CN105792647A - 具有人源化的增殖诱导配体基因的非人动物 - Google Patents

Abstract

提供了非人动物、细胞、用于产生和使用其的方法和组合物，其中所述非人动物和细胞包含人源化的增殖诱导配体基因。描述了从内源增殖诱导配体基因座表达人或人源化的增殖诱导配体蛋白的非人动物和细胞。

Description

具有人源化的增殖诱导配体基因的非人动物

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年11月19日提交的美国临时申请号61/905,986(其整个内容通过引用并入本文)的优先权的权益。

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将于2014年11月5日创建的并经由EFS-Web提交至美国专利商标局的以ASCII文本文件存在的序列表(名称为31016_6825_SEQ.txt，32KB字节)通过引用并入本文。

背景

当生物体的用于防止其免疫系统攻击其自身的细胞和组织的天然机制崩溃时，导致自身免疫。由崩溃以及由所导致的异常自身定向免疫应答引起的疾病、病症和病况被称为自身免疫性疾病。自身免疫性疾病、病症和病况的显著实例包括糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和一些过敏症。自身免疫性疾病据估计是死亡的十大主要原因之一。用于自身免疫性疾病的治疗的开发的投资在数十亿美元的范围内，并且测试、开发和验证候选治疗剂的关键体内系统是确保治疗安全性和有效性所必需的。此外，这样的体内系统在确定新的治疗是否能够维持患者的长期改善以及可能地是否可甚至为许多仍未得到解决的疾病提供治愈的过程中是必需的。这样的体内系统还为在体内进行的人造血和免疫系统相关功能的测定、新型疗法和疫苗的鉴定提供了来源。

发明简述

本发明包括这样的认识：期望工程改造非人动物以提供改善的体内自身免疫性疾病系统以允许测试、开发和验证新的和现有的候选治疗剂。本发明还包括这样的认识：期望工程改造非人动物以允许在来自人供体的人造血干细胞或B细胞的免疫后和植入后人淋巴细胞(例如，B细胞)的活化和存活得到改善。本发明还包括这样的认识：期望具有人源化April基因和/或另外地表达、含有或产生人或人源化April蛋白的非人动物例如用于来自人供体的人造血干细胞或B细胞的植入。

在一些实施方案中，本发明的非人动物表达包含连接至非人April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的April多肽。

在一些实施方案中，人APRIL蛋白的细胞外部分由人APRIL基因的外显子2至6编码。

在一些实施方案中，人APRIL基因的外显子2至6与表3中显示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些实施方案中，人APRIL基因的外显子2至6与表3中显示的人APRIL基因的外显子2至6具有100％的同一性。

在一些实施方案中，本发明的非人动物不以可检测方式表达全长内源April蛋白。在一些实施方案中，所述非人动物是啮齿动物并且不以可检测方式表达全长啮齿动物April蛋白。在一些实施方案中，所述非人动物是小鼠并且不以可检测方式表达其序列示于表3中的全长小鼠April蛋白。

在一些实施方案中，本发明的April多肽从内源非人April基因座上的经遗传修饰的April基因表达。在某些实施方案中，经遗传修饰的April基因包含非人April外显子1。在某些实施方案中，经遗传修饰的April基因包含完整或部分的非人April外显子6。在某些实施方案中，经遗传修饰的April基因包含完整或部分的非人April外显子1、非人April外显子6或其组合。在多个实施方案中，部分的非人April外显子6包含非人April3’非翻译区(UTR)和非人April多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，本发明提供了包含经遗传修饰的April基因的非人动物，所述经遗传修饰的April基因包含可操作地连接至April启动子的人APRIL基因的一个或多个外显子(即，人源化April基因)。在一些实施方案中，本发明的April启动子为非人April启动子。在一些实施方案中，本发明的April启动子为人APRIL启动子。

在一些实施方案中，本发明的人源化April基因包含人APRIL基因的外显子2至6。在某些实施方案中，人源化April基因还包含非人April外显子1。在某些实施方案中，人源化April基因还包含完整或部分的非人April外显子6。在某些实施方案中，人源化April基因包含完整或部分的非人外显子1和非人外显子6。在多个实施方案中，部分的非人April外显子6包含非人April3’非翻译区(UTR)和非人April多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些实施方案中，人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有100％的同一性。

在多个实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物。在某些实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠或大鼠。

在一些实施方案中，本发明提供了包含可操作地连接至人APRIL基因的一个或多个外显子的非人April基因的一个或多个外显子的人源化April基因座(或基因)。

在一些实施方案中，本发明的人源化April基因座(或基因)包含可操作地连接至人APRIL外显子2至6的非人April外显子1。在某些实施方案中，人源化April基因座(或基因)还包含侧翼连接非人April外显子1和人APRIL外显子6的5’和3’非人非翻译区(UTR)。

在一些实施方案中，本发明提供了由本文所述的人源化April基因座(或基因)编码的April多肽。

在一些实施方案中，本发明提供了从本文所述的非人动物分离的细胞或组织。在一些实施方案中，细胞选自树突状细胞、淋巴细胞(例如，B或T细胞)、巨噬细胞和单核细胞。在一些实施方案中，组织选自脂肪、膀胱、脑、乳腺、骨髓、眼、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵和/或其组合。

在一些实施方案中，本发明提供了其基因组包括April基因(或基因座)的分离的非人(例如，啮齿动物)细胞或组织，所述April基因(或基因座)包含可操作地连接至人APRIL基因的一个或多个外显子的非人April基因的一个或多个外显子。在某些实施方案中，本发明提供了其基因组包含April基因(或基因座)的分离的非人(例如，啮齿动物)细胞或组织，所述April基因(或基因座)包含可操作地连接至人APRIL外显子2至6的完整或部分的非人April外显子1和6，其中所述April基因(或基因座)还包含侧翼连接非人April外显子1和人APRIL外显子6的5’和3’非人非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，April基因(或基因座)包含编码含有人APRIL蛋白的残基87至250的April多肽的序列。

