溶于1N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后，加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，旋干滤液得化合物2-2，收率66％。白色固体，熔点：170.2-171.4℃. (c＝0.5,MeOH).1HNMR(400MHz,D2O)δ:6.00(s,1H),4.55(m,2H),4.29(d,J＝10.0Hz,1H),4.08(m,2H),3.89(dd,J＝16.5,8.0Hz,2H),3.65(d,J＝8.2Hz,2H),2.07(s,3H),1.30(d,J＝6.3Hz,12H).31PNMR(162MHz,D2O)δ:7.83.13C NMR(100MHz,D2O)δ:174.44,165.84,144.01,112.93,76.58,73.33,73.27,69.96,68.17,63.13,50.38,48.98,23.04,23.01,22.97,22.37.HRMS(ESI):m/z[M-H]-calcd.for[C17H30N2O10P]:453.1644；found 453.1649.
实施例4(2S,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二丁氧基磷酰氨基)-2-[(2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸2-4的制备
0℃下，将亚磷酸二丁酯(194mg,1mmol)溶于四氯化碳(3mL)中，10min后慢慢加入三乙胺(1mL)和A(100mg,0.2mmol)的混合物，保持0℃反应1h。反应基本完全后，柱层析分离得化合物E，产率48％。将化合物E溶于1N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后，加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，旋干滤液得化合物2-4，收率60％。白色固体，熔点：173.5-174.8℃.(c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,D2O)δ:5.76(s,1H),4.17(d,J＝10.0Hz,1H),3.92(d,J＝7.6Hz,6H),3.80(m,2H),3.54(d,J＝8.2Hz,2H),1.97(s,3H),1.57(d,J＝6.0Hz,4H),1.30(s,4H),0.83(d,J＝6.7Hz,6H).13C NMR(100MHz,D2O)δ:174.30,167.11,145.61,110.81,76.16,69.80,68.14,67.50,63.05,50.34,31.64,31.57,22.22,18.20,12.82.HRMS(ESI):m/z[M-H]-calcd.for[C19H34N2O10P]:481.1957；found 481.1966.
实施例5(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3，4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸2-5的制备
将化合物B(66mg,0.1mmol)溶于2N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，脱除溶剂经反相硅胶柱层析分离得化合物2-5，收率75％。白色固体，熔点：180.3-182.1℃. (c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,D2O)δ:7.40(t,J＝7.8Hz,2H),7.21(m,3H),5.69(s,1H),4.36(m,2H),4.20(d,J＝7.1Hz,1H),3.96(dd,J＝16.5,7.9Hz,1H),3.91(d,J＝11.9Hz,1H),3.68(m,2H),2.09(s,3H).31P NMR(162MHz,D2O)δ:-2.84.13C NMR(100MHz,D2O)δ:174.86,168.47,152.32,150.68,129.62,123.74,120.44,99.94,75.06,69.67,67.84,63.04,50.19,45.92,22.13.HRMS(ESI):m/z[M-H]-calcd.for[C13H222N2O10P]:445.1018；found 445.0976.
实施例6(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(亚磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸2-6的制备
将产物B(66mg,0.1mmol)溶于2N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，将酸性滤液仍置于室温下搅拌96h，过滤除去树脂，脱除溶剂经反相硅胶柱层析分离得化合物2-6，收率65％。白色固体，熔点：176.5-178.3℃.(c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,D2O)δ:6.04(s,1H),4.46(d,J＝6.0Hz,1H),4.42(d,J＝6.7Hz,1H),4.33(d,J＝5.9Hz,1H),3.94(dd,J＝21.2,9.6Hz,2H),3.75(d,J＝9.2Hz,1H),3.70(dd,J＝11.6,5.6Hz,1H),2.11(d,J＝5.7Hz,3H).13C NMR(100MHz,D2O)δ:174.95,164.46,146.27,104.70,75.76,69.83,67.60,62.97,49.75,45.68,22.27.HRMS(ESI):m/z[M-H]-calcd.for[C11H18N2O10P]:369.0705；found 369.0366.
