CN105814199A - 修饰型脂肪酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供具有短链～中链脂肪酸选择性的来源于微生物的脂肪酶。在来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列中，进行以下的(1)或(2)的取代而得到修饰型脂肪酶，(1)将与序列号1表示的氨基酸序列的428位氨基酸相当的氨基酸取代为天冬酰胺，或(2)将与序列号1表示的氨基酸序列的429位氨基酸相当的氨基酸取代为苯丙氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸。

Description

修饰型脂肪酶及其用途
技术领域
本发明涉及修饰型脂肪酶。详细而言，本发明提供修饰型脂肪酶、和利用修饰型脂肪酶的乳制品的制造方法等。本申请主张基于2013年12月10日申请的日本国专利申请第2013－255419号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照援引入本申请说明书。
背景技术
脂肪酶被用于乳制品的风味生成、风味增强。传统使用来源于山羊羔、小牛或羊羔的脂肪酶制剂。这些来源于反刍动物的脂肪酶，具有从乳脂分离短链脂肪酸(C4、C6)的特异性，适合乳制品的风味生成。
但是，由于对用于食品加工的酶制剂要求犹太洁食、清真品质，针对动物来源脂肪酶的代替品存在强的产业要求。为了应对这一要求，提出了来源于微生物的酶的利用(例如专利文献1)、重组酶的利用(例如专利文献2)等。此外，为了适用于特定的用途，也尝试在基因工程上修饰脂肪酶(例如专利文献3～5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开昭61－135541号公报
专利文献2:美国专利申请公开第2004/0001819号说明书
专利文献3:日本特表2011－512809号公报
专利文献4:日本特表2003－524386号公报
专利文献5:日本特表2004－517639号公报
非专利文献
非专利文献1:J.Schmittetal.,ProteinEngineering,vol.15,no.7,pp.595-601,2002
发明内容
由于来源于微生物脂肪酶相比于短链脂肪酸对长链脂肪酸具有选择性，因此使其与乳脂作用时游离脂肪酸分布也是长链居多。由于长链的脂肪酸成为皂味的原因，因此，作为乳制品、特别是奶酪的风味而不优选。
基于以上背景，本发明的课题在于提供具有短链～中链脂肪酸选择性的、来源于微生物的脂肪酶及其用途。
在为了解决上述课题而进行研究的过程中，本发明人等着眼于来源于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶(使用了以前被称为来源于褶皱假丝酵母(Candidarugosa)的脂肪酶的产品)，尝试对其修饰。反复试验后，从构成底物口袋的氨基酸中，成功发现能够实现目的的非常有效的突变位置。对该突变位置实施特定的氨基酸取代的突变体，将乳脂水解，与动物来源脂肪酶同样地选择性游离短链～中链脂肪酸(C4～C8)。突变体很好地与短链脂肪酸(C4～C6)作用，最好地与C4的脂肪酸作用。因此，突变的结果是，成功使底物特异性接近于动物来源脂肪酶。应予说明，对于来源于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶，虽然报告了对其底物特异性有效的突变(氨基酸取代)(非专利文献1)，但是新发现的突变对于底物特异性(对于短链脂肪酸的选择性)的改变是有效的。
此处，对于氨基酸序列的同源性高的酶(典型的为同工酶)，鉴于立体结构(特别是活性部位、底物口袋等与活性相关的部位)的相似性高，同样的突变会产生同样的效果的可能性高这一技术常识，对于与实施例中使用的LIP1氨基酸同源性高的其他酶也能够使用同样的突变方法。
以下发明，主要是基于以上成果和考察而完成的。
[1]一种修饰型脂肪酶，其由在来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列中进行了以下(1)或(2)的取代的氨基酸序列构成，
(1)将与序列号1表示的氨基酸序列的428位氨基酸相当的氨基酸取代为天冬酰胺；
(2)将与序列号1表示的氨基酸序列的429位氨基酸相当的氨基酸取代为苯丙氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸。
[2]根据[1]记载的修饰型脂肪酶，其中，上述来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列是与序列号2的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列，并进行上述(1)的取代。
[3]根据[1]记载的修饰型脂肪酶，其中，上述来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列是与序列号2的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列，并进行上述(2)的取代。
[4]根据[2]或[3]记载的修饰型脂肪酶，其中，上述来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列是序列号2～7中任一个氨基酸序列。
[5]根据[1]记载的修饰型脂肪酶，其中，是由序列号8～11中任一个氨基酸序列构成。
[6]一种基因，其编码[1]～[5]中任一项记载的修饰型脂肪酶。
[7]根据[6]记载的基因，其含有序列号12～19中任一个碱基序列。
[8]一种重组DNA，其含有[6]或[7]记载的基因。