在一些实施方案中，本发明提供了其基因组包含本文所述的April基因(或基因座)的非人胚胎干细胞(ES)。在某些实施方案中，所述ES细胞包含编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的April基因。在某些实施方案中，所述ES细胞包含含有人APRIL基因的外显子2至6的April基因。在某些实施方案中，所述ES细胞为啮齿动物ES细胞。在一些实施方案中，本发明的非人ES细胞为小鼠或大鼠ES细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的非人胚胎干细胞用于产生非人动物的用途。在某些实施方案中，非人胚胎干细胞是鼠的并且用于产生包含本文所述的April基因的小鼠。

在一些实施方案中，本发明提供了包含含有本文所述的April基因的非人胚胎干细胞、从所述非人胚胎干细胞制备、从其获得或从其产生的非人胚胎。在一些实施方案中，本发明的非人胚胎为啮齿动物胚胎。在一些实施方案中，本文所述的啮齿动物胚胎为小鼠或大鼠胚胎。

在一些实施方案中，本发明提供了产生从内源April基因座上的人源化April基因表达April蛋白的非人动物的方法，其中所述April蛋白包含人序列，所述方法包括以下步骤：用包含编码完整的或部分的人APRIL蛋白的人核苷酸序列的基因组片段靶向非人胚胎干(ES)细胞中的内源April基因(或基因座)，获得在内源April基因座上包含含有所述人序列的人源化April基因的经修饰的非人胚胎干(ES)细胞，和使用所述经修饰的胚胎干(ES)细胞产生非人动物。

在一些实施方案中，所述人核苷酸序列包含人APRIL基因的外显子2至6。在一些实施方案中，所述人核苷酸序列包含的人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在某些实施方案中，所述人核苷酸序列包含与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少100％同一性的人APRIL基因的外显子2至6。

在一些实施方案中，所述人核苷酸序列编码人APRIL蛋白的氨基酸残基87至250。在实施方案中，所述人核苷酸序列编码的人APRIL蛋白的氨基酸残基87至250与表3中所示的人APRIL蛋白的氨基酸残基87至250具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在某些实施方案中，所述人核苷酸序列编码与表3中所示的人APRIL蛋白的氨基酸残基87至250具有100％同一性的人APRIL蛋白的氨基酸残基87至250。

在一些实施方案中，本发明提供了通过本文所述的方法产生或从本文所述方法获得的(或可获得的)小鼠或大鼠。在某些实施方案中，通过本文所述的方法产生的或从本文所述方法获得的(或可获得的)小鼠或大鼠不以可检测方式表达全长内源(例如，小鼠或大鼠)April蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了用于提供其基因组包含April基因的小鼠的方法，所述April基因编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分，所述方法包括修饰小鼠的基因组，以使得其包含编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的April基因，由此提供所述小鼠。在一些实施方案中，April基因是本文所述的April基因。在一些实施方案中，April基因是编码其序列反映表3中所示的人源化April蛋白的蛋白质的基因。在某些实施方案中，April基因包含人APRIL基因的外显子2至6。

在多个实施方案中，本发明的人源化April基因包含人APRIL基因的外显子2、3、4、5和6。在多个实施方案中，本发明的人源化April蛋白的细胞外部分包含对应于表3中所示的人APRIL蛋白的残基87至250的氨基酸。在某些实施方案中，本发明的人源化April蛋白包含表3中所示的人源化April蛋白的序列。在多个实施方案中，本发明的人源化April基因可操作地连接至小鼠April启动子。

在一些实施方案中，本发明提供了将人细胞移植入小鼠中的方法，所述方法包括以下步骤：提供其基因组包含编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的April基因(如本文所述的)的小鼠，和将一个或多个人细胞移植入小鼠。在某些实施方案中，所述方法还包括测定小鼠中的一个或多个人细胞的植入的步骤。在某些实施方案中，测定的步骤包括将一个或多个人细胞的植入与在一个或多个野生型小鼠中或在一个或多个其基因组不包含编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的April基因的小鼠中的植入进行比较。

在某些实施方案中，人细胞是造血干细胞。在某些实施方案中，人细胞是人B细胞。

在一些实施方案中，静脉内移植所述人细胞。在一些实施方案中，腹膜内移植所述人细胞。在一些实施方案中，皮下移植所述人细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定或验证药物或疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：将药物或疫苗递送至本文所述的非人动物，和监测针对药物或疫苗的一种或多种免疫应答、药物或疫苗的安全特征、或对疾病或病况的效应。在一些实施方案中，监测安全特征包括确定非人动物是否因递送所述药物或疫苗而表现出副作用或不利反应。在一些实施方案中，副作用或不利反应选自发病率、死亡率、体重的改变、一种或多种酶(例如，肝)的水平的改变、一个或多个器官的重量的改变、功能(例如，感觉、运动、器官等)的丧失、增加的对一种或多种疾病的易感性、非人动物的基因组的改变、食物消耗的增加或减少以及一种或多种疾病的并发症。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的非人动物在开发用于医学诸如用作药剂的药物或疫苗中的用途。

在多个实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物，优选小鼠或大鼠。

如本申请中所用，术语“约”和“大致”可同等使用。本申请中与或不与约/大致一起使用的任何数字旨在涵盖由相关领域普通技术人员所理解的任何正常波动。

本发明的其它特征、目的和有利方面在以下的详细描述中是显而易见的。然而，应当理解，所述详细描述虽然指示了本发明的实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，而不是限制性的。根据详细描述，本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。

