CN105806910B - 一种AChE酶定向固定的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种AChE酶定向固定的生物传感器及其制备方法和应用。生物传感器的制备方法包括以下步骤：制备磁性纳米材料MNP、修饰、制备MNPs‑AChE酶和构建传感器。本发明传感器用于检测有机磷农药的残留。本发明中乙酰胆碱酯酶共价固定到末端羧基修饰的MNP颗粒表面，得到的复合纳米材料MNPs‑AChE酶能够最大程度地维持酶的活性；本发明构建的安培型生物传感器通过外磁场可自动调节MNPs‑AChE酶修饰SPCE系统，且该电极修饰只需要一步，提高了AChE酶的稳定性和活性；在检测有机磷试剂时表现出较好的灵敏性和重现性、且反应体积小；本发明制备生物传感器的方法操作简单、制备方便、成本低、适用于工业化大规模生产。

Description

一种AChE酶定向固定的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种AChE酶定向固定的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
近些年农药残留引起食物中毒事件时有发生，食品安全对人民的生活、健康造成了极大的威胁。残留农药随着食物链进入人体体内，能够抑制人体内胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质-乙酰胆碱的代谢混乱，引起各类急性、慢性中毒情况，如运动失调、昏迷、瘫痪甚至死亡。目前我国粮食、水果、蔬菜产品中农药残留最为严重的就是有机磷和氨基甲酸酯类农药，有数据显示，有机磷杀虫剂的比例更是占所有农药的70％以上，严重危害人民的健康和安全。因此对有机磷农药进行及时、准确、灵敏的监控和检测，成为亟待解决的迫切问题。
检测农药的方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用、液-质联用等，虽然其结果精确、可靠，但所需设备复杂昂贵，需专业人员操作且费时麻烦，不适应现场快速检测需要。也有一些的快速检测方法例如试纸法、显色法、光度法等，虽然操作简单、成本低，但是其检测限、灵敏度又不太理想。近些年来酶生物传感器的出现给农药检测提供了新的思路，与传统检测方法和其他快速检测方法相比，酶生物传感器具有分析速度快、成本低、选择性好、灵敏度高等优点。
传统酶生物传感器采用的固定方式是随机将酶与载体结合，它的工作电极组成比较复杂，首先是通过多个步骤合成复杂的复合纳米材料(导电性较好)，再将AChE酶固定到复合纳米材料上，最后通过电化学沉积法将固定有酶的复合材料固定到电极上得到工作电极；由于制备工作电极时需要多个步骤，这可能会减弱酶的稳定性，生物传感器的重现性较差；此外，工作电极为一个整体，不利于保藏，且反应体积通常为10mL，不能满足微量分析的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种体积小、易于保藏、稳定性和重现性好的AChE酶定向固定的生物传感器；
本发明的第二目的在于提供AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，该方法操作简单、制备方便、成本低、适用于工业化大规模生产。
本发明的第三目的在于提供AChE酶定向固定的生物传感器的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，它包括以下步骤：
S1.制备磁性纳米材料：FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O反应后通过磁分离得到具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，加入TEOS反应生成二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的具有核壳结构的复合物A；其中，所述FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O的重量比为1～5:1；
S2.修饰：在复合物A中先加入APTMS进行氨基修饰反应，再加入DMF和丁二酸酐磁力搅拌反应2.5～3.5h，得末端为羧基修饰的磁性纳米材料B；
S3.制备MNPs-AChE酶：B中加入NHS和EDC·HCl活化磁性纳米材料的羧基，并重悬于用PBS稀释的AChE酶液中，漩涡震荡4.5～5.5h，AChE酶固定到磁性纳米粒子表面形成MNPs-AChE酶；其中，所述磁性纳米材料B、NHS与EDC·HCl的重量比为3.6～5:1～2:1；