[9]一种微生物，其保有[8]记载的重组DNA。
[10]根据[9]记载的微生物，其中，宿主是大肠杆菌、柱状假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌。
[11]一种酶制剂，其含有[1]～[5]中任一项记载的修饰型脂肪酶。
[12]一种食品或食品原料的风味改善方法，其特征在于，使[1]～[5]中任一项记载的酶或[11]记载的酶制剂与食品或食品原料作用。
[13]一种食品的制造方法，其特征在于，使[1]～[5]中任一项记载的酶或[11]记载的酶制剂与食品原料或中间产物作用。
[14]根据[12]或[13]记载的方法，其中，食品是乳制品。
[15]一种用于与食品或食品原料作用的风味改善剂，其含有[1]～[5]中任一项记载的酶或[11]记载的酶制剂。
[16]一种食品或食品原料，是使[1]～[5]中任一项记载的酶或[11]记载的酶制剂作用而得到的。
附图说明
图1:酶处理后的游离脂肪酸组成。使来源于柱状假丝酵母的野生型脂肪酶LIP1与奶酪(底物)作用，分析游离脂肪酸组成。
图2:酶处理后的游离脂肪酸组成。使各种修饰型脂肪酶(突变体)与奶酪(底物)作用，比较游离脂肪酸组成。左上:使用来源于小牛舌下腺的脂肪酶。下:使用修饰型脂肪酶(突变体1:L428N、突变体2:G429F、突变体3:G429M、突变体4:G429I)。右上:使用已知的修饰型脂肪酶(L428F)。
图3:来源于柱状假丝酵母的野生型脂肪酶LIP1(序列号2)、LIP1'(序列号3)、LIP2(序列号4)、LIP3(序列号5)、LIP4(序列号6)、LIP5(序列号7)的序列的比较。
图4:图3的续图。
图5:图4的续图。
具体实施方式
为了说明的方便，对于与本发明相关而使用的术语的一部分作以下定义。
(术语)
术语“修饰型脂肪酶”，是指将特定的脂肪酶(为了说明的方便，称为“基准脂肪酶”)修饰或突变而得到的酶。基准脂肪酶是来源于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶或来源于褶皱假丝酵母(Candidarugosa)的脂肪酶。术语“来源于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶”和术语“来源于褶皱假丝酵母(Candidarugosa)的脂肪酶”能够交换使用。
术语“来源于柱状假丝酵母的脂肪酶”是指其起源是柱状假丝酵母的脂肪酶，包括柱状假丝酵母产生的脂肪酶、对柱状假丝酵母进行突变处理的酵母(突变株)产生的脂肪酶、或利用这些酶的遗传信息由其他微生物等表达的脂肪酶等。同样，术语“来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶”是指其起源是褶皱假丝酵母的脂肪酶，包括褶皱假丝酵母产生的脂肪酶、对褶皱假丝酵母进行突变处理的酵母(突变株)产生的脂肪酶、或利用这些酶的遗传信息由其他微生物等表达的脂肪酶等。
本发明中，作为修饰或突变，进行“氨基酸的取代”。因此，将修饰型脂肪酶和基准脂肪酶进行比较时，发现部分氨基酸残基不同。应予说明，本说明书中，将修饰型脂肪酶也称为修饰型酶或突变体。
本说明书中按照惯例，如以下所示，各氨基酸用1个字母表示。
甲硫氨酸:M、丝氨酸:S、丙氨酸:A、苏氨酸:T、缬氨酸:V、酪氨酸:Y、亮氨酸:L、天冬酰胺:N、异亮氨酸:I、谷氨酰胺:Q、脯氨酸:P、天冬氨酸:D、苯丙氨酸:F、谷氨酸:E、色氨酸:W、赖氨酸:K、半胱氨酸:C、精氨酸:R、甘氨酸:G、组氨酸:H
本说明书，按照惯例，将与翻译起始点对应的甲硫氨酸作为第1位，从N末端向C末端通过附带的编号确定各氨基酸的位置。因此，信号肽被切断的成熟体中，仅信号肽那部分，氨基酸编号提前。
本说明书中，将突变点的氨基酸残基(成为取代的对象的氨基酸残基)以表示氨基酸种类的上述1个字母和表示氨基酸位置的数字的组合来表达。例如，如果428位的甘氨酸是突变点，那么记为“G428”。
1.修饰型脂肪酶
本发明的第1方面涉及修饰型脂肪酶(修饰型酶)。本发明的修饰型酶具有在来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列中进行了以下(1)或(2)的取代的氨基酸序列。
(1)将与序列号1表示的氨基酸序列的428位氨基酸相当的氨基酸取代为天冬酰胺
(2)将与序列号1表示的氨基酸序列的429位氨基酸相当的氨基酸取代为苯丙氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸
序列号1的序列，是来源于柱状假丝酵母的脂肪酶LIP1的氨基酸序列(含有信号肽)。(1)的取代中，与该氨基酸序列的428位氨基酸相当的氨基酸成为取代对象，通过将该氨基酸取代为天冬酰胺来改变脂肪酶的底物特异性。(2)的取代中，与序列号1的序列的429位氨基酸相当的氨基酸成为取代对象，通过将该氨基酸取代为苯丙氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸来改变脂肪酶的底物特异性。氨基酸取代后的脂肪酶，即，修饰型酶对短链～中链脂肪酸(C4～C8)的选择性高，使其与乳脂作用时，典型地显示出与来源于小牛舌下腺的脂肪酶相似的游离脂肪酸组成。优选修饰型酶与短链脂肪酸(C4～C6)良好地作用，最优选与C4的脂肪酸良好地作用。