附图简述

本文中包括的由以下附图组成的附图仅用于举例说明目的而非用于限制。

图1显示示例性非人(例如，小鼠)和人增殖诱导配体(APRoliferation-InducingLigand，APRIL)基因的基因组组织的未按比例的示意图。外显子在每个外显子下方进行编号。

图2A和2B显示用于产生用于非人增殖诱导配体(April)基因的人源化的靶向载体的示例性方法的未按比例的示意图。非人序列以闭合的黑色符号显示。人序列以开放的斜线填充的符号显示。SDCNeo：自删除的新霉素选择盒。LoxP：Cre识别靶位点序列。CM：氯霉素选择盒。指示了限制性内切酶识别位点(例如，AsiSI、MluI、HindIII等)。

图3A和3B显示用于产生用于非人增殖诱导配体(April)基因的人源化的靶向载体的可选择的示例性方法的未按比例的示意图。非人序列以闭合的黑色符号显示。人序列以开放的斜线填充的符号显示。SDCNeo：自删除的新霉素选择盒。LoxP：Cre重组酶靶识别位点序列。CM：氯霉素选择盒。Spec：壮观霉素选择盒。Hyg：潮霉素选择盒。Frt：Flp重组酶靶识别位点序列。指示了限制性内切酶识别位点(例如，AsiSI、MluI、HindIII、I-CeuI等)。

图4显示(A)来自人源化April基因的mRNA转录物的未按比例的示意图，指示了人和小鼠外显子(例如，Ex1,Ex2等)和用于检测从人源化April基因表达的转录物的示例性引物的位置，和(B)显示从由野生型小鼠(n＝2)和对于人源化April基因是杂合的小鼠(n＝4)的骨髓和脾细胞分离的mRNA扩增的PCR产物的示例性电泳凝胶。从左至右：泳道1：空；泳道2：100bpDNA梯形条带(NewEnglandBiolabs)；泳道3：空；泳道4：野生型骨髓；泳道5：野生型骨髓；泳道6：人源化April骨髓；泳道7：人源化April骨髓；泳道8：人源化April骨髓；泳道9：人源化April骨髓；泳道10：野生型脾细胞；泳道11：野生型脾细胞；泳道12：人源化April脾细胞；泳道13：人源化April脾细胞；泳道14：人源化April脾细胞；泳道15：人源化April脾细胞；泳道16：空。500bp：指示泳道2中的分子量标志的较强条带的大小。

定义

本发明不限于描述的特定方法和所述实验条件，因为这样的方法和条件可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在进行限制，因为本发明的范围仅由权利要求限定。

除非另有定义，否则本文中使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中已获得的含义，除非明确地指出相反或根据其中使用所述术语或短语的上下文很明显相反。虽然与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现描述具体的方法和材料。所提及的所有出版物在此通过引用并入。

如本文中用于一个或多个目标值的术语“大致”是指与所述参照值相似的值。在某些实施方案中，除非另有所指或根据上下文明显不同，否则术语“大致”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参照值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围(除这样的数字将超过可能值的100％时以外)。

如本文中所用，术语“生物活性”是指在体外或体内(例如，在生物体中)在生物系统中具有活性的任何试剂的特征。例如，当存在于生物体中时在生物体内具有生物效应的试剂被认为具有生物活性。在具体的实施方案，当蛋白质或多肽具有生物活性时，该蛋白质或多肽的共有所述蛋白质或多肽的至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。

如本文中所用，术语“可比较的”是指两种或更多种试剂、实体、状况、条件组等可彼此不同但充分相似以允许它们之间进行比较，以使得可基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。本领域普通技术人员在上下文中将理解，在任何给定的情况下，对于两种或更多种这样的试剂、实体、状况、条件组等需要多大程度的同一性来被认为是可比较的。

如本文中用于保守氨基酸取代的术语“保守的”是指氨基酸残基被具有拥有相似的化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代。一般地，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的目标功能性质，例如，受体结合配体的能力。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括脂族侧链诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族-羟基侧链诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链诸如天冬氨酸和谷氨酸；和，含硫侧链诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组包括，例如，缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方案中，保守性氨基酸取代可以是丙氨酸对蛋白质中的任何天然残基的取代，如例如丙氨酸扫描诱变中所使用的。在一些实施方案中，保守取代是在Gonnet等(1992)ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequenceDatabase,Science256:1443-45(通过引用并入)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的取代。在一些实施方案中，如果取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值，则该取代被认为是“适度保守的”。

如本文中所用，术语“扰乱(disruption)”是指间断(例如，经由同源重组)DNA分子的事件的结果。在一些实施方案中，扰乱可实现或代表DNA序列的缺失、插入、倒位、修饰、替代、取代或其任意组合。在一些实施方案中，扰乱可在DNA的编码序列中实现或提供突变诸如错义突变、无义突变或移码突变或其任意组合的引入。在一些实施方案中，扰乱可存在于对于细胞是内源的基因或基因座中。在一些实施方案中，插入可包括完整基因或基因的片段例如外显子至细胞或基因组中的内源位点的插入。在一些实施方案中，插入可引入具有除将它们插入其中的内源序列的来源外的来源的序列。在一些实施方案中，扰乱可增加基因或基因产物的(例如，由基因编码的蛋白质的)表达和/或活性。在一些实施方案中，扰乱可减少基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施方案中，扰乱可改变基因或基因产物(例如，编码的蛋白质)的序列。在一些实施方案中，扰乱可截短或片段化基因或基因产物(例如，编码的蛋白质)。在一些实施方案中，扰乱可延长基因或基因产物；在一些这样的实施方案中，扰乱可实现融合蛋白的组装。在一些实施方案中，扰乱可影响基因或基因产物的水平而非活性。在一些实施方案中，扰乱可影响基因或基因产物的活性而非水平。在一些实施方案中，扰乱对基因或基因产物的水平可能没有显著影响。在一些实施方案中，扰乱对基因或基因产物的活性可能没有显著影响。在一些实施方案中，扰乱对基因或基因产物的水平或活性可能没有显著影响。