实施例7(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二甲氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸2-8的制备
0℃下，将亚磷酸二苯酯(234mg,1mmol)溶于四氯化碳(3mL)中，10min后慢慢加入三乙胺(1mL)和市售奥司他韦原料药F(82mg,0.2mmol)的混合物，保持0℃反应1h。反应基本完全后，柱层析分离得化合物G，产率48％。将化合物G溶于2N NaOH(1mL)和MeOH(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，脱除溶剂柱层析分离得化合物2-8，收率45％。白色固体，熔点：208.4-209.8℃.(c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,MeOD)δ:6.77(s,1H),4.10(d,J＝8.6Hz,1H),3.85(td,J＝10.6,6.3Hz,1H),3.68(ddd,J＝22.5,10.0,6.0Hz,6H),3.40(m,1H),3.24(dd,J＝13.3,7.5Hz,1H),2.79(dd,J＝17.7,5.3Hz,1H),2.27(ddt,J＝27.1,22.6,9.9Hz,1H),2.00(s,3H),1.52(m,4H),0.91(dt,J＝12.6,7.4Hz,6H).31P NMR(162MHz,MeOD)δ:11.74.13C NMR(100MHz,MeOD)δ:174.07,169.38,138.97,130.63,83.74,77.38,56.87,53.95,52.13,34.64,27.03,23.18,9.74.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+calcd.for[C16H29N2O7PNa]:415.1605；found 415.1594.
实施例8(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸2-9的制备
将G(54mg,0.1mmol)溶于2N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，脱除溶剂经反相硅胶柱层析分离得化合物2-9，收率45％。白色固体，熔点：218.7-220.3℃. (c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,D2O)δ:7.40(t,J＝7.8Hz,2H),7.19(m,3H),6.38(s,1H),4.18(d,J＝8.6Hz,1H),3.77(m,1H),3.51(m,1H),3.26(qd,J＝10.3,5.3Hz,1H),2.69(dd,J＝17.5,5.0Hz,1H),2.22(m,1H),1.89(s,3H),1.49(m,4H),0.87(dt,J＝25.4,7.3Hz,6H).31P NMR(162MHz,D2O)δ:3.50.13C NMR(100MHz,D2O)δ:175.30,174.78,152.57,131.83,129.66,123.55,120.29,83.88,77.30,56.38,51.21,35.15,25.57,25.31,22.38,8.60.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+calcd.for[C20H29N2O7PNa]:463.1605；found 463.1589.
实施例9(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二乙氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸2-7的制备
0℃下，将亚磷酸二乙酯(138mg,1mmol)溶于四氯化碳(3mL)中，10min后慢慢加入三乙胺(1mL)和市售奥司他韦原料药F(82mg,0.2mmol)的混合物，保持0℃反应1h。反应基本完全后，柱层析分离得化合物H，收率56％。将化合物H溶于1N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，脱除溶剂柱层析分离得化合物2-7，收率83％。白色固体，熔点：212.9-214.8℃.(c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,MeOD)δ:6.79(s,1H),4.11(m,1H),4.03(d,J＝7.3Hz,4H),3.86(dd,J＝10.8,8.5Hz,1H),3.44(m,1H),3.27(m,1H),2.79(dd,J＝17.8,5.2Hz,1H),2.30(m,1H),2.01(s,3H),1.50(m,4H),1.32(m,6H),0.92(dt,J＝10.8,7.4Hz,6H).31P NMR(162MHz,MeOD)δ:9.12.13C NMR(100MHz,MeOD)δ:173.97,169.33,138.91,130.59,83.70,77.28,64.27,56.73,52.02,34.54,27.29,26.83,23.26,16.76,16.38,9.76.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+calcd.for[C18H33N2O7PNa]:443.1918；found 443.1914.