此处，本说明书中关于氨基酸残基使用的术语“相当”是指在被比较的蛋白质(酶)之间，对于其功能的发挥带来同等的贡献。例如，以在考虑一级结构(氨基酸序列)的部分同源性的基础上能够进行最佳的比较的方式，将比较对象的氨基酸序列相对于基准脂肪酶的氨基酸序列(序列号1的氨基酸序列)进行排列时(此时也可以根据需要导入空位将比对最优化)，可将与基准的氨基酸序列中特定的氨基酸对应的位置的氨基酸确定为“相当的氨基酸”。也可以代替一级结构之间的比较，或在此基础上通过立体结构(三维结构)之间的比较来确定“相当的氨基酸”。通过利用立体结构信息，可得到可靠性高的比较结果。此时，能够采用边比较多个酶的立体结构的原子坐标边进行比对的方法。突变对象酶的立体结构信息，例如能够从ProteinDataBank(http://www.pdbj.org/index_j.html)获得。
以下示出利用X射线结晶结构解析的蛋白质立体结构的确定方法的一例。
(1)将蛋白质结晶化。结晶化是为了进行立体结构确定不可缺少的，除此以外，作为蛋白质的高纯度的精制法、高密度下稳定的保存法也具有产业上的有用性。此时，可以将结合有底物或其类似化合物作为配体的蛋白质结晶化。
(2)对制作的结晶照射X射线收集衍射数据。应予说明，蛋白质结晶通过X射线照射受到破坏，衍射能力劣化的情形较多。此时，快速将结晶冷却至－173℃左右，在该状态下收集衍射数据的低温测定技术最近已经普及。应予说明，最终，为了收集用于结构确定的高分辨率数据，利用亮度高的同步辐射。
(3)在进行结晶结构解析中，除了衍射数据，还需要相位信息。对于目的蛋白质，近缘蛋白质的结晶结构未知时，利用分子取代法进行结构确定是不可能的，必须通过重原子同晶置换法解决相位问题。重原子同晶置换法，是将汞、铂等原子序号大的金属原子导入结晶，利用金属原子大的X射线散射能力对于X射线衍射数据的贡献而得到相位信息的方法。被确定的相位，通过将结晶中的溶剂区域的电子密度平滑化而能够改善。由于溶剂区域的水分子波动大几乎观测不到电子密度，因此，通过将该区域的电子密度近似为0，能够接近真正的电子密度，甚至能够改善相位。此外，非对称单元含有多个分子时，通过将这些分子的电子密度平均化能够更大幅改善相位。在使用这样得到改善的相位计算的电子密度图中将蛋白质模型拟合。该过程，在计算机绘图上，使用MSI公司(美国)的QUANTA等程序进行。然后，使用MSI公司的X-PLOR等程序，进行结构精密化，完成结构解析。对于目的蛋白质，在近缘蛋白质的结晶结构已知的情况下，使用已知蛋白质的原子坐标通过分子取代法能够确定。分子取代和结构精密化使用程序CNS_SOLVEver.11等能够进行。
作为来源于柱状假丝酵母的脂肪酶，已知5种酶(LIP1、LIP2、LIP3、LIP4、LIP5)。此外，本申请人从脂肪酶生产菌的突变株发现与LIP1具有高的同源性的酶(称为LIP1')。对于这6种酶，将去除信号肽的氨基酸序列(即，成熟体的氨基酸序列)示于序列号2(LIP1)、序列号3(LIP1')、序列号4(LIP2)、序列号5(LIP3)、序列号6(LIP4)、序列号7(LIP5)。典型地，这些酶的任意一个成为基准脂肪酶(通过对其实施取代得到修饰型酶的酶)。即，基准脂肪酶的氨基酸序列的具体例是序列号2～7的氨基酸序列。与来源于柱状假丝酵母的脂肪酶LIP1的氨基酸序列(序列号2)的同源性，在序列号3的氨基酸序列中是99％，在序列号4的氨基酸序列中是79％，在序列号5的氨基酸序列中是88％，在序列号6的氨基酸序列中是81％，在序列号7的氨基酸序列中是82％(图3～5)。
对于(1)的取代(将与序列号1的氨基酸序列的428位氨基酸相当的氨基酸进行取代)，也可以将由与序列号2的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列构成的酶作为基准脂肪酶。例如，LIP1、LIP1'、LIP2、LIP3、LIP4和LIP5属于该基准脂肪酶。优选使用具有与序列号2的氨基酸序列80％以上相同的氨基酸序列的酶(其中，仅局限于具有脂肪酶活性的酶)，更优选使用具有与序列号2的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列的酶(其中，仅局限于具有脂肪酶活性的酶)，更进一步优选使用具有与序列号2的氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列的酶(其中，仅局限于具有脂肪酶活性的酶)，最优选使用具有与序列号2的氨基酸序列99％以上相同的氨基酸序列的酶(其中，仅局限于具有脂肪酶活性的酶)作为基准脂肪酶。
在具有序列号2的氨基酸序列的LIP1中，与序列号1的氨基酸序列的428位氨基酸相当的氨基酸是第413位亮氨酸(L)。因此，将具有序列号2的氨基酸序列的LIP1作为基准脂肪酶时该氨基酸成为取代对象。另一方面，将具有序列号3的氨基酸序列的LIP1'作为基准脂肪酶时，取代对象的氨基酸变为序列号3的第413位氨基酸即亮氨酸(L)。将具有序列号4的氨基酸序列的LIP2作为基准脂肪酶时，取代对象的氨基酸变为序列号4的氨基酸序列的第413位氨基酸即亮氨酸(L)。将具有序列号5的氨基酸序列的LIP3作为基准脂肪酶时，取代对象的氨基酸变为序列号5的第413位氨基酸即亮氨酸(L)。将具有序列号6的氨基酸序列的LIP4作为基准脂肪酶时，取代对象的氨基酸变为序列号6的氨基酸序列的第413位氨基酸即亮氨酸(L)。将具有序列号7的氨基酸序列的LIP5作为基准脂肪酶时，取代对象的氨基酸变为序列号7的氨基酸序列的第413位氨基酸即亮氨酸(L)。
另一方面，对于(2)的取代(将与序列号1的氨基酸序列的429位氨基酸相当的氨基酸进行取代)，也可以将由与序列号2的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列构成的酶作为基准脂肪酶。例如，LIP1和LIP1'属于该基准脂肪酶。优选使用具有与序列号2的氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列的酶(其中，仅局限于具有脂肪酶活性的酶)，更优选使用具有与序列号2的氨基酸序列98％以上相同的氨基酸序列的酶(其中，仅局限于具有脂肪酶活性的酶)，最优选使用具有与序列号2的氨基酸序列99％以上相同的氨基酸序列的酶(其中，仅局限于具有脂肪酶活性的酶)作为基准脂肪酶。