如本文中所用，短语"内源基因座"或“内源基因”是指在扰乱(例如，如本文所述的缺失、插入、倒位、修饰、替代、取代或其组合)引入之前，在亲代或参照生物体中发现的遗传基因座。在一些实施方案中，内源基因座具有天然发现的序列。在一些实施方案中，内源基因座是野生型。在一些实施方案中，含有本文所述的内源基因座的参照生物体是野生型生物体。在一些实施方案中，含有本文所述的内源基因座的参照生物体是工程改造的生物体。在一些实施方案中，参照生物体是实验室培育的生物体(无论是野生型还是工程改造的)。

短语"内源启动子"是指与内源基因天然关联(例如在野生型生物体中)的启动子。

如本文中所用，术语"异源的"是指来自不同来源的试剂或实体。例如，当参考多肽、基因或基因产物使用或存在于特定细胞或生物体中时，该术语阐明相关多肽、基因或基因产物1)是通过人工进行工程改造的；2)是通过人工(例如，经由遗传工程)引入细胞或生物体(或其前体)中的；和/或3)是由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)非天然地产生或非天然地存在于所述细胞或生物体中的。

如本文中所用，术语"宿主细胞"是指已将异源(例如，外源)核酸或蛋白质引入其中的细胞。本领域技术人员在阅读本公开内容后将理解，这样的术语不仅指特定的主题细胞，而且还用于指该细胞的后代。因为某些修饰可因突变或环境影响而在后续世代中发生，所以这样的后代事实上可不等同于亲本细胞，但仍被本领域技术人员理解为包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞是原核或真核细胞或包含原核或真核细胞。一般地，宿主细胞是适合于接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，而无论所述细胞被指定所属的生命界。可按照本公开内容用作宿主细胞的示例性细胞包括原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)的细胞、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属的多个种(Bacillusspp.)、链霉菌属的多个种(Streptomycesspp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物例如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如，CHOK1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如，HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60、(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮的)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、支持细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6^TM细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是分离的细胞或包含分离的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是组织的部分。在一些实施方案中，宿主细胞是生物体的部分。

如在本文中根据其本领域理解的含义所使用的术语"人源化”是指这样的核酸或蛋白质：所述核酸或蛋白质的结构(即，核苷酸或氨基酸序列)包括基本上或完全对应于在非人动物中天然发现的相关核酸或蛋白质的形式并且与在人中天然发现的对应形式是可区别的部分，以及还包括其结构与非人动物形式中存在的结构不同并且相反地更接近地对应于在人形式中发现的可比较的结构的部分。在一些实施方案中，“人源化”基因是编码具有与人多肽(例如，人蛋白质或其部分，例如其特征性部分)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的基因。只是给出一个例子，在膜受体的情况下，“人源化”基因可编码这样的多肽，所述多肽具有其氨基酸序列与人细胞外部分的氨基酸序列相同或基本上相同的细胞外部分，并且其的其余序列与非人(例如，小鼠)多肽的序列相同或基本上相同。在一些实施方案中，人源化基因包含人基因的DNA序列的至少一部分。在一些实施方案中，人源化基因包含在人基因中发现的完整DNA序列。在一些实施方案中，人源化蛋白质具有包含出现在人蛋白质中的部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，人源化蛋白质具有在人蛋白质中发现其完整序列的氨基酸序列。在一些实施方案(包括，例如，其中人源化蛋白质具有在人蛋白质中发现其完整序列的氨基酸序列的一些实施方案)中，人源化蛋白质从非人动物的内源基因座表达，所述内源基因座对应于编码所述蛋白质的相关人基因的同源物或直向同源物。

如在本文中关于序列的比较使用的，术语"同一性"是指如通过本领域中已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的许多不同算法中的任何算法测定的同一性。在一些实施方案中，使用ClustalWv.1.83(慢)比对(利用10.0的开放缺口罚分、0.1的延伸缺口罚分)和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTOR^TM10.0.2,MacVectorInc.,2008)测定本文所述的同一性。如本文中所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体关联性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，则它们被认为是彼此“基本上相同的”。如将由本领域技术人员所理解的，多种允许比较序列以测定它们的同源性程度的算法(包括当考虑哪些残基在不同序列中彼此“对应”时，通过允许在一个序列中相对另一个序列存在具有指定长度的缺口)是可获得的。两个核酸序列之间的百分比同一性的计算例如可通过出于最佳比较目的对齐所述两个序列(例如，可在第一和第二核酸序列之一或两者中引入缺口用于最佳比对并且出于比较目的可不考虑非对应序列)来进行。在某些实施方案中，出于比较目的而对齐的序列的长度为参照序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大体上100％。随后比较对应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置上的核苷酸相同的核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。两个序列之间的百分比同一性是由序列共有的相同位置的数目的函数，其考虑了出于两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数目和每一个缺口的长度。用于测定两个核苷酸序列之间的百分比同一性的代表性算法和计算机程序包括，例如，Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)，其已被整合进ALIGN程序(2.0版)(使用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分)。两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以可选择地例如使用利用NWSgapdna.CMP矩阵的GCG软件包中的GAP程序来测定。

