CN105816492A - 明月草提取物的提取方法及用途 - Google Patents

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李金楠
刘祥
魏宏
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杨诚
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Abstract

本发明提供了明月草提取物的提取方法及用途。明月草提取物的提取方法包括：将称取的明月草新鲜叶片粉碎；将粉碎的明月草放入容器中，向所述容器中加入水，水的重量为明月草的6-10倍；加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第一滤液和滤渣；将所述滤渣和3-7倍重量的水加入所述容器中，加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第二滤液；合并所述第一滤液和所述第二滤液，得到第三滤液；以及对所述第三滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到第一干燥粉末。明月草提取物具有降血糖作用，对2型糖尿病有良好的抑制和治疗效果。

Description

明月草提取物的提取方法及用途
技术领域
本发明涉及中医药领域，更具体地，涉及明月草提取物的提取方法及用途。
背景技术
现如今，人们的生活质量逐渐提高，饮食条件和习惯发生着改变，使糖尿病的发病率逐年增高。糖尿病引起的高血糖以及一些慢性并发症增加了患者的痛苦，因此降低糖尿病患者血糖，缓解患者痛苦从而减轻国家负担是国内外学者一直关注的问题。由于现有的一些口服及注射的降糖药物副作用大并且容易产生依赖性，需要我们在中药领域里探寻疗效好副作用小的治疗药物。
发明人对许多治疗糖尿病的植物性中药进行了研究，发现菊科植物明月草在降糖方面具有显著疗效，是一种优异的降糖药物。
明月草茎叶中含有大量的藻胶素、甘露醇、维生素B、钾及多种氨基酸等营养元素，因而具有极强的降血压、降血脂、抗癌、抗菌、抑制胃酸分泌、抗溃疡、防血栓、抗过敏以及末梢血管扩张的作用，室内摆放还能起到杀菌净化空气的效果。
目前未见有人采用合适的提取工艺提取明月草并证实其有降血糖作用。
发明内容
本发明给出了一种明月草的提取工艺，并证明了采用该提取工艺得到的明月草提取物具有较好的降血糖作用。
本发明提供了一种明月草提取物的提取方法，包括：将称取的明月草新鲜叶片粉碎；将粉碎的明月草放入容器中，向所述容器中加入水，水的重量为明月草的6-10倍；加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第一滤液和滤渣；将所述滤渣和3-7倍重量的水加入所述容器中，加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第二滤液；合并所述第一滤液和所述第二滤液，得到第三滤液；以及对所述第三滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到第一干燥粉末。
在上述提取方法中，所述提取方法还包括：将所述第三滤液加入第二容器中，并且向所述第二容器加入无水乙醇，搅拌后放置，然后进行抽滤，得到第四滤液和沉淀物；以及对所述第四滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到第二干燥粉末。
在上述提取方法中，所述提取方法还包括：将所述第三滤液加入第二容器中，并且向所述第二容器加入无水乙醇，搅拌后放置，然后进行抽滤，得到第四滤液和沉淀物；以及对所述第四滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到第二干燥粉末，其中，所述提取方法还包括：对所述沉淀物进行冷冻干燥，得到第三干燥粉末。
在上述提取方法中，其中，所述减压浓缩的温度为40℃至50℃。
根据本发明的另一方面，提供了一种明月草提取物的提取方法，包括：将称取的明月草新鲜叶片粉碎；将粉碎的明月草放入容器中，向所述容器中加入95％乙醇，95％乙醇的重量为明月草的6-10倍；加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第一滤液和滤渣；将所述滤渣和5-10倍重量的95％乙醇加入所述容器中，加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第二滤液；合并所述第一滤液和所述第二滤液，得到第三滤液；以及对所述第三滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到干燥粉末。