在具有序列号2的氨基酸序列的LIP1中，与序列号1的氨基酸序列的429位氨基酸相当的氨基酸是第414位甘氨酸(G)。因此，将具有序列号2的氨基酸序列的LIP1作为基准脂肪酶时，该氨基酸成为取代对象。另一方面，将具有序列号3的氨基酸序列的LIP1'作为基准脂肪酶时，取代对象的氨基酸成为序列号3的第414位氨基酸即甘氨酸(G)。
此处，将修饰型酶的氨基酸序列的具体例示于序列号8～11。具有序列号8的氨基酸序列的修饰型酶(突变体1)是对具有序列号2的氨基酸序列的LIP1实施将第413位氨基酸取代为天冬酰胺(即(1)的取代)而得到的酶，具有序列号9的氨基酸序列的修饰型酶(突变体2)是对具有序列号2的氨基酸序列的LIP1实施将第414位氨基酸取代为苯丙氨酸(即(2)的取代之一)而得到的酶，具有序列号10的氨基酸序列的修饰型酶(突变体3)是对具有序列号2的氨基酸序列的LIP1实施将第414位氨基酸取代为甲硫氨酸(即(2)的取代之一)而得到的酶，具有序列号11的氨基酸序列的修饰型酶(突变体4)是对具有序列号2的氨基酸序列的LIP1实施将第414位氨基酸取代为异亮氨酸(即(2)的取代之一)而得到的酶。
而且，通常，在使某一蛋白质的氨基酸序列的一部分突变的情形中，有时突变后的蛋白质与突变前的蛋白质具有相同的功能。即有时氨基酸序列的突变对于蛋白质的功能不产生实质的影响，蛋白质的功能在突变前后被维持。如果考虑这一技术常识，在与上述修饰型酶(突变体1～4的任一个)进行比较时，虽然发现了氨基酸序列的细微差别(其中，氨基酸序列的差异是在实施上述氨基酸取代的位置以外的位置产生的)，但是没有发现特性上实质的差异，这可以视为与上述修饰型酶实质相同的酶。此处的“氨基酸序列的细微差别”是指，典型地通过构成氨基酸序列的1个～数个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的缺失、取代、或1个～数个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的追加、插入、或它们的组合而在氨基酸序列中产生突变(变化)。“实质相同的酶”的氨基酸序列和成为基准的上述修饰型酶的氨基酸序列的同源性(％)，例如为90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上，最优选为99％以上。应予说明，氨基酸序列的差异可以在多个位置产生。“氨基酸序列的细微差别”优选通过保守性氨基酸取代而产生。
2.编码修饰型脂肪酶的核酸等
本发明的第2方面提供与本发明的修饰型酶相关的核酸。即，本发明提供能够作为用于鉴定编码修饰型酶的基因、编码修饰型酶的核酸的探针使用的核酸，能够作为用于使编码修饰型酶的核酸扩增或突变等的引物使用的核酸。
编码修饰型酶的基因典型地被用于修饰型酶的制备。通过使用编码修饰型酶的基因的基因工程制备方法，能够得到更均匀状态的修饰型酶。此外，该方法在制备大量的修饰型酶时也是优选的方法。应予说明，编码修饰型酶的基因的用途不局限于修饰型酶的制备。例如，作为以阐明修饰型酶的作用机理等为目的的实验用工具，或作为用于设计或制作酶的进一步的修饰体的工具，也能够利用该核酸。
本说明书中“编码修饰型酶的基因”是指使其表达时得到该修饰型酶的核酸，当然包括具有与该修饰型酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，也包括在这样核酸中追加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。此外，也考虑了密码子的简并。
编码修饰型酶的基因的序列(碱基序列)的例子示于序列号12～15。这些序列，如下述所示，编码后述的实施例记载的突变体。
序列号12:突变体1(L428N)
序列号13:突变体2(G429F)
序列号14:突变体3(G429M)
序列号15:突变体4(G429I)
而且，柱状假丝酵母中CTG密码子编码丝氨酸。将其他酵母等作为宿主进行表达时，根据使用的宿主，需要将CTG密码子变更为编码丝氨酸的其他密码子(TCT、TCC、TCA、AGT或AGC)。本发明，作为异种表达用的基因序列，也提供了对序列号12～15中任一个序列实施这样的密码子取代的序列。以下示出实施密码子取代的序列的例子。
序列号16(序列号12的序列中进行密码子取代的序列)
序列号17(序列号13的序列中进行密码子取代的序列)
序列号18(序列号14的序列中进行密码子取代的序列)
序列号19(序列号15的序列中进行密码子取代的序列)
本发明的基因在宿主内表达时，通常以在上述序列(序列号5'末端侧追加编码信号肽的序列(信号序列)而成的基因构建体导入宿主。野生型的LIP1的信号序列示于序列号21。该序列编码的氨基酸序列(即信号肽)示于序列号22。信号序列可以根据宿主选择。只要是能够表达目的突变体的信号序列即可，本发明中均能够使用。能够利用的信号序列的例子，可例示:编码α-因子的信号肽的序列(ProteinEngineering,1996,vol9,p.1055-1061)、编码α-因子受体的信号肽的序列、编码SUC2蛋白质的信号肽的序列、编码PHO5蛋白质的信号肽的序列、编码BGL2蛋白质的信号肽的序列、编码AGA2蛋白质的信号肽的序列、编码TorA(三甲胺N－氧化还原酶)的信号肽的序列、编码来源于枯草芽孢杆菌的PhoD(磷酸酯酶)的信号肽的序列、编码来源于枯草芽孢杆菌的LipA(脂肪酶)的信号肽的序列、编码来源于米曲霉的高峰淀粉酶的信号肽的序列(日本特开2009－60804号公报)、编码来源于解淀粉芽孢杆菌的α－淀粉酶的信号肽的序列(Eur.J.Biochem.155,577-581(1986))、编码来源于枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的信号肽的序列(APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Apr.1995,p.1610-1613Vol.61,No.4)、编码来源于Bacillus属细菌的纤维素酶的信号肽的序列(日本特开2007－130012号公报)。