如本文中所用，术语"分离的"是指这样的物质和/或实体，所述物质和/或实体(1)已与至少一些当最初产生(无论天然地还是在实验环境中)时与其关联的组分分离，和/或(2)通过人工设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其关联的其它组分分离。在一些实施方案中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文中所用，如果物质基本上不含其它组分，则其是“纯的”。在一些实施方案中，如将被本领域技术人员所理解的，物质在与某些其它组分例如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)组合后，仍可被认为是“分离的”或甚至“纯的”；在这样的实施方案中，计算物质在不包括这样的载体或赋形剂情况下的百分比分离或纯度。只是给出一个例子，在一些实施方案中，天然存在的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸a)在因其衍生的起源或来源而不与在其天然状态下天然伴随其的一些或全部组分关联时；b)在其基本上不含与天然产生其的物种相同的物种的其它多肽或核酸时；c)当由不是天然产生其的物种的细胞或其它表达系统表达或以其它方式与来自所述细胞或其它表达系统的组分关联时，被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成的或在与天然产生其的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是"分离的"多肽。可选择地或另外地，在一些实施方案中，已经历一种或多种纯化技术的多肽在其已与a)在自然界中与其关联的和/或b)当初始产生时与其关联的其它组分分离的程度上可被认为是“分离的”多肽。

如本文中所用，短语"非人动物"是指不是人的脊椎动物。在一些实施方案中，非人动物是圆口类鱼、硬骨鱼、软骨鱼(例如，鲨鱼或鳐)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物或鸟。在一些实施方案中，非人哺乳动物是灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物。在一些实施方案中，非人动物是啮齿动物诸如大鼠或小鼠。

如本文中所用，短语"核酸"在其最广义上是指被掺入或可被掺入寡核苷酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是通过磷酸二酯键联掺入或可通过磷酸二酯键联掺入寡核苷酸链的化合物和/或物质。如根据上下文将清楚的，在一些实施方案中，“核酸”是指一个或多个个体核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含个体核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”为RNA或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”为DNA或包含DNA。在一些实施方案中，核酸为一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸为一个或多个天然核酸残基类似物、包含一个或多个天然核酸残基类似物或由一个或多个天然核酸残基类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与天然核酸残基的差别在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸为一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个肽核酸或由一个或多个肽核酸组成，所述肽核酸在本领域中是已知的并且在主链中具有肽键而非磷酸二酯键，其被考虑在本发明的范围内。可选择地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚磷酰胺键联而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸为一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含一个或多个天然核苷、或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施方案中，核酸为一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基及其组合)、包含一个或多个核苷类似物或由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个相较于天然核酸中的糖经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)(即，包含一个或多个天然核苷糖类似物)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸具有包含一个或多个内含子的核苷酸序列。本领域普通技术人员将理解，多种技术可用于核酸的产生，并且所述技术在本领域中是已知的。例如，在一些实施方案中，核酸通过选自下述的方法来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶促合成、在重组细胞或系统中的复制、化学合成及其组合。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、20个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是单链的；在一些实施方案中，核酸是部分或完全双链的(即，包含至少两个其序列包括彼此杂交的互补元件的个体核酸链)。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施方案中，核酸具有酶促活性。

如本文中所用，短语"可操作地连接的"是指彼此直接或间接相互作用或以其它方式彼此协作以参与生物事件的组分或元件的物理并置(例如，在三维空间中)，所述并置实现或允许这样的相互作用和/或协作。只是给出一个例子，当将核酸中的控制序列(例如，表达控制序列)相对于编码序列定位以使得其的存在或不存在影响编码序列的表达和/或活性时，该控制序列被认为是与所述编码序列“可操作地连接的”。在许多实施方案中，“可操作连接”包括相关组分或元件彼此之间的共价连接。然而，本领域技术人员将容易地理解，在一些实施方案中，共价连接不是实现有效的可操作连接所需的。例如，在一些实施方案中，与它们控制的编码序列可操作地连接的核酸控制序列紧邻目标基因。可选择地或另外地，在一些实施方案中，一个或多个这样的控制序列反式或远程作用以控制目标编码序列。在一些实施方案中，如本文中所用，术语"表达控制序列"是指对于实现与它们连接的编码序列的表达和加工是必需的和/或足够的多核苷酸序列。在一些实施方案中，表达控制序列可以是如下序列或包含如下序列：适当的转录起始序列、终止序列、启动子和/或增强子序列；高效的RNA加工信号诸如剪接信号和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和/或，在一些实施方案中，增强蛋白质分泌的序列。在一些实施方案中，一种或多种控制序列优先或唯一地在特定的宿主细胞或生物体或其类型中具有活性。只是给出一个例子，在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，在许多实施方案中，控制序列通常包括启动子、增强子和/或转录终止序列。本领域普通技术人员根据上下文将理解，在许多实施方案中，术语“控制序列”是指其存在对于表达和加工是必需的组分，并且在一些实施方案中包括其存在对于表达是有利的组分(包括，例如，前导序列、靶向序列和/或融合伴侣序列)。

如本文中所用，术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有经工程改造的氨基酸序列，所述氨基酸序列通过人工活动设计和/或产生。

如本文中所用，术语"重组的"旨在指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、生成或分离的多肽(例如，如本文所述的信号调节蛋白)，诸如使用被转染入宿主细胞的重组表达载体表达的多肽，从重组的、组合的人多肽文库分离的多肽(HoogenboomH.R.,(1997)TIBTech.15:62-70；AzzazyH.和HighsmithW.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445；GavilondoJ.V.和LarrickJ.W.(2002)BioTechniques29:128-145；HoogenboomH和ChamesP.(2000)ImmunologyToday21:371-378)，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，例如，Taylor,L.D.等(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295；KellermannS-A.和GreenL.L.(2002)CurrentOpinioninBiotechnology13:593-597；LittleM.等(2000)ImmunologyToday21:364-370)，或通过牵涉将所选择的序列元件彼此剪接的任何其它手段制备、表达、生成或分离的多肽。在一些实施方案中，一个或多个这样的选择的序列元件是被天然发现的。在一些实施方案中，通过计算机设计一个或多个这样的选择的序列元件。在一些实施方案中，一个或多个这样的选择的序列元件由已知的序列元件(例如，来自天然的或合成的来源)的诱变(例如，体内或体外)产生。例如，在一些实施方案中，重组多肽包含在目标来源生物体(例如，人、小鼠等)的基因组中发现的序列。在一些实施方案中，重组多肽具有由诱变(例如，体外或体内，例如在非人动物中)产生的氨基酸序列，以使得所述重组多肽的氨基酸序列是虽然源自多肽序列且与多肽序列相关，但可以不是在体内天然地存在于非人动物的基因组中的序列。

