CN105814027A - 用于终末分化细胞和组织再生的新化合物 - Google Patents

用于终末分化细胞和组织再生的新化合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开新化合物及其用于药物的用途。优选该化合物用于治疗与哺乳动物中受损的分裂期后组织相关的疾病。新化合物为式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、前药或药学上可接受的盐其中?X为O(氧)或S(硫)，?R1为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、环烷基芳基和芳基环烷基，任选包含杂原子；?R2为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的C1?C6烷基、C1?C6烷氧基、C1?C6烷氧基烷基和C2?C6烯基；?R3为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、环烷基芳基和芳基环烷基，任选包含杂原子。

Description

用于终末分化细胞和组织再生的新化合物
本发明涉及用于分裂期后细胞和组织再生的噁唑羧酸酰胺和噻唑羧酸酰胺性质的新化合物。本发明还涉及包含这些化合物的药剂和药物组合物及其用于人药和兽药的用途。
在哺乳动物中，只有有限几种有能力在损伤后再生的器官和组织。具有这种(正常受限)能力的器官和组织是肝脏、骨骼或皮肤。
很多其它哺乳动物器官和组织不能在损伤后再生，例如心脏、脑、骨骼肌。原因是这些器官和组织中的相应细胞不可逆地离开细胞周期，并且保持在终末分化态。因此，例如，心肌梗塞(心脏)或中风(脑)导致受影响组织的不可逆损伤。
另外，哺乳动物的眼和内耳的感觉上皮没有在损伤后再生的能力。在内耳的情况下，这种损伤常常例如造成人的重听，它明显与生活品质下降相关。
在此背景中，估计工业化国家的约10%人口患有重听。这些病例的大部分可归因于所谓的感觉神经性听力损失，其最初特征是高频听力损失，它影响倾听和理解说话的能力。这种感觉神经性听力损失或感觉神经性耳聋主要是由于内耳中称为“毛细胞”的细胞的损伤。这些高复杂感觉细胞探测从外部通过耳鼓和中耳骨达到耳蜗的声音振动。这些感觉毛细胞位于所谓的柯替氏器中。
感觉毛细胞损失的最常见原因是年龄相关的退化、暴露于噪音、(耳毒性)药剂的副作用、遗传缺陷等。
由于意外发现在声损伤和耳毒性损伤后，禽鸟耳蜗能够自发再生感觉毛细胞，因此，也尝试将此发现应用于哺乳动物，特别是人。进行此尝试基于禽鸟耳蜗中感觉毛细胞再生的生物机制，直接邻近被破坏的感觉毛细胞的支持细胞经历细胞分裂，产生能够再分化成新形成的感觉毛细胞和支持细胞的未分化细胞群体。
然而，与哺乳动物中感觉毛细胞再生相关的所有这些尝试均未成功，至少至今没有成功。
因此，现在感觉神经性听力损失(只)能用助听器处理，助听器以预定频率放大声音，以弥补在那个范围的感觉神经性听力损失。它也可用直接刺激耳蜗神经的耳蜗植入物治疗。
然而，还有为了确定能够刺激哺乳动物中终末分化细胞和组织内源性再生的化合物进行的努力，特别是低分子量化合物。一组此类化合物例如公开于WO-A12011/095338。
因此，本发明的一个目的是提供能够刺激特别是在哺乳动物中的分裂期后细胞和组织内源性再生的新化合物组。
本发明提供由通式(I)表示的噁唑羧酸酰胺和噻唑羧酸酰胺性质的新化合物或其立体异构体、互变异构体、前药或药学上可接受的盐：
其中
-X为O(氧)或S(硫)，
-R1为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、环烷基芳基和芳基环烷基，任选包含杂原子，
-R2为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基和C2-C6烯基，