本发明的核酸可通过将本说明书或添加的序列表公开的序列信息作为参考，使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生化学方法等，而制备成分离的状态。
本发明的其他实施方式中，提供与编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列进行比较时其编码的蛋白质的功能相同但一部分碱基序列不同的核酸(以下，也称为“相同核酸”。此外，将规定相同核酸的碱基序列也称为“相同碱基序列”)。作为相同核酸的例子，能够举出将编码本发明的修饰型酶的核酸的碱基序列作为基准由含有1个或多个碱基的取代、缺失、插入、追加、或颠倒的碱基序列构成的，编码具有修饰型酶特征性的酶活性(即脂肪酶活性)的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位发生。此处的“多个”因该核酸编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类不同而不同，例如是2～40碱基，优选为2～20碱基，更优选为2～10碱基。
以上这类相同核酸，例如通过限制性内切酶处理、利用核酸外切酶、DNA连接酶等的处理、利用位置指定突变导入法(MolecularCloning,ThirdEdition,Chapter13,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)、随机突变导入法(MolecularCloning,ThirdEdition,Chapter13,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)的突变导入等而得到。此外，通过紫外线照射等其他方法也能够得到相同核酸。
本发明的其他实施方式，涉及一种具有与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的再一其他实施方式，提供具有相对于编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列、或与之互补的碱基序列至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％相同的碱基序列的核酸。
本发明的再一其他实施方式，涉及一种具有对编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或与该相同碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下进行杂交的碱基序列的核酸。此处的“严格的条件”是指所谓的形成特异性的杂交、不形成非特异性杂交的条件。这类严格的条件是本领域技术人员公知的，例如可参照MolecularCloning(ThirdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)、Currentprotocolsinmolecularbiology(editedbyFrederickM.Ausubeletal.,1987)进行设定。作为严格的条件，例如，能够举出使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15MNaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在约42℃～约50℃下孵育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下清洗的条件。作为进一步优选的严格的条件，例如，能够举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15MNaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。
本发明的再一其他实施方式，提供具有编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列、或与之互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这类核酸片段能够用于对具有编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定、和/或扩增等。核酸片段，例如，以至少含有与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10～约100碱基长，优选为约20～约100碱基长，进一步优选为约30～约100碱基长)进行杂交的部分的方式进行设计。作为探针利用时，可将核酸片段标记化。标记化中，例如，能够使用荧光物质、酶、放射性同位元素。
本发明再一其他方面，涉及一种含有本发明的基因(编码修饰型酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA，例如，以载体的形态提供。本说明书中术语“载体”，是指能够将插入其的核酸运输至细胞等靶内的核酸性分子。