在上述提取方法中，其中，所述减压浓缩的温度为40℃至50℃。
一种根据上述提取方法制得的明月草提取物。
一种上述明月草提取物在治疗2型糖尿病方面的应用。
明月草提取物的以上提取方法操作简单，成本低廉，适用于各种规模的明月草提取物的提取。此外，通过对葡萄糖相对消耗量、空腹血糖、糖耐量、脂代谢相关因素以及胰腺、肾脏和肝脏组织切片等各方面的研究表明，通过以上提取方法得到的明月草提取物，具有良好的降血糖作用，对2型糖尿病有良好地抑制和治疗效果。
附图说明
图1(a)和图1(b)示出了明月草提取物1-6、1-7、1-8、1-10的提取工艺流程图；
图2示出了由不同工艺得到的明月草提取物1-6、1-7、1-8、1-10对胰岛素抵抗HepG2细胞模型糖代谢的影响；
图3示出了不同浓度的MDC-TCM2对胰岛素抵抗HepG2细胞模型糖代谢的影响；
图4(1)至图4(3)示出了造模20天、药物干预2周以及4周后的小鼠空腹血糖的变化情况；
图5示出了受试药物干预期间不同组别的体重变化情况；
图6示出了药物干预4周后不同组别的葡萄糖耐量变化情况；
图7示出了药物干预4周后不同组别的脂代谢、GLP-1以及INS的变化情况；
图8(1)至图8(3)示出了药物干预4周后不同组别的胰腺、肾脏及肝脏的组织切片图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例一明月草提取物的制备
1.明月草水提物的制备
称取1.041kg明月草新鲜叶片，粉碎后置于10L圆底烧瓶中，加入8倍量纯净水，于电热套中加热回流提取1.5小时，趁热过滤；再将药渣和5倍量(5.205kg)纯净水加入10L圆底烧瓶，于电热套中加热回流2小时，趁热过滤。合并上述滤液，取11.86L(90％)提取液，于50℃减压浓缩，冷冻干燥至粉末状态，得26.3g干燥粉末，即样品1-6，流程图见图1(a)。
2.明月草水提物中不同类型成分的富集
取实施例1中所得的剩余10％明月草水提取液于5L烧杯中，加入3倍体积无水乙醇，充分搅拌后放置24小时，抽滤。滤液于45℃减压浓缩，冷冻干燥，得1.6g干燥粉末，即样品1-7；沉淀经冷冻干燥，得1.3g干燥粉末，即样品1-8，流程图见图1(a)。
3.明月草醇提取物的制备
称取0.913kg明月草新鲜叶片，粉碎后置于10L圆底烧瓶中，加入8倍量95％乙醇，于电热套中加热回流提取1.5小时，趁热过滤；再将药渣和5倍量(4.565kg)95％乙醇加入10L圆底烧瓶，于电热套中加热回流2小时，趁热过滤。合并上述滤液，于45℃减压浓缩，冷冻干燥，得17.1g干燥粉末，即样品1-10，流程图见图1(b)。
虽然以上实施例中仅以加热回流工艺作为提取方法，但这仅是实例，并不限制实施例的范围。除了使用加热回流之外，还可以使用本领域已知的冷浸、渗漉、煎煮或索氏提取的方法。
实施例二明月草提取物的药效实验
1.基于胰岛素抵抗模型的药物筛选
将处于对数生长期的HepG2细胞按104个/孔转入96孔细胞培养板并分为空白对照组、模型组、TZD(吡格列酮，Pioglitazone)组和4个明月草提取物组。模型组、TZD组以及明月草提取物组均加入地塞米松孵育，使其浓度达到0.5μM；24h后，向各组加入胰岛素(10nmol/L)，低糖无酚红DMEM培养基作用于模型组，匹格列酮(150μmol/L)、明月草提取物1-6(10mg/ml)、1-7(10mg/ml)、1-8(10mg/ml)、1-10(10mg/ml)分别作用于TZD组及4个明月草提取物组；24h后，测定培养基中葡萄糖的消耗量。以上标示的给药浓度均为细胞培养液的终浓度，每孔的细胞培养液体积均为200μL。
结果如图2所示，明月草提取物1-6、1-7、1-8、1-10均能提高葡萄糖相对消耗量，改善胰岛素抵抗，其中明月草提取物1-6对HepG2细胞的胰岛素抵抗改善最为显著，后续实验主要研究1-6的药效学作用，后面将明月草提取物1-6命名为MDC-TCM2。
2.基于胰岛素抵抗模型的MDC-TCM2的药效学研究
将处于对数生长期的HepG2细胞按104个/孔分为空白对照组、模型组、TZD组和5个不同浓度的MDC-TCM2组。模型组、TZD组以及MDC-TCM2组均加入浓度为0.5μM的地塞米松孵育；24h后，向各组加入胰岛素(10nmol/L)，低糖无酚红DMEM培养基作用于模型组，匹格列酮(150μmol/L)、MDC-TCM2(0.5mg/ml、1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml)分别作用于TZD组及5个不同浓度的MDC-TCM2组，以上标示的给药浓度均为细胞培养液的终浓度，每孔的细胞培养液体积均为200μL。24h和48h后，测定培养基中葡萄糖的消耗量。