-R3为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、环烷基芳基和芳基环烷基，任选包含杂原子。
其中X为O的式(I)的化合物是优选的。
其中R1为选自直链或支化、未取代或经取代的芳基、烷基芳基和芳基烷基的取代基的本发明的化合物也是优选的。所有这些基团均可任选包含杂原子。
关于取代基R1，根据本发明，更优选R1为选自直链或支化、未取代或经取代的杂芳基、烷基杂芳基和杂芳基烷基的取代基。具体地，在这些情况下，R1为选自吲哚基、烷基吲哚基和吲哚基烷基的取代基。
根据本发明，其中R2为选自直链或支化、未取代或经取代的C1-C6烷基的取代基的化合物也是优选的。具体地讲，这些烷基为C1-C3烷基，其中甲基更优选。
根据本发明，其中R3为选自直链或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基和烷基环烷基的取代基的化合物也是优选的。具体地讲，R3为选自未取代或经取代环烷基的取代基。
根据以上公开，本发明的以下化合物是优选的，即，其中为以下情况的化合物：
-X为O(氧)，
-R1为选自直链或支化、未取代或经取代的吲哚基、烷基吲哚基和吲哚基烷基的取代基，
-R2为选自直链或支化、未取代或经取代的C1-C3烷基的取代基，具体为甲基，
-R3为选自未取代或经取代环烷基的取代基，具体为环己基。
本发明的最优选化合物为其中为以下情况的化合物：
-X为O(氧)，
-R1为(1H-吲哚-3-基)-甲基，
-R2为甲基，
-R3为环己基。
上述本发明的所有化合物可用作或用于药剂或药物组合物。
本发明的化合物优选用于治疗与哺乳动物中受损的分裂期后组织相关的疾病。具体地讲，根据本发明，所述组织为哺乳动物内耳的组织，其中要治疗的疾病为柯替氏器中感觉毛细胞损伤或损失后的内耳听力损失。
因此，本发明还提供一种药物组合物或药剂，所述药物组合物或药剂包含：
-至少一种要求保护和如上限定的本发明的化合物，和
-药学上可接受的载体或稀释剂。
最后，本发明提供一种治疗需要这种治疗的哺乳动物的疾病的方法，其中
-疾病包括与受损的分裂期后组织相关的疾病，具体为柯替氏器中感觉毛细胞损伤或损失后的内耳听力损失，并且
-所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的要求保护和如上限定的化合物。
具体地讲，上述哺乳动物为人。
在权利要求和以上说明中使用的术语限定如下。
本文所用术语“直链”是指分子中无支化原子链形式的化学结构，没有连接的侧链。优选所述(无支化)链为开链。与此相比，“支化”结构包括连接到分子中原子链的一个或多个侧链。
本文所用术语“经取代”是指相应基团中任何一个或多个氢由另一个原子或基团取代。例如，“经取代烷基”是指其中一个或多个氢例如由卤素、羟基或其它原子或基团取代的烷基。“卤素”指氟、氯、溴和碘。
术语“烷基”是指1至20个碳原子，优选1至6个碳原子的(直链或支链)烃基。总的来说，本文词语C1、C2、C6、C20等指相应基团中存在的C原子(碳原子)的数目。实例烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、叔丁基)和戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)。
术语“环烷基”是指饱和环状烃环系统。示例基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、金刚烷基等。
术语“烷基环烷基”指结合到环烷基的烷基。
术语“芳基”指从芳环衍生的任何官能团或取代基。芳基包括但不限于苯基、1-萘基、2-萘基、噻吩基、吲哚基等。因此，术语“杂芳基”指从杂芳环衍生的任何基团或取代基。例如，吲哚基从吲哚衍生，吲哚为由稠合到5元含氮吡咯环的6元苯环组成的双环杂芳族化合物。
术语“烷基芳基”、“芳基烷基”、“环烷基芳基”和“芳基环烷基”分别指结合到芳基的烷基、结合到烷基的芳基、结合到芳基的环烷基和结合到环烷基的芳基。