根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，此外考虑宿主细胞的种类来选择适当的载体。作为将大肠杆菌作为宿主的载体，能够例示M13噬菌体或其修饰体、λ噬菌体或其修饰体、pBR322或其修饰体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为将酵母作为宿主的载体，能够例示pYepSec1、pMFa、pYES2等，作为将昆虫细胞作为宿主的载体，能够例示pAc、pVL等，作为将哺乳动物细胞作为宿主的载体，能够例示pCDM8、pMT2PC等。
本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”，是指能够将插入其的核酸导入目的细胞(宿主细胞)内，且在该细胞内能够表达的载体。表达载体通常包括对插入的核酸的表达所需要的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也能够使用含有选择标记物的表达载体。使用该表达载体时，利用选择标记物能够确认表达载体有无导入(及其程度)。
本发明的核酸在载体中的插入、选择标记物基因的插入(需要时)、启动子的插入(需要时)等能够使用标准的重组DNA技术(例如，可参照MolecularCloning,ThirdEdition,1.84,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork的使用限制性内切酶和DNA连接酶的周知的方法)来进行。
作为宿主细胞，从处理容易的观点出发，能够使用曲霉(例如米曲霉)、芽孢杆菌属细菌(例如枯草芽孢杆菌)、大肠杆菌(大肠杆菌)、出芽酵母(酿酒酵母)等微生物，只要是重组DNA能够复制且修饰型酶的基因能够表达的宿主细胞则均能利用。可优选使用大肠杆菌(大肠杆菌)、出芽酵母(酿酒酵母)。也能够将假丝酵母属酵母(例如柱状假丝酵母)作为宿主。此外，也能够将毕赤属酵母(例如毕赤酵母菌)作为宿主。作为大肠杆菌的例子，利用T7系启动子时，能够举出大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，不是这种情况时能够举出大肠杆菌JM109。此外，作为出芽酵母的例子，能够举出出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22或出芽酵母INVSc1(Invitrogen公司)。
本发明的其他方面，涉及保有本发明的重组DNA的微生物(即转化体)。本发明的微生物，通过使用了上述本发明的载体的转染或转化而能够得到。例如，可通过氯化钙法(JournalofMolecularBiology(J.Mol.Biol.)、第53卷，第159页，(1970))，Hanahan法(JournalofMolecularBiology，第166卷，第557页(1983))、SEM法(Gene，第96卷，第23页(1990))，Chung等的方法(TheProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheU.S.A.，第86卷，第2172页(1989))、磷酸钙共沉降法、电穿孔(Potter,H.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、脂转染(Felgner,P.L.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))等来实施。此外，本发明的微生物能够用于生产本发明的修饰型酶。
3.含有修饰型脂肪酶的酶制剂
本发明的修饰型酶例如能够以酶制剂的形态提供。酶制剂，除有效成分(本发明的修饰型酶)外，可以含有赋形剂、缓冲剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂能够使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂能够使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂能够使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂能够使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂能够使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
4.修饰型脂肪酶的用途
本发明再一方面涉及修饰型酶和酶制剂的用途。本发明的修饰型酶，具有与动物来源脂肪酶近似的底物特异性，即，具有短链～中链脂肪酸选择性。本发明中，发挥该特性，将修饰型酶或酶制剂用于食品、食品原料等的风味改善。“风味改善”是指通过增强或赋予特定的风味成分，带来比本来的风味(即，不使用本发明时的风味)更好的风味。典型地，风味改善的结果是该食品或食品原料特征性的风味得到增强。也存在通过将不好的风味成分屏蔽来改善风味的情形。
作为能够使用本发明的食品或食品原料，可例示乳制品、人造奶油类(人造奶油、涂脂)、起酥油、冰激凌类(冰激凌、意式冰淇淋、冷冻酸奶、圣代冰淇淋、沐昔、软冰淇淋等)、冰糕、慕斯、巴伐利亚奶油、零食点心、调味品、汤、各种植物油(大豆油、菜籽油、玉米油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、葵花籽油、棉籽油等)。
例如，通过使本发明的修饰型酶或酶制剂与食品或食品原料作用能够实现风味的改善。另一方面，在食品的制造工序中在原料或中间产物中如果添加、混合本发明的修饰型酶或酶制剂等，那么能够制造风味改善的食品。或者通过添加、混合利用本发明的修饰型酶或酶制剂而得到的组合物等，可以改善食品或食品原料的风味。