S4.构建传感器：将MNPs-AChE酶的PBS悬浮液添加到SPCE反应池中，在外磁场的帮助下将MNPs-AChE酶修饰在SPCE电极表面。
进一步地，步骤S1中所述加入TEOS的反应温度为30～40℃，反应时间≥5h，反应溶液的pH值为9～10。
进一步地，溶液的pH值采用氨水调节至9～10。
进一步地，步骤S2中所述修饰反应的温度为30～40℃，反应时间为6.5～7.5h。
进一步地，步骤S3中所述活化磁性纳米材料的羧基的反应条件为0℃冰溶25～35min。
进一步地，步骤S4中所述MNPs-AChE酶的PBS悬浮液中MNPs-AChE酶的浓度为9～11μg/mL。
采用上述方法制备的AChE酶定向固定的生物传感器。
AChE酶定向固定的生物传感器用于检测有机磷农药的残留。
本发明具有以下优点：
(1)本发明中乙酰胆碱酯酶共价固定到末端羧基修饰的磁性纳米颗粒表面，得到的复合纳米材料(MNPs-AChE酶)能够最大程度的维持酶的活性；
(2)本发明构建了一个新的安培型生物传感器，即将MNPs-AChE酶通过SPCE电极正下方外磁场的作用固定于SPCE电极表面；若没有磁场，MNPs-AChE酶分散于溶液中，有利于回收、方便保存和重复再利用；也就是说，通过外磁场可方便地调节MNPs-AChE酶修饰SPCE系统。更重要的是，相对于传统的修饰电极来说，该电极修饰只需要一步，极大地简化了电极的制备和减少了多步而又复杂的修饰带来的错误及可能导致的分析结构的不稳定；因此，提高了该AChE酶生物反应器的稳定性和活性；
(3)本发明能准确控制修饰于SPCE电极上MNPs-AChE酶材料的量，进而能准确测量酶量，为准确测定有机磷农药浓度提供了条件；本发明构建的生物传感器在检测有机磷试剂时展现出较好的灵敏性和重现性、且反应体积小，仅为100μL；
(4)本发明AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，该方法操作简单、制备方便、成本低、适用于工业化大规模生产。
附图说明
图1为本发明生物传感器的原理图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，它包括以下步骤：
S1.制备磁性纳米材料：FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O反应后通过磁分离得到具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，加入TEOS反应生成二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的具有核壳结构的复合物A；其中，所述FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O的重量比为1:1；所述加入TEOS的反应温度为30℃，反应时间为5h，反应溶液的pH值为9，用氨水调节；
S2.修饰：在复合物A中先加入APTMS进行氨基修饰反应，反应的温度为30℃，反应时间为6.5h，再加入DMF和丁二酸酐磁力搅拌反应2.5h，得末端为羧基修饰的磁性纳米材料B；
S3.制备MNPs-AChE酶：B中加入NHS和EDC·HCl 0℃冰溶25min活化磁性纳米材料的羧基，并重悬于用PBS稀释的AChE酶液中，漩涡震荡4.5h，AChE酶固定到磁性纳米粒子表面形成MNPs-AChE酶；其中，所述B、NHS与EDC·HCl的重量比为3.6:1:1；
S4.构建传感器：将MNPs-AChE酶的PBS悬浮液添加到SPCE反应池中，所述MNPs-AChE酶的PBS悬浮液中MNPs-AChE酶的浓度为9μg/mL，在外磁场的帮助下将MNPs-AChE酶修饰在SPCE电极表面。
实施例2：一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，它包括以下步骤：
S1.制备磁性纳米材料：FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O反应后通过磁分离得到具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，加入TEOS反应生成二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的具有核壳结构的复合物A；其中，所述FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O的重量比为3.5:1；所述加入TEOS的反应温度为40℃，反应时间为7h，反应溶液的pH值为10，用氨水调节；
S2.修饰：在复合物A中先加入APTMS进行氨基修饰反应，反应的温度为40℃，反应时间为7.5h，再加入DMF和丁二酸酐磁力搅拌反应3.5h，得末端为羧基修饰的磁性纳米材料B；