结果如图3所示，在浓度从0.5mg/ml到10mg/ml的MDC-TCM2的作用下，葡萄糖相对消耗量随着MDC-TCM2浓度的升高而升高，胰岛素抵抗随其浓度的升高而改善。
3.MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响
健康的昆明小鼠40只，随机分为空白对照组10只，其余小鼠均喂食高脂饲料，20天后按照60mg/kg剂量腹腔注射0.1MpH＝4.5的无菌柠檬酸缓冲液配置的10mg/ml的链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)溶液，将这30只小鼠随机分为三组：模型组(蒸馏水，灌胃)、TZD组(用0.5％的羧甲基纤维素钠溶液配置的30mg/ml吡格列酮悬浊液，灌胃，30mg/kg)、MDC-TCM2组(用蒸馏水配置的100mg/mlMDC-TCM2溶液，灌胃，500mg/kg)，每天给药1次，连续给药四周，分别于两周和四周后隔夜禁食，尾静脉取血测空腹血糖；实验期间，从造模的前一天开始，每天定时对小鼠称重，连续记录48天。
由图4(1)可见，模型组、TZD组和MDC-TCM2组小鼠空腹血糖显著高于空白对照组；由图4(2)、(3)和表1可见，给药两周和四周后，TZD组和MDC-TCM2组的血糖值显著下降；由图5可见，空白对照组、模型组、TZD组及MDC-TCM2组小鼠体重均呈缓慢上升趋势，而MDC-TCM2组小鼠体重的上升趋势略低于其他组，因此我们推测MDC-TCM2的干预可能会影响到高脂饮食小鼠的脂肪代谢过程，可以起到控制小鼠体重的作用。
表1MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响
**与空白对照组比P<0.01
△△与模型组相比P<0.01
4.MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠糖耐量的影响
将实验3中给药四周后的小鼠禁食12-16h，继续给药一次，1h后尾静脉取血测空腹血糖，并灌胃葡萄糖溶液(2.5g/kg)，继续禁食，分别于给糖后0.5h、1h和2h尾静脉取血测血糖。以空腹血糖值为零时血糖，绘制血糖随时间变化曲线如图6，并计算血糖曲线下面积变化量，计算公式如下：
血糖曲线下面积＝1/2×(0小时血糖值+0.5小时血糖值)×0.5+1/2×(2小时血糖值+0.5小时血糖值)×1.5＝0.25×(0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时血糖值)
表2MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠糖耐量的影响
表3各组糖尿病小鼠的血糖曲线下面积
结果如图6所示，同空白对照组比较，模型组小鼠的血糖持续处于较高水平；TZD组及MDC-TCM2组小鼠的血糖水平较低，且在灌胃葡萄糖后0.5-2h期间，MDC-TCM2组小鼠的血糖下降趋势较TZD组明显。糖耐量结果显示，空白对照组、模型组、TZD组、及MDC-TCM2组的△糖面积分别为21.66h.mmol/L、45.20h.mmol/L、35.55h.mmol/L和34.31h.mmol/L，说明TZD组以及MDC-TCM2组使小鼠调节血糖能力增强。
5.MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠脂代谢相关指标的影响
将给药4周后的小鼠处死，眼球取血，离心取血清，保存于-80℃备用。使用相应的临床试检测试剂盒(生产厂商均为南京建成生物工程研究所，CHOL、TG、HDL-C和LDL-C的货号分别为F002-2、F001-2、F003-2和F004-2)检测小鼠血清中总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。具体实验方法参照试剂盒说明书。
表4MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠脂代谢相关指标的影响
结果如图7所示，与空白对照组比较，模型组小鼠CHOL、TG和LDL-C的水平增高，HDL-C的水平显著降低；TZD组和MDC-TCM2组小鼠血清中CHOL、TG及LDL-C的水平较模型组均显著降低，HDL-C的水平显著升高。
6.MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠血清INS的影响