如本文中所用，术语"替代"是指通过其将在宿主基因座中(例如，基因组中)发现的“被替代的”核酸序列(例如，基因)从该基因座移除并将不同的“替代”核酸置于该位置的过程。在一些实施方案中，被替代的核酸序列与替代核酸序列是相互可比较的，因为，例如，它们彼此同源和/或含有相应的元件(例如，蛋白质编码元件、调控元件等)。在一些实施方案中，被替代的核酸序列包含启动子、增强子、剪接供体位点、剪接接受位点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)中的一个或多个；在一些实施方案中，替代核酸序列包含一个或多个编码序列。在一些实施方案中，替代核酸序列是被替代的核酸序列的同源物。在一些实施方案中，替代核酸序列是被替代的序列的直向同源物。在一些实施方案中，替代核酸序列是或包含人核酸序列。在一些实施方案中，包括当替代核酸序列是或包含人核酸序列时，被替代的核酸序列是或包含啮齿动物序列(例如，小鼠序列)。这样放置的核酸序列可包含其是用于获得这样放置的序列的来源核酸序列的部分的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)。例如，在多个实施方案中，替代是用异源序列对内源序列的取代，所述取代导致从这样放置的核酸序列(包含所述异源序列)产生基因产物，但不表达内源序列；替代是用编码与由内源序列编码的蛋白质具有相似功能的蛋白质的核酸序列替代内源基因组序列(例如，内源基因组序列编码April蛋白，并且DNA片段编码一个或多个人APRIL蛋白)。在多个实施方案中，内源基因或其片段被对应的人基因或其片段替代。对应的人基因或其片段是作为被替代的内源基因或其片段的直向同源物的人基因或片段，或在结构和/或功能上与被替代的内源基因或其片段基本上相似或相同的人基因或片段。

如本文中所用，短语"增殖诱导配体"或“APRIL”或“April”是指肿瘤坏死家族配体，即TNF家族配体。APRIL是II型膜结合蛋白，其可在于弗林蛋白酶切割位点上蛋白水解加工后被释放为可溶性配体。APRIL在细胞表面上表达，并用作参与免疫细胞例如B细胞上的膜表面蛋白之间的相互作用的调节蛋白。已在人受试者以及啮齿动物中描述了几种变体，包括由选择性剪接事件产生的一些变体。通过举例说明，在表3中提供了小鼠和人APRIL基因的核苷酸和氨基酸序列。本领域技术人员在阅读本公开内容后将认识到，基因组中的一个或多个(或全部)内源April基因可被一个或多个异源April基因(例如，多态性变体、亚型或突变体、来自另一物种的基因、人源化形式，等等)替代。

如本文中所用，"表达APRIL的细胞"是指表达增殖诱导配体的细胞。在一些实施方案中，表达APRIL的细胞在其表面上表达增殖诱导配体。在一些实施方案中，APRIL蛋白以足以通过细胞表面上表达的APRIL蛋白介导细胞间相互作用的量在细胞的表面上表达。在一些实施方案中，表达APRIL的细胞表达呈可溶形式(即，不在细胞的表面上)的增殖诱导配体。示例性表达APRIL的细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。表达APRIL的细胞调节免疫细胞的相互作用以调节针对各种外来抗原或病原体的B细胞应答，包括类别转换至特定抗体同种型。在一些实施方案中，本发明的非人动物证明了经由在非人动物的一个或多个细胞的表面上表达的人源化April配体的免疫细胞调节。在一些实施方案中，本发明的非人动物促进包含异源造血干细胞(例如，人)的非人动物中的B细胞的长期存活。在一些实施方案中，本发明的非人动物促进包含异源造血干细胞(例如，人)的非人动物中的抗原特异性B细胞的长期存活。

如本文中所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或性质的定性状况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)进行至完成和/或进行至完全，或实现或避免绝对的结果。因而术语“基本上”在本文中用于捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。

如本文中所用，短语“基本上同源”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在对应的位置上含有同源残基，则它们通常被认为是“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如由本领域的普通技术人员所公知的，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的取代可通常被认为是“同源”取代。典型的氨基酸类别概述于表1和2中。

如本领域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多种算法的任何算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可得的那些算法诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的这样的程序描述于Altschul等，Basiclocalalignmentsearchtool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等，MethodsinEnzymology；Altschul等，"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997；Baxevanis等，Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysisofGenesandProteins,Wiley,1998；和Misener等，(编辑),BioinformaticsMethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology，第132卷),HumanaPress,1999。除了鉴定同源序列以外，上面提及的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的相应残基在相关的残基区段上是同源的，则该两个序列被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，相关区段是完全序列。在一些实施方案中，相关区段为至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或更多个残基。在一些实施方案中，相关区段包括沿着完全序列的连续残基。在一些实施方案中，相关区段包括沿着完全序列的不连续的残基。在一些实施方案中，相关区段为至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个残基。

表1

表2

如本文中所用，短语“基本上同一”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在对应的位置上含有相同残基，则它们通常被认为是“基本上同一的”。如本领域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多种算法的任何算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可得的那些算法诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性这样的程序描述于Altschul等，Basiclocalalignmentsearchtool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等，MethodsinEnzymology；Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997；Baxevanis等，Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysisofGenesandProteins,Wiley,1998；和Misener等，(编辑),BioinformaticsMethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology，第132卷),HumanaPress,1999。除了鉴定相同的序列以外，上面提及的程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的相应残基在相关的残基区段上是相同的，则该两个序列被认为是基本上同一的。在一些实施方案中，相关区段是完全序列。在一些实施方案中，相关区段为至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个残基。