术语“杂原子”应包括氧、硫和氮。
术语“烷氧基”指结合到氧的烷基。烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基等。术语“烷氧基烷基”指具有结合到烷氧基的氧的(另一个)烷基的烷氧基。烷氧基烷基包括但不限于甲氧基甲基、乙氧基乙基等。
术语“烯基”指具有至少一个双键的烃基。
本发明的化合物的定义应包括所有可能的“立体异构体”及其混合物。具体地讲，包括外消旋型和具有指定活性的分离的光学异构体。外消旋型可通过物理方法拆分，例如分级结晶、非对映异构衍生物的分离或结晶或通过手性柱层析分离。可用常规方法从外消旋体得到单独光学异构体，例如，用光活性酸生成盐，随后结晶。
术语“互变异构体”是指容易通过称为互变异构的化学反应互变的本发明化合物的结构异构体。该反应一般导致伴随单键和相邻双键转变的氢原子或质子的形式移动。
本发明的式(I)的化合物也可具有“前药”形式。由于已知前药提高药物的品质(例如，溶解性、生产等)，本发明的化合物可以前药形式递送。“前药”旨在包括在这些前药给予哺乳动物受试者时体内释放本发明的活性母体药物的共价结合载体。前药包括本发明的化合物，其中例如羟基、氨基或其它基团结合到在给予前药时分别分裂成游离羟基、游离氨基或其它基团的任何基团。前药的实例包括但不限于本发明的化合物中醇和胺官能基的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。在本领域熟知前药的不同形式。在此背景中，根据本发明，可用前药酯或前药肽作为前药化合物。在某些情况下，通过细胞穿透促进分子(例如，生物素或马来酰亚胺基丙酸)任选经适合的间隔分子偶合到伯氨基或通过该氨基酰化，可提高本发明的化合物的生物利用率，并因此提高效力。
短语“药学上可接受的盐”是指其中母体化合物通过产生其酸或碱盐改性的所公开化合物的衍生物。实例包括但不限于碱性基团(例如，胺)的无机或有机酸盐和酸性基团(例如，羧酸)的碱金属和有机盐。药学上可接受的盐包括例如从非毒性无机或有机酸生成的常规非毒性盐或季铵盐。例如，这些常规非毒性盐包括从无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸)得到的那些盐；和从有机酸(例如乙酸、丙酸和其它酸)制备的盐。
短语“药学上可接受的载体”和短语“药学上可接受的稀释剂”是指在本领域一般接受用于生物活性剂递送到动物(具体地讲，哺乳动物)的介质。这些介质在本领域熟知。
短语“治疗有效量”旨在包括在单独或组合给药时有效的本发明的化合物的量。该短语也旨在包括有效刺激哺乳动物中终末分化细胞内源性再生的要求保护化合物的组合的量。优选所述化合物的组合为协同组合。当在组合给药时化合物的效果大于作为单剂单独给药时化合物的加性效果时，发生这种协同作用。
本文所用术语“治疗”包括治疗哺乳动物(特别是人)的疾病，并且包括
-预防哺乳动物发生疾病，例如，所述哺乳动物易患那种疾病，但未诊断有那种疾病，
-抑制疾病，即，阻止进一步发展，和/或
-减轻疾病，即，改善疾病症状。
根据本发明，要求保护的化合物和要求保护的药物组合物/药剂可以不同剂型给予哺乳动物。允许化合物直接给予受损伤细胞或组织(例如，进入哺乳动物的耳蜗)的剂型是优选的。因此，根据本发明的一个实施方案，非口服剂型是优选的，具体为注射剂。在这些情况下，例如，通过注入中耳，或者通过施加到内耳的圆或椭圆窗，或者通过(直接)注入内耳，跨鼓膜给予到内耳上或给予到内耳中。在此背景中，例如可利用泵或类似装置。
也可例如以口服剂型全身施用化合物(药物组合物、药剂)。这些剂型包括颗粒剂、散剂、片剂或胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。
所有剂型可通过制药过程中常规使用的本身已知的技术制备，例如，通过混合、制粒或成层方法。可另外使药物组合物或药剂灭菌。