S3.制备MNPs-AChE酶：B中加入NHS和EDC·HCl 0℃冰溶35min活化磁性纳米材料的羧基，并重悬于用PBS稀释的AChE酶液中，漩涡震荡5.5h，AChE酶固定到磁性纳米粒子表面形成MNPs-AChE酶；其中，所述B、NHS与EDC·HCl的重量比为5:2:1；
S4.构建传感器：将MNPs-AChE酶的PBS悬浮液添加到SPCE反应池中，所述MNPs-AChE酶的PBS悬浮液中MNPs-AChE酶的浓度为11μg/mL，在外磁场的帮助下将MNPs-AChE酶修饰在SPCE电极表面。
实施例3：一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，它包括以下步骤：
S1.制备磁性纳米材料：FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O反应后通过磁分离得到具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，加入TEOS反应生成二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的具有核壳结构的复合物A；其中，所述FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O的重量比为2.8:1；所述加入TEOS的反应温度为33℃，反应时间为9h，反应溶液的pH值为9，用氨水调节；
S2.修饰：在复合物A中先加入APTMS进行氨基修饰反应，反应的温度为32℃，反应时间为7h，再加入DMF和丁二酸酐磁力搅拌反应3h，得末端为羧基修饰的磁性纳米材料B；
S3.制备MNPs-AChE酶：B中加入NHS和EDC·HCl 0℃冰溶28min活化磁性纳米材料的羧基，并重悬于用PBS稀释的AChE酶液中，漩涡震荡5h，AChE酶固定到磁性纳米粒子表面形成MNPs-AChE酶；其中，所述B、NHS与EDC·HCl的重量比为4:1.4:1；
S4.构建传感器：将MNPs-AChE酶的PBS悬浮液添加到SPCE反应池中，所述MNPs-AChE酶的PBS悬浮液中MNPs-AChE酶的浓度为9.5μg/mL，在外磁场的帮助下将MNPs-AChE酶修饰在SPCE电极表面。
实施例4：一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，它包括以下步骤：
S1.制备磁性纳米材料：FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O反应后通过磁分离得到具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，加入TEOS反应生成二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的具有核壳结构的复合物A；其中，所述FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O的重量比为3.2:1；所述加入TEOS的反应温度为38℃，反应时间为10h，反应溶液的pH值为9.5，用氨水调节；
S2.修饰：在复合物A中先加入APTMS进行氨基修饰反应，反应的温度为38℃，反应时间为7.2h，再加入DMF和丁二酸酐磁力搅拌反应3.2h，得末端为羧基修饰的磁性纳米材料B；
S3.制备MNPs-AChE酶：B中加入NHS和EDC·HCl 0℃冰溶32min活化磁性纳米材料的羧基，并重悬于用PBS稀释的AChE酶液中，漩涡震荡5.3h，AChE酶固定到磁性纳米粒子表面形成MNPs-AChE酶；其中，所述B、NHS与EDC·HCl的重量比为4.5:1.8:1；
S4.构建传感器：将MNPs-AChE酶的PBS悬浮液添加到SPCE反应池中，所述MNPs-AChE酶的PBS悬浮液中MNPs-AChE酶的浓度为10.5μg/mL，在外磁场的帮助下将MNPs-AChE酶修饰在SPCE电极表面。
实施例5：一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，它包括以下步骤：
S1.制备磁性纳米材料：将2.0271g FeCl3·6H2O与0.7407g FeCl2·4H2O加入到250mL去离子水中，变搅拌边逐滴加入氨水至pH调节至9，搅拌30分钟后通过磁分离得到具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，然后分别用去离子水和无水乙醇洗三次，接着，将洗好的MNPs分散于150mL无水乙醇中，加入400μL TEOS后逐滴加入氨水调pH至9，于35℃喜爱搅拌5h，生成二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的具有核壳结构的复合物A；将复合物A磁分离富集后用无水乙醇洗三遍，最后将洗涤好的A重分散到75mL无水乙醇和15mL 95％的无水乙醇中；