如本文中所用，短语"靶向载体"或"靶向构建体"是指包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、组织或动物中的序列相同或基本上相同，并提供靶向构建体经由同源重组至所述细胞、组织或动物的基因组内的位置中的整合的序列。还包括使用位点特异性重组酶识别位点(例如，LoxP或Frt位点)进行靶向的靶向区域。在一些实施方案中，本发明的靶向构建体还包含特定目标核酸序列或基因、选择标记、控制和/或调控序列、以及允许通过帮助或促进牵涉这样的序列的重组的蛋白质的外源性添加介导的重组的其它核酸序列。在一些实施方案中，本发明的靶向构建体还包含完整或部分的目标基因，其中所述目标基因是编码具有与由内源序列编码的蛋白质相似的功能的完整或部分的蛋白质的异源基因。

如本文中所用，术语“变体”是指显示与参照实体的显著结构同一性但相较于所述参照实体在一个或多个化学部分的存在或水平上与所述参照实体结构上不同的实体。在许多实施方案中，变体还在功能上与其参照实体不同。一般地，特定实体是否被适当地认为是参照实体的“变体”是基于其与参照实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将理解的，任何生物或化学参照实体具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共享一个或多个这样的特征性结构元件的不同的化学实体。只是给出一些例子，小分子可具有特征性核心结构元件(例如，大环核)和/或一个或多个特征性侧基，以使得小分子的变体是共享核心结构元件和特征性侧基，但在其它侧基上和/或在存在于核心内的键的类型(单键相对于双键，E相对于Z，等)上不同的分子，多肽可具有包含在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或促成特定生物功能的多个氨基酸的特征性序列元件，核酸可具有包含在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置的多个核苷酸残基的特征性序列元件。例如，变体多肽可因氨基酸序列中的一个或多个差异和/或共价附接于多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物，脂质等)中的一个或多个差异而与参照多肽不同。在一些实施方案中，变体多肽显示与参照多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。可选择地或另外地，在一些实施方案中，变体多肽不与参照多肽共有至少一个特征性序列元件。在一些实施方案中，参照多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽共有参照多肽的一个或多个生物活性。在一些实施方案中，变体多肽缺少参照多肽的一个或多个生物活性。在一些实施方案中，变体多肽显示相较于参照多肽降低水平的一个或多个生物活性。在许多实施方案中，如果目标多肽具有与亲代的氨基酸序列相同但在特定位置上具有少数序列改变的氨基酸序列，则目标多肽被认为是亲代或参照多肽的“变体”。通常地，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基相较于亲代被取代。在一些实施方案中，变体相较于亲代具有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个取代的残基。通常，变体具有非常少的数目(例如，少于5个、4个、3个、2个或1个)的取代的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。此外，相较于亲代，变体通常具有不超过5个、4个、3个、2个或1个添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个残，且通常少于约5个、约4个、约3个或约2个残基。在一些实施方案中，亲代或参照多肽是天然发现的多肽。如将由本领域普通技术人员所理解的，特定目标多肽的多个变体通常可以是天然发现的，特别是当目标多肽是感染原多肽时。

如本文中所用，术语“载体”是指能够转运与其关联的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞诸如原核和/或真核细胞中进行染色体外复制和/或表达与它们连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。

如本文中所用，术语“野生型”具有其本领域中理解的含义，即指具有如在“正常”(相对于突变、患病的、改变的等)状态或背景中天然发现的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。

某些实施方案的详述

本发明提供了，除其它以外，具有编码增殖诱导配体蛋白(例如，APRIL)的人源化遗传物质的改良的和/或工程改造的非人动物。在某些实施方案中，这样的非人动物可用于例如移植物植入、免疫后B细胞活化和抗原特异性B细胞存活的测定。可以预期的是这样的非人动物提供了在人造血干细胞植入后免疫后B细胞活化和抗原特异性B细胞存活的改善。因此，本发明对于在非人动物中维持人造血细胞是特别有用的。具体地，本发明包括啮齿动物April基因的人源化，从而导致人源化蛋白质在非人动物的细胞的质膜表面上表达。这样的人源化蛋白质具有通过人源化April蛋白与存在于植入的人细胞的表面上的配体/受体的接合识别植入的人细胞的能力。在一些实施方案中，本发明的非人动物能够接受植入的人造血细胞；在一些实施方案中，这样的非人哺乳动物发展和/或具有包含人细胞的免疫系统。在一些实施方案中，人源化April蛋白具有由人APRIL基因的外显子2至6编码的序列。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含含有来自非人动物和异源物种(例如，人)的遗传物质的经遗传修饰的April基因。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含人源化April基因，其中所述人源化April基因包含人APRIL基因的外显子2、3、4、5和6。在一些实施方案中，人源化April蛋白的表达在非人April遗传物质(例如，非人April基因启动子)的控制之下。

在下面的章节中详细地描述本发明的各个方面。章节的使用不意味着限制本发明。每一个章节可用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意指“和/或”。

增殖诱导配体(APRIL)基因

增殖诱导配体(APRIL)是肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族的成员，由许多不同细胞类型(包括，但不限于树突状细胞、上皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、破骨细胞和T细胞)表达。APRIL(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员13、TNFSF13、CD256、TALL-2、TALL2、TRDL-1和ZTNF2)在细胞表面上表达为II型跨膜蛋白，并可通过在弗林蛋白酶共有位点上的切割在蛋白水解后以可溶形式释放。小鼠和人中的APRIL的基因结构是相似的，因为两种基因均含有6个外显子，前两个编码跨膜部分并且其余外显子编码蛋白质的细胞外部分。另外，在人和小鼠中，弗林蛋白酶切割位点由外显子2编码。对于小鼠和人，已经报道了选择性剪接变体。在人中，组合外显子1和3的选择性剪接产生因由外显子2编码的弗林蛋白酶切割位点的不存在而抵抗切割的膜结合形式。该变体已被命名为APRIL-δ。已经报导了跳过外显子3(APRIL-β)或剪接外显子6中的隐藏内含子(APRIL-γ)的其它选择性剪接变体。然而，在小鼠中一直未观察到这些剪接变体。相比之下，导致氨基酸残基120上的单个氨基酸差异的剪接变体已被报导，并且在与受体的结合上仅略有不同。