可根据接受者、其年龄和体重、当前临床状态、给药时间、剂型、给药方法、实际利用的化合物和(如果适当)所用其它药物适当选择本发明的化合物或药物组合物/药剂的精确剂量(治疗有效量)。
用于成年接受者的剂量范围(优选口服剂量范围)可在0.01至10mg/kg体重之间选择，优选0.05至10mg/kg体重，更优选0.05至5mg/kg体重。在柯替氏器中感觉毛细胞损伤或损失后的内耳听力损失治疗中，该剂量可与“治疗的内耳数”和/或“给药数”相关。原因是，经一时间段(例如，在数天和数星期/月之间，优选以数天间隔(1至7天))重复给予化合物/药物组合物是适当的。在这些情况下，优选如前所述直接用(例如，通过输注)到耳蜗的活性化合物的量应在0,5μg至1.0mg/内耳/给药的范围内。
实验部分和实施例
部分1
以下显示提供本发明的新化合物的合成路线：
根据该路线，在方案1中，通过化合物3提供式I化合物的取代基R1。
根据方案2，使化合物3(对应于取代基R1)结合到化合物5。另外，根据方案2，烷基作为取代基R2引入化合物6。
在化合物6断裂(方案2)后，根据方案3在一些合成步骤中，提供噁唑羧酸的结构(包括取代基R1和R2)(见方案3的化合物11)。
根据方案4，通过与相应的胺(提供取代基R3)反应生成相应的羧酸酰胺。在从化合物12去掉胺保护基BOC后，提供靶化合物13。
尽管为了提供本发明的一些新化合物以一般方式公开合成路线，但化合物13显示为具体化合物，即，(S)-2-(2-氨基-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-N-环己基噁唑-4-甲酰胺盐酸盐。
根据方案5，通过在吲哚基的杂原子N取代氢H，优选通过烷基(取代基R4)，可将化合物12修改成化合物12a。
参照式I，化合物12和化合物13也可限定为其中为以下情况的化合物
-X为O(氧)，
-R1为(1H-吲哚-3-基)-甲基，如果适用，具体在吲哚基的杂原子N，优选通过烷基，优选通过甲基取代
-R2为烷基，优选甲基，和
-R3为环烷基，优选环己基。
方案1
3-二甲基氨基甲基吲哚2：在0℃向福尔马林(37%，在水中，0.61mL，8.14mmol)、1,4-二氧杂环己烷和AcOH(7mL)的混合物加入Me2NH(40%，在水中，1.03mL，8.14mmol)。在0℃逐渐加入1,4-二氧杂环己烷(7mL)中吲哚1(7.40mmol)的溶液。在0℃搅拌2h和在室温搅拌18h后，加入水(9mL)、炭(0.43g)和硅藻土(0.43g)，并通过硅藻土垫过滤反应混合物。由水中的2NNaOH的将滤液的pH调节至12。将沉淀过滤，洗涤(水)，并干燥，得到2。产率约90%。
甲基硫酸吲哚-3-基-甲基-三甲基铵3：在10-15℃向THF(四氢呋喃)(4mL)中硫酸二甲酯(3.94g,31.2mmol)和AcOH(89μL,1.56mmol)的溶液滴加THF(10mL)中2(1.20g,6.24mmol)和AcOH(89μL,1.56mmol)的溶液。在0℃搅拌1h后，过滤沉淀，用Et2O(乙醚)洗涤，随后用DCM(二氯甲烷)洗涤，得到3。产率：95-98%。
方案2
4的烷基化：在-78℃向THF(30mL)中(2S,3R)-(+)-N-Boc-6-氧代-2,3-二苯基吗啉4(500mg.1.42mmol)的溶液滴加LDA(二异丙基氨基锂)(1.0M，在THF中，2.9mL，2.97mmol)的溶液。Boc或BOC指胺保护基叔丁氧基羰基。在-78℃搅拌30min后，滴加Li2CuCl4(0.1M，在THF中，1.41mL，0.141mmol)的溶液，随后缓慢加入THF(20mL)中3(1.56mmol)的悬浮体。在-78℃搅拌1h后，使反应混合物达到室温(30min)，然后加入水中NH4Cl的饱和溶液。萃取整理(EtOAc(乙酸乙酯)、水、盐水)，浓缩EtOAc萃取物，随后柱层析，得到化合物5，以下为例
(3R,5R,6S)-叔丁基-3-((1H-吲哚-3-基)-甲基)-2-氧代-5,6-二苯基吗啉-4-甲酸酯，产率：75%