实施例10((1S,2S,3S,4R)-3-[(R)-1-乙酰氨基-2-乙基-丁基]-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸的制备
1、(1S,2S,3S,4R)-3-[(R)-1-乙酰氨基-2-乙基-丁基]-4-胺基-2-羟基-环戊-1-羧酸甲酯I的制备
制法参见：J.Med.Chem.2001,44,4379-4392.具体方法如下：从手性原料(1R,4S)-6出发，经过盐酸甲醇溶液水解和(Boc)2O保护，得到化合物7；化合物7经过3+2环加成，得到化合物8；化合物8通过氢解作用，得到化合物9；化合物9经过乙酰化反应，得到化合物10；化合物10通过盐酸乙醚溶液脱去叔丁基氧羰基，得到化合物I。
2、(1S,2S,3S,4R)-3-[(R)-1-乙酰氨基-2-乙基-丁基]-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸2-10的制备
0℃下，将亚磷酸二乙酯(138mg,1mmol)溶于四氯化碳(3mL)中，10min后慢慢加入三乙胺(1mL)和I(60mg,0.2mmol)的混合物，保持0℃反应1h。反应基本完全后，柱层析分离得化合物J，产率56％。将化合物J溶于1N NaOH(1mL)和THF(1mL)的混合溶液中，常温下搅拌12h。反应完全后加入阳离子交换树脂调节溶液pH值至弱酸性，过滤除去树脂，脱除溶剂柱层析分离得化合物2-10，收率69％。白色固体，熔点：206.7-207.8℃.(c＝0.5,MeOH).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.34(d,J＝9.6Hz,1H),4.25(m,1H),4.02(m,4H),3.64(d,J＝9.6Hz,1H),3.50(s,1H),2.75(d,J＝6.4Hz,1H),2.44(dt,J＝12.9,8.4Hz,1H),2.07(d,J＝4.1Hz,1H),1.99(d,J＝12.1Hz,3H),1.93(s,1H),1.58(m,4H),1.28(dd,J＝11.9,6.2Hz,6H),0.81(dt,J＝14.6,7.3Hz,6H).31P NMR(162MHz,CDCl3)δ:8.43.13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:177.42,171.98,63.08,52.20,52.07,49.72,48.75,43.74,35.55,22.90,22.01,21.29,16.19,10.64.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd.for[C18H36N2O7P]:423.2255；found423.2251.
化合物对神经氨酸酶的抑制活性实验
1、试剂与材料
缓冲溶液：50mM Tris,5mM CaCl2,200mM NaCl,pH 7.5；野生H1N1神经氨酸酶和重组H1N1神经氨酸酶；底物：MUNANA；适用于荧光检测的96孔黑板；酶标仪(Tecan M 1000型)。
2、检测方法
1)将神经氨酸酶以缓冲溶液稀释至0.10ng/μL；
2)将底物用缓冲溶液稀释至400μM；
3)在96孔板中加入神经氨酸酶(50μL)，再加入待测化合物溶液(10μL)、缓冲液、混匀后37℃培养20min。加入底物(25μL)，混匀后用酶标仪检测荧光强度(激发光365nm、发射光445nm、带宽5nm)，从0min开始，间隔5min读取数据至90min。以不加药物的空白溶剂作为对照组。
4)抑制率计算
抑制率＝[1-(S-S0)/(C-C0)]×100％
S：90min时加药孔的荧光强度；S0：0min时加药孔的荧光强度；C：90min时对照孔的荧光强度；C0：0min时对照孔的荧光强度。
3、实验结果
我们选用野生型H1N1神经氨酸酶和重组H1N1神经氨酸酶(sH1N1Neuraminidase、rH1N1Neuraminidase,R&D Systems,Catalog#M8639)，MUNANA为底物，奥司他韦为阳性对照，选取新化合物2-1至2-10以荧光测定法对产物进行了初步活性测试(测试结果见表1)。酶水平的活性测试结果表明，我们合成的化合物均具有一定的抑制活性，尤其是化合物2-8对野生型H1N1神经氨酸酶的抑制活性几乎和奥司他韦相当，具有进一步研究开发价值。
表1化合物对流感病毒神经氨酸酶的抑制活性
a NA-sensitive enzyme(wild type)activity assay；b NA-resistant enzyme(mutanted)activity assay.