本发明的修饰型酶或酶制剂，特别适合于乳制品的制造。通过使用本发明的修饰型酶或酶制剂，能够增强或改善乳制品的风味(特别是奶酪风味)。
作为能够使用本发明的修饰型酶或酶制剂的乳制品的例子，可举出奶酪(切斯特奶酪、切达乳酪、埃德姆芝士、高达奶酪、埃曼塔奶酪、帕尔玛奶酪、匹克利诺罗曼奶酪等)、加工奶酪(人工奶酪)、EMC(酶改性干酪，Enzymemodifiedcheese)、奶酪食品(将一种以上的天然奶酪或人工奶酪加工制造得到的奶酪，制品中的奶酪成分的重量为51％以上)、黄油、酸奶、奶油、涂脂、制备乳粉、调味料(例如，用于零食点心、调味品、汤等的调味料)。作为乳制品的主要原料的奶，例如是牛、绵羊、山羊等的奶。
本发明的修饰型酶或酶制剂，例如，在乳制品的制造过程中添加至原料或中间产物。由此，对原料或中间产物中的乳脂发挥酶作用，产生脂肪酸的游离。本发明的修饰型酶或酶制剂，在乳制品的制造过程中，可在各个阶段添加。使用的酶量(酶浓度)、温度条件、反应时间等可以通过预备实验确定。
实施例
A.新型脂肪酶的制作
以新型脂肪酶的制作为目的，进行以下研究。
1.目标·研究方针
着眼于以下方面进行研究。
(1)以与奶酪作用时产生与来源于小牛舌下腺的脂肪酶类似的游离脂肪酸组成的微生物脂肪酶的获得为目的。具体而言，尝试将脂肪酸特异性由长链变更为短链。
(2)通过使酶蛋白质的底物口袋变窄来改变底物特异性。
(3)通过将底物口袋内的氨基酸变为体积更大的氨基酸来将口袋变窄。
2.方法
(1)突变点的选择
从来源于柱状假丝酵母的脂肪酶LIP1的序列(含有信号肽的氨基酸序列示于序列号1，编码该氨基酸序列的基因的序列示于序列号20，不含有信号肽的成熟体的氨基酸序列示于序列号2)和登记在公共数据库的立体结构，选择与底物相互作用的氨基酸。具体而言，选择261位脯氨酸(P261)、319位亮氨酸(L319)、428位亮氨酸(L428)。应予说明，这些氨基酸残基，与Schmitt等的文献(非专利文献1:J.Schmittetal.,ProteinEngineering,vol.15,no.7,pp.595-601,2002)中的P246、L304和L413分别对应。
另一方面，着眼于通过提高口袋内的疏水性提高酯合成能力，通过计算机解析检索突变点，选择作为中性氨基酸的380位丝氨酸(S380)和429位甘氨酸(G429)。
(2)编码突变氨基酸序列的DNA序列的取得
使用毕赤酵母菌(Pichiapastoris)宿主表达系统(Invitrogen,PichiaExpressionKit)。质粒使用pPIC3.5K，作为模板的来源于柱状假丝酵母的LIP1基因中使用最适于出芽酵母(Saccharomycescerevisiae)的密码子序列。进行利用InversePCR法的突变导入(TOYOBO,KOD-Plus-MutagenesisKit)，制备编码在选择的突变点产生氨基酸取代的各种突变体的基因。将含有突变体LIP1基因的质粒转化至E.coliDH5α。接下来，从转化有含有突变体LIP1基因的质粒的E.coli提取。
(3)表达突变体氨基酸序列的转化体的取得
将含有突变体LIP1基因的质粒转化至毕赤酵母菌GS115(Invitrogen,PichiaExpressionKit)。培养得到的毕赤酵母菌转化体，从培养上清回收酶(突变体脂肪酶)。
(4)使用突变体脂肪酶的乳脂分解
底物使用将天然奶酪(YOUNGCHEDDARCHEESE)在磷酸缓冲液(pH6.8)中以重量比为1:1方式混悬·分散的而得的物质。反应条件设为50℃、16小时。各突变体脂肪酶的添加量设为相对于奶酪1g为蛋白量0.1mg。反应结束后，利用二乙醚提取奶酪中的游离脂肪酸，供于气相色谱。
针对超过10种的突变体脂肪酶进行评价，结果与野生型脂肪酶(图1)不同，发现了显示与来源于小牛舌下腺的脂肪酶类似的脂肪酸组成的突变体脂肪酶(突变体1:L428N、突变体2:G429F、突变体3:G429M、突变体4:G429I)(图2)。即，成功取得选择性游离短链～中链脂肪酸(C4～C8)的突变体脂肪酶。与乳脂作用时，突变体脂肪酶与短链脂肪酸(C4～C6)很好地作用，与C4的脂肪酸最好地作用。此处，突变体3，与来源于小牛舌下腺的脂肪酶相比短链脂肪酸特异性高这一点值得关注。为了比较，示出上述文献中报告的突变体L428F(文献中称为L413F)的结果(图2的右上)。突变体L428F中长链脂肪酸的游离比较多。应予说明，以下示出各突变体的氨基酸序列和编码其的基因的序列(为了与野生型对应，使用假丝酵母所特有的密码子)。
＜突变体1＞
氨基酸序列:序列号8
基因序列:序列号12
＜突变体2＞
氨基酸序列:序列号9
基因序列:序列号13
＜突变体3＞
氨基酸序列:序列号10
基因序列:序列号14
＜突变体4＞
氨基酸序列:序列号11
基因序列:序列号15
B.突变体脂肪酶在各种宿主中的表达
(1)在大肠杆菌中的表达
在质粒pET20b中导入突变体脂肪酶(G429M)基因。使大肠杆菌OrigamiB(DE3)作为宿主表达。得到的转化体在15℃的条件下培养40小时，得到菌体。菌体利用珠振荡器破碎，测定得到的提取液的活性。为了测定对于短链脂肪酸的活性，使用脂肪酶试剂盒S(DSPharmaBiomedical)。为了测定对于长链脂肪酸的活性，使用脂肪消化力LMAP法。最终，细胞提取液的活性，使用脂肪酶试剂盒S时为1.85u/mL、使用LMAP法时为0u/mL。
在质粒pCold-TF中导入突变体脂肪酶(G429M)基因。使大肠杆菌OrigamiB(DE3)作为宿主表达。得到的转化体利用LB培地在15℃的条件下培养40小时，得到菌体。菌体利用珠振荡器破碎。测定得到的提取液的活性。最终，细胞提取液的活性，使用脂肪酶试剂盒S时是3.95u/mL，使用LMAP法时是0u/mL。
如以上所示，能够表达短链脂肪酸特异性突变体脂肪酶(G429M)。