S2.修饰：在复合物A的体系中中先加入2mL APTMS进行氨基修饰反应，反应的温度为35℃，反应时间为7h，产物经磁分离水洗三遍，冻干待用；准确称取冻干后的产物500mg放入干燥的三颈瓶中，氮气保护后向三颈瓶中再加入30mL DMF和3g丁二酸酐，在300rmp/min的磁力下搅拌反应3.2h，反应完成后分泵用无水乙醇和去离子水磁分离洗三次，得末端为羧基修饰的磁性纳米材料B；
S3.制备MNPs-AChE酶：准确称取20mg B，加入3mL MES缓冲液(pH为6.5，50mM)中，再加入7mg NHS和5mg EDC·HCl 0℃冰溶30min活化磁性纳米材料的羧基，反应完成后，磁分离，弃上清液，用0.1mM PBS(pH7.2)将活化的材料洗三次，再用活化并洗涤的材料重悬于3mL用PBS稀释的AChE酶液中，室温漩涡震荡5h，AChE酶固定到磁性纳米粒子表面形成MNPs-AChE酶；反应结束后，用PBS洗涤材料，直至上清液中检测不到乙酰胆碱酯酶为止；
S4.构建传感器：取20mL MNPs-AChE酶的PBS悬浮液添加到SPCE反应池中，所述MNPs-AChE酶的PBS悬浮液中MNPs-AChE酶的浓度为10μg/mL，在外磁场的条件下将MNPs-AChE酶修饰在SPCE电极表面。
固定化的乙酰胆碱酯酶磁珠被吸附于工作电极表面，促使整个酶促反应发生于工作电极表面，工作电极表面产生的产物较多，施加电势，产物被氧化产生电子，从而检测到的电子数较多，检测电流更灵敏。其原理如图1所示。

Claims (8)

1.一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：
S1. 制备磁性纳米材料：FeCl3•6H2O与FeCl2•4H2O反应后通过磁分离得到具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，加入TEOS反应生成二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的具有核壳结构的复合物A；其中，所述FeCl3•6H2O与FeCl2•4H2O的重量比为1～5:1；
S2. 修饰：在复合物A中先加入 APTMS进行氨基修饰反应，再加入DMF和丁二酸酐磁力搅拌反应2.5～3.5 h，得末端为羧基修饰的磁性纳米材料B；
S3. 制备MNPs-AChE酶：B中加入NHS和EDC•HCl活化磁性纳米材料的羧基，并重悬于用PBS稀释的AChE酶液中，漩涡震荡4.5～5.5 h，AChE酶固定到磁性纳米粒子表面形成MNPs-AChE酶；其中，所述磁性纳米材料B、NHS与EDC•HCl的重量比为3.6～5:1～2:1；
S4. 构建传感器：将MNPs-AChE酶的PBS悬浮液添加到SPCE反应池中，在外磁场的帮助下将MNPs-AChE酶修饰在SPCE电极表面从而得到生物传感器。
2.如权利要求1所述的一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述加入TEOS的反应温度为30～40 ℃，反应时间≥5 h，反应溶液的pH值为9～10。
3.如权利要求2所述的一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，其特征在于，溶液的pH值采用氨水调节至9～10。
4.如权利要求1所述的一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述修饰反应的温度为30～40 ℃，反应时间为6.5～7.5 h。
5.如权利要求1所述的一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述活化磁性纳米材料的羧基的反应条件为0℃冰溶25～35 min。
6.如权利要求1所述的一种AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述MNPs-AChE酶的PBS悬浮液中MNPs-AChE酶的浓度为9～11 μg/mL。
7.如权利要求1-6中任一所述的方法制备的AChE酶定向固定的生物传感器。
8.如权利要求7所述的AChE酶定向固定的生物传感器用于检测有机磷农药的残留。
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