化合物的抗病毒活性测试
1、试剂与材料
病毒株：流感病毒A/HK/8/68(H3N2)和流感病毒A/WSN/33(H1N1)在鸡胚囊腔内培养传代，-80℃保存；样品溶解于DMSO配成适宜初始浓度，再用培养液3倍稀释，各8个稀释度；阳性对照药：奥司他韦。
2、实验方法
MDCK细胞接种96孔培养板，配置5％CO2，37℃培养24小时。加入流感甲型病毒10-5，37℃吸附2小时后去除病毒液，分别加入不同稀释度药物的维持液。同时设病毒对照和细胞对照，37℃培养待病毒对照组病变程度(CPE)达4小时以上观察各组细胞病变程度(CPE)(约36小时)，计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度(IC50)。
3、实验结果
我们选取部分新化合物进行了抗流感病毒实验，实验中以MDCK细胞为病毒宿主，奥司他韦为阳性对照药，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)，结果如表2。
表2化合物体外抗病毒活性结果
a MDCK cytopathic effect(CPE)protection assay for influenza A/HK/8/68(H3N2)(NA-sensitive,M2-sensitive)；b MDCK cytopathic effect(CPE)protectionassay for influenza A/WSN/33(H1N1)(NA-sensitive,M2-resistant).
表2结果显示，所有测试的化合物对流感病毒均具有一定的抑制活性，化合物2-5、2-6、2-9和2-10显示出更强的抑制活性。几乎所有的化合物对H3N2流感病毒(NA敏感，M2敏感)的抑制活性优于对H1N1流感病毒(NA敏感，M2不敏感)，且此类化合物对M2敏感型的流感病毒抑制效果更好。化合物2-6对H3N2流感病毒的抑制活性为0.121μM，几乎与阳性对照药物奥司他韦的抑制活性相当。

Claims (8)

1.通式（Ⅰ）-（Ⅲ）中任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药，
其中：
R1和R2各自独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、正丁基、苯基和取代苯基中的一种。
2.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）-（Ⅲ）中任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药，其特征在于：
所述的化合物具体选自中的任一种：
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二甲氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二异丙氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(二丁氧基磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(2R,3R,4S)-3-乙酰氨基-4-(亚磷酰氨基)-2-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙烷基]-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二甲氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-[羟基(苯氧基)磷酰氨基]-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-(二乙氧基磷酰氨基)-3-(3-戊氧基)环己烯-1-甲酸、
(1S,2S,3S,4R)-3-[(R)-1-乙酰氨基-2-乙基-丁基]-4-(二乙氧基磷酰氨基)-2-羟基-环戊烷-1-甲酸。
3.根据权利要求1或2所述的通式（Ⅰ）-（Ⅲ）中任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药，其特征在于：所述的药学上可接受的盐是由所述化合物中的碱性基团通过与有机酸或无机酸反应转换而成的盐。
4.根据权利要求3所述的通式（Ⅰ）-（Ⅲ）中任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药，其特征在于：所述的无机酸包括下列物质中的至少一种：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸；所述的有机酸包括下列物质中的至少一种：乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苯磺酸。
5.一种药物组合物，其特征在于：包括下列物质中的至少一种：a）化合物、b）该化合物在药学上可接受的盐、c）该化合物的水合物、d）该化合物的溶剂合物、e）该化合物的多晶型物、f）该化合物的互变异构体、g）该化合物的前药；其中，所述的化合物为权利要求1或2中所述的通式（Ⅰ）-（Ⅲ）中任一项所示的化合物。
6.根据权利要求5所述的一种药物组合物，其特征在于：还包括辅料。
7.根据权利要求5或6所述的一种药物组合物，其特征在于：所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
8.权利要求1或2中的所述的通式（Ⅰ）-（Ⅲ）中任一项所示的化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、互变异构体或前药在制备抗流感病毒药物中的应用。
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