(3R,5R,6S)-叔丁基-3-((7-氟-1H-吲哚-3-基)-甲基)-2-氧代-5,6-二苯基吗啉-4-甲酸酯，产率：71%
(3R,5R,6S)-叔丁基-3-((7-甲基-1H-吲哚-3-基)-甲基)-2-氧代-5,6-二苯基吗啉-4-甲酸酯，产率：41%。
5的烷基化：在-78℃向THF(6mL)中5(1.24mmol)的溶液滴加LDA(1.0M，在THF中，2.5mL，250mmol)的溶液。在-78℃搅拌30min后，加入THF(2mL)中烷基碘(1.36mmol)的溶液。在-78℃搅拌2h后，使反应混合物达到室温(30min)，然后加入水中NH4Cl的饱和溶液。萃取整理(EtOAc、水、盐水)，浓缩EtOAc萃取物，随后柱层析，得到6，以下为例
(3S,5R,6S)-叔丁基-3-((1H-吲哚-3-基)-甲基)-3-甲基-2-氧代-5,6-二苯基吗啉-4-甲酸酯，产率：62%
手性助剂断裂：在-78℃以一份向液态氨(约25mL)加入锂(164mg,23.7mmol)。在-78℃搅拌30min后，滴加t-BuOH(450μL,4.74mmol)和在THF(5mL)中6(0.795mmol)的溶液。将反应混合物在-78℃搅拌25min，然后用NH4Cl(2.26g,42.3mmol)猝灭反应。去除冷却浴，并使氨蒸发。萃取整理(EtOAc、水中的10%柠檬酸、盐水)，浓缩EtOAc萃取物，随后柱层析，得到7，以下为例
(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-甲基丙酸，产率：86%。
方案3
在0℃向DMF(二甲基甲酰胺)(5mL)和DCM(4mL)中7(0.29mmol)和(S)-甲基-2-氨基-3-羟基丙酸酯盐酸盐(68mg,0.44mmol)的溶液依次加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(61mg,0.32mmol)、HOBt(羟基苯并三唑)(43mg,0.32mmol)和NMM(N-甲基吗啉)(112μL,1.01mmol)。在室温搅拌反应混合物2小时。萃取整理(EtOAc、在水中的饱和NaHCO3、在水中的饱和NH4Cl、水、盐水)，浓缩EtOAc萃取物，随后柱层析，得到8，以下为例
(S)-甲基-2-((S)-2-甲基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰氨基)-3-羟基丙酸酯，产率：72%
合成噁唑啉：在-78℃向DCM(3mL)中8(0.26mmol)的溶液滴加DAST(三氟化二乙基氨基硫)(38μL,0.286mmol)。在-78℃搅拌2h后，以一份加入K2CO3(54mg,0.39mmol)。使反应混合物达到室温(2h)，然后在室温搅拌16h。萃取整理(DCM、在水中的饱和NaHCO3、盐水)，浓缩DCM萃取物，得到化合物9，该化合物用于下一步骤，不用另外纯化。
合成噁唑：在-30℃向DCM(5mL)中9(0.247mmol)的溶液加入DBU(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)。在-30℃搅拌10min后，向混合物加入CBrCl3(59μL,0.60mmol)，并搅拌混合物18h，使混合物逐渐温热至室温。萃取整理(DCM、10%柠檬酸、盐水)，浓缩DCM萃取物，随后柱层析，得到10，以下为例
(S)-甲基-2-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-1-(1H-吲哚-3-基)-丙-2-基)噁唑-4-甲酸酯，产率：80%
酯10水解：向THF/MeOH(7/1,2mL)(MeOH=甲醇)中10(0.14mmol)的溶液加入LiOH(2M，在水中，210μL，0.42mmol)的溶液，并在室温搅拌反应混合物2h。由水中的0.1HCl将介质的pH调节至3。萃取整理(EtOAc、盐水)，浓缩EtOAc萃取物，得到11，以下为例