将给药四周后的小鼠处死，眼球取血离心得血清，利用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(生产厂商为南京建成生物工程研究所，货号为H203)对小鼠血清胰岛素进行检测。
结果如图7所示，模型组小鼠血清INS水平显著高于空白对照组，而TZD组和MDC-TCM2组较模型组小鼠血清INS水平显著下降。
7.MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠GLP-1的影响
将给药四周后的小鼠处死，眼球取血离心得血清，利用小鼠胰高血糖素样肽ELISA试剂盒(生产厂商为南京建成生物工程研究所，货号为H183)对小鼠血清进行检测。
结果如图7所示，模型组小鼠胰高血糖素样肽水平显著高于空白对照组，而TZD组和MDC-TCM2组较模型组小鼠胰高血糖素样肽水平显著下降，接近空白对照组的水平。
表5MDC-TCM2对2型糖尿病小鼠INS和GLP-1的影响
8.胰腺、肾脏、肝脏的组织病理学分析
停止给药后眼球取血处死小鼠，取小鼠肝脏、肾脏以及胰腺用10％甲醛(福尔马林)固定液固定2d后，用流水冲洗组织块12h。标本脱水，石蜡包埋，切成4μm薄片，贴于载玻片上，37℃拷片。苏木精-伊红(HematoxylinandEosin，HE)染色，中性树胶封片。显微镜下观察组织病理变化，拍照。
结果如图8所示，图8(1)为胰腺组织切片，与空白对照组比较，模型组小鼠的胰腺组织明显缩小，而TZD组和MDC-TCM2组小鼠的胰腺组织有所恢复；图8(2)为肾脏组织切片，与空白对照组比较，模型组小鼠的肾脏出现明显的脂肪样变，MDC-TCM2组有所减轻，TZD组没有明显改善；图8(3)为肝脏组织切片，与空白对照组比较，模型组小鼠的肝脏出现严重的脂肪样变，而MDC-TCM2组和TZD组小鼠的肝脏脂肪样变略有减轻。
以上从葡萄糖相对消耗量、空腹血糖、糖耐量、脂代谢相关因素以及胰腺、肾脏和肝脏组织切片等方面均表明明月草提取物对2型糖尿病有抑制和治疗效果。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims (8)

1.一种明月草提取物的提取方法，包括：
将称取的明月草新鲜叶片粉碎；
将粉碎的明月草放入容器中，向所述容器中加入水，水的重量为明月草重量的6-10倍；
加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第一滤液和滤渣；
将所述滤渣和3-7倍重量的水加入所述容器中，加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第二滤液；
合并所述第一滤液和所述第二滤液，得到第三滤液；以及
对所述第三滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到第一干燥粉末。
2.根据权利要求1所述的提取方法，还包括：
将所述第三滤液加入第二容器中，并且向所述第二容器加入无水乙醇，搅拌后放置，然后进行抽滤，得到第四滤液和沉淀物；以及
对所述第四滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到第二干燥粉末。
3.根据权利要求2所述的提取方法，还包括：
对所述沉淀物进行冷冻干燥，得到第三干燥粉末。
4.根据权利要求1或2所述的提取方法，其中，所述减压浓缩的温度为40℃至50℃。
5.一种明月草提取物的提取方法，包括：
将称取的明月草新鲜叶片粉碎；
将粉碎的明月草放入容器中，向所述容器中加入95％乙醇，95％乙醇的重量为明月草的6-10倍；
加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第一滤液和滤渣；
将所述滤渣和5-10倍重量的95％乙醇加入所述容器中，加热回流1-3小时，趁热过滤，得到第二滤液；
合并所述第一滤液和所述第二滤液，得到第三滤液；以及
对所述第三滤液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到干燥粉末。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其中，所述减压浓缩的温度为40℃至50℃。
7.一种根据权利要求1、2、3和5中任一项所述的提取方法制得的明月草提取物。
8.一种根据权利要求7所述的明月草提取物在治疗2型糖尿病方面的应用。
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