(2)在酵母(柱状假丝酵母)中的表达
使通过突变赋予营养需求性的柱状假丝酵母作为宿主，表达突变体脂肪酶(G429M)。得到的转化体在25℃的条件下培养48小时，测定培养上清的活性。为了测定对于短链脂肪酸的活性，使用FCCIII法。为了测定对于长链脂肪酸的活性，使用脂肪消化力LMAP法。最终，表达突变体脂肪酶(G429M)的柱状假丝酵母的培养上清的活性，使用FCCIII法时是470u/mL，使用LMAP法时是155u/mL(短链:长链＝3:1)。为了比较，测定不导入突变体脂肪酶基因的宿主的培养上清的活性，结果使用FCCIII法时是267u/mL，使用LMAP法时是599u/mL(短链:长链＝2:5)。
如以上所示，能够表达短链脂肪酸特异性突变体脂肪酶(G429M)。
(3)在丝状菌(米曲霉)中的表达
使通过突变赋予营养需求性的米曲霉作为宿主，使用淀粉酶启动子表达突变体脂肪酶(G429M)。得到的转化体在30℃的条件下培养76小时，测定培养上清的活性。为了测定对于短链脂肪酸的活性，使用FCCIII法。为了测定对于长链脂肪酸的活性，使用脂肪消化力LMAP法。最终，表达突变型脂肪酶(G429M)的米曲霉的培养上清的活性，使用FCCIII法时是39u/mL，使用LMAP法时是0u/mL。
如以上所示，能够表达短链脂肪酸特异性突变体脂肪酶(G429M)。
(4)在枯草菌(枯草芽孢杆菌)中的表达
将赋予普鲁兰酶启动子的突变体脂肪酶(G429M)基因导入质粒pHY300PLK。使枯草芽孢杆菌作为宿主表达。测定得到的转化体的培养液的活性。为了测定对于短链脂肪酸的活性，使用脂肪酶试剂盒S(DSPharmaBiomedical)。为了测定对于长链脂肪酸的活性，使用脂肪消化力LMAP法。最终，培养液的活性，使用脂肪酶试剂盒S时是0.3u/mL(以空载体转化的对照是0.1u/mL)，使用LMAP法时是0u/mL。
如以上所示，能够表达短链脂肪酸特异性突变体脂肪酶(G429M)。
本发明的修饰型脂肪酶具有短链～中链脂肪酸选择性。特别是，在奶酪或奶酪加工品等呈现奶酪风味的乳制品的制造中本发明的修饰型脂肪酶的利用价值高。
本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限制。在不脱离要求保护的范围的记载且本领域技术人员能够容易想到的范围内各种变形的实施方式也包含于发明。本说明书中明示的论文、公开专利公报、和专利公报等内容，其全部内容通过援引而引入本说明书。

Claims (16)

1.一种修饰型脂肪酶，其特征在于，由在来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列中进行以下(1)或(2)的取代而得的氨基酸序列构成，
(1)将与序列号1表示的氨基酸序列的428位氨基酸相当的氨基酸取代为天冬酰胺；
(2)将与序列号1表示的氨基酸序列的429位氨基酸相当的氨基酸取代为苯丙氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的修饰型脂肪酶，其中，所述来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列是与序列号2的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列，并进行所述(1)的取代。
3.根据权利要求1所述的修饰型脂肪酶，其中，所述来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列是与序列号2的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列，并进行所述(2)的取代。
4.根据权利要求2或3所述的修饰型脂肪酶，其中，所述来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的氨基酸序列是序列号2～7中任一个氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的修饰型脂肪酶，是由序列号8～11中任一个氨基酸序列构成的。
6.一种基因，其特征在于，编码权利要求1～5中任一项所述的修饰型脂肪酶。
7.根据权利要求6所述的基因，含有序列号12～19中任一个碱基序列。
8.一种重组DNA，其特征在于，含有权利要求6或7所述的基因。
9.一种微生物，其特征在于，保有权利要求8所述的重组DNA。
10.根据权利要求9所述的微生物，其中，宿主是大肠杆菌、柱状假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌。
11.一种酶制剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的修饰型脂肪酶。
12.一种食品或食品原料的风味改善方法，其特征在于，使权利要求1～5中任一项所述的酶或权利要求11所述的酶制剂与食品或食品原料作用。
13.一种食品的制造方法，其特征在于，使权利要求1～5中任一项所述的酶或权利要求11所述的酶制剂与食品原料或中间产物作用。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述食品是乳制品。
15.一种用于与食品或食品原料作用的风味改善剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的酶或权利要求11所述的酶制剂。
16.一种食品或食品原料，其特征在于，是使权利要求1～5中任一项所述的酶或权利要求11所述的酶制剂作用而得到的。
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