(S)-2-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-1-(1H-吲哚-3-基)-丙-2-基)噁唑-4-甲酸，产率：95%。
方案4
合成酰胺12：向DCM(5mL)中11(0.13mmol)、EDC盐酸盐(30mg,0.16mmol)和HOBt(21mg,0.16mmol)的溶液依次加入NMM(21μL,0.19mmol)和胺(0.16mmol)。在室温搅拌反应混合物4h。萃取整理(DCM、水中的10%柠檬酸、水中的饱和NaHCO3、盐水)，浓缩DCM萃取物，随后柱层析，得到12，以下为例
(S)-叔丁基-2-(4-(环己基氨基甲酰基)噁唑-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)-丙基氨基甲酸酯，产率：(68%)
去除Boc-基团：向DCM(2mL)中12(0.08mol)的溶液加入HCl(5M，在iPrOH中，0.32mL，1.6mmol)(iPrOH=异丙醇)的溶液，并在35℃搅拌反应混合物2h。蒸发溶剂，在真空(0.1mmHg)中干燥残余物，得到目标化合物13，以下为例
(S)-2-(2-氨基-1-(1H-吲哚-3-基)-丙-2-基)-N-环己基噁唑-4-甲酰胺盐酸盐，产率：100%。
方案5
向在10℃THF(3mL)中12(90mg,0.20mmol)的溶液加入t-BuOK(25mg,0.22mmol)(t-BuOK=叔丁醇钾)。在15℃搅拌45min后，向混合物加入烷基碘(0.40mmol)，并在15℃继续搅拌1.5h。浓缩，萃取整理(EtOAc、水、盐水)，浓缩EtOAc萃取物，随后柱层析，提供化合物12a。
部分2
根据实验规程利用筛选实验，实验能够从小鼠制备的出生后感觉器官体外分离内耳祖细胞。这些分离的祖细胞产生表达全面标记基因组的典型球，这些基因限定祖细胞态中的早期发育感觉上皮细胞。在适合条件下，这些球可分化成表达标记基因的上皮片，它们具有分化毛细胞和支持细胞的特征，如在本地柯替氏器中所发现。出于以低产量形式筛选的目的，可产生足量的这些分化感觉上皮片，标为“低量耳”。对于适合读出器，用三种参数检测去分化：(i)标记Sox2表达(Sox2=转录因子SRY(性别决定区Y-box2)，(ii)EdU指示增殖结合的增加(EdU=胸苷类似物5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)，和(iii)用毛细胞标记肌球蛋白VIIA标记。
在5μM标准浓度筛选化合物。在DMSO(二甲亚砜)中制备5mM初始溶液，并在-20℃储存储备溶液等分试样。对实验参比使用0.1%DMSO。
在对于每种化合物总共9-12孔的各试验中，利用一组3至4孔/化合物在三个独立实验中试验检验项目。在出生后0天从出生后小鼠的感觉器官分离内耳祖细胞。通过酶促和机械解离作用解离感觉器官，得到单细胞悬浮体。然后平板接种单细胞，在悬浮细胞培养环境并在生长因子存在下经5天形成球。在增殖5天后，将细胞培养悬浮体中的球平板接种在Matrigel(基质胶)涂覆孔上，在生长因子贫化培养基中经14天分化。细胞培养悬浮体中的球附到细胞培养瓶，并形成片。在平板接种后24h，用Notch抑制剂处理片24h。然后，每4天(第6天，第10天)更换培养基。在分化中14天后，在5μM最终浓度经96h用检验项目处理细胞培养物(片)。
对于最后5小时处理，使片暴露于EdU(Click-itEdUCellProliferationAssay(细胞增殖实验)，LifeInvitrogen)，以评价各检验项目的增殖潜力。根据制造商进行EdU的染色。另外使毛细胞标记(即，MyosinVIIa)和支持细胞标记(即，Sox2)染色，并使用核复染剂(即，DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚))。
为了容易比较，使EdU阳性细胞数归一化到DMSO唯一条件。因此，增殖活性表示为“倍EdU阳性细胞”。用增殖培养基作为阳性对照，与DMSO比较，发现增殖活性增加到2.1倍。用分化培养基发现未改变增殖活性。与DMSO比较，示例性化合物13(见实施例，部分1)增殖活性增加到2倍。
相应结果显示于图1和表1和2中。
图1显示增殖活性，表示为“倍EdU阳性细胞”。阳性对照检测增殖培养基显示约2倍增殖活性，分化培养基显示类似于DMSO的活性。这些结果充分满足实验的预测性质。示例性化合物13显示与阳性对照相似的增殖诱导活性。***表示(统计)显著性p<0.0001。
表1显示结果汇总：检验项目、分析的分化球数、EdU阳性细胞的平均百分数、平均标准误差(SEM)、表示为“倍EdU阳性细胞”的增殖活性。
表2显示检验项目与参比条件的统计(T检验)比较。

Claims (15)

1.一种式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、前药或药学上可接受的盐
其中
-X为O(氧)或S(硫)，
-R1为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、环烷基芳基和芳基环烷基，任选包含杂原子，
-R2为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基和C2-C6烯基，
-R3为选自以下的取代基：直链(无支化)或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、环烷基芳基和芳基环烷基，任选包含杂原子。
2.权利要求1的化合物，其中X为O(氧)。
3.权利要求1或2的化合物，其中R1为选自直链或支化、未取代或经取代的芳基、烷基芳基和芳基烷基的取代基，任选包含杂原子。
4.权利要求3的化合物，其中R1为选自直链或支化、未取代或经取代的杂芳基、烷基杂芳基和杂芳基烷基的取代基，具体为吲哚基、烷基吲哚基和吲哚基烷基。
5.前述权利要求中任一项的化合物，其中R2为选自直链或支化、未取代或经取代的C1-C6烷基的取代基，具体为C1-C3烷基，尤其甲基。
6.前述权利要求中任一项的化合物，其中R3为选自直链或支化、未取代或经取代的烷基、环烷基和烷基环烷基的取代基。
7.权利要求6的化合物，其中R3为选自未取代或经取代环烷基的取代基。
8.前述权利要求中任一项的化合物，其中
-X为O(氧)，
-R1为选自直链或支化、未取代或经取代的吲哚基、烷基吲哚基和吲哚基烷基的取代基，
-R2为选自直链或支化、未取代或经取代C1-C3烷基的取代基，具体为甲基，
-R3为选自未取代或经取代环烷基的取代基，具体为环己基。
9.权利要求8的化合物，其中
-X为O(氧)，
-R1为(1H-吲哚-3-基)-甲基，
-R2为甲基，
-R3为环己基。
10.前述权利要求中任一项的化合物，用作药物组合物或药剂。
11.权利要求1至9中任一项的化合物用于治疗与哺乳动物中受损的分裂期后组织相关的疾病的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述组织为哺乳动物内耳的组织，其中要治疗的疾病为柯替氏器中感觉毛细胞损伤或损失后的内耳听力损失。
13.一种药物组合物或药剂，所述药物组合物或药剂包含：
-至少一种权利要求1至9中任一项的化合物，和
-药学上可接受的载体或稀释剂。
14.一种治疗需要这种治疗的哺乳动物的疾病的方法，其中
-所述疾病包括与受损的分裂期后组织相关的疾病，具体为柯替氏器中感觉毛细胞损伤或损失后的内耳听力损失，和
-所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1至9中任一项的化合物。
15.权利要求14的方法，其中哺乳动物为人。
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