小鼠和人中的APRIL基因位于TNF配体超家族的另一基因-TNF相关的弱细胞凋亡诱导因子(TWEAK)的3’。值得注意的是，在小鼠和人中，已观察到独特的基因间剪接事件，其产生被称为TWE-PRIL的变体。在人中，该基因间剪接发生在TWEAK的外显子6与APRIL的外显子2之间，然而在小鼠中，该剪接存在于TWEAK的外显子7与APRIL的外显子1之间。已显示TWE-PRIL在体外刺激T和B细胞，并诱导增殖。

已报导的APRIL的受体包括跨膜激活因子和钙调节因子以及亲环素配体相互作用分子(TACI)和B细胞成熟抗原(BCMA)。相关的TNF家族配体(BAFF)也结合TACI和BCMA，以及第三受体BAFF-R。BAFF与BAFF-R的结合对于BAFF是独特的并且不被APRIL共享。

特别地，已对APRIL的作用在其在B细胞和T细胞应答的调节中的作用方面进行了研究。具体地，已报导APRIL在体外和体内刺激肿瘤细胞的生长。例如，Hahne等(1998,J.Exp.Med.188(6):1185-1190)报导了可溶性APRIL以剂量依赖性方式增加培养的肿瘤细胞的增殖，并且当以全长转染至肿瘤细胞中时，导致比模拟处理的细胞或野生型细胞更快速率的增殖。

APRIL序列

人和小鼠的示例性APRIL序列示于表3中。对于cDNA序列，连续外显子由交替下划线文本分隔。

表3

人源化April非人动物

提供了在非人动物的细胞(例如，树突状细胞)的表面上表达人源化April蛋白的非人动物。具体地，本发明提供了在其细胞的表面上表达人源化April蛋白的非人动物，所述蛋白由编码April蛋白的非人动物的内源基因座的遗传修饰编码和/或从其表达。本文中所示的合适的实例具体地以啮齿动物(特别是小鼠)为例进行说明。

在一些实施方案中，经遗传修饰的April基因包含来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中所述经遗传修饰的April基因编码包含来自异源物种的遗传物质的所编码部分的April蛋白。在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的APRIL基因包含异源物种的基因组DNA，其对应于在细胞的质膜上表达的April蛋白的细胞外部分。还提供了非人动物、胚胎、细胞和用于产生含有所述经遗传修饰的April基因的非人动物、非人胚胎、细胞的靶向构建体。

在一些实施方案中，内源April基因被删除。在一些实施方案中，内源April基因被改变，其中内源April基因的一部分被替代为异源序列(例如，人APRIL基因序列，完整或部分地)。在一些实施方案中，所有或基本上所有的内源April基因被替代为异源基因(例如，人APRIL基因)。在一些实施方案中，一部分异源APRIL基因被插入至内源非人April基因中。在一些实施方案中，异源基因是人基因。

本发明的非人动物在内源非人April基因座上含有完整的或部分的人APRIL基因。因此，这样的非人动物可被描述为具有人源化April基因。经替代的、插入的或修饰的内源April基因(即，人源化April基因)可以使用各种方法(包括例如PCR、Western印迹、Southern印迹、限制性片段长度多态性(RFLP)或等位基因的获得或丢失测定)来检测。

在多个实施方案中，根据本发明的人源化April基因包括具有第二、第三、第四、第五和第六外显子的April基因，所述外显子各自具有与表3的人APRIL基因中所示的第二、第三、第四、第五和第六外显子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列。

在多个实施方案中，根据本发明的人源化April基因包括具有与表3的人APRILcDNA序列中所示的核苷酸1007-2276具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的核苷酸编码序列(例如，cDNA序列)的April基因。

在多个实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化April蛋白具有与表3中所示的人APRIL蛋白的细胞外部分具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列的细胞外部分。

在多个实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化April蛋白具有与表3的人APRIL蛋白中所示的氨基酸残基87至250具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列的细胞外部分。

在多个实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化April蛋白具有与表3中所示的人源化APRIL蛋白的氨基酸序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

在多个实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化April蛋白具有与表3中所示的人APRIL蛋白的氨基酸序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或或更多)同一性的氨基酸序列。

提供了用于产生表达人源化April蛋白(包括特定的聚合物形式或等位基因变体(例如，单个氨基酸差异、选择性剪接变体等))的非人动物的组合物和方法，包括用于产生从人启动子和人调控序列或任选地从非人启动子和非人调控序列表达这样的蛋白质的非人动物的组合物和方法。在一些实施方案中，还提供了用于产生从内源启动子和内源调控序列表达这样的蛋白质的非人动物的组合物和方法。所述方法包括在非人动物的基因组中的对应于内源April基因的精确位置上插入完整或部分的编码人APRIL蛋白的遗传物质，从而产生表达完全或部分人的April蛋白的人源化April基因。在一些实施方案中，所述方法包括将对应于人APRIL基因的外显子2至6的基因组DNA插入非人动物的内源April基因，从而产生编码包含含有由插入的外显子编码的氨基酸的人部分的APRIL蛋白的人源化基因。

人源化April基因法采用内源基因的相对小的修饰，并且在多个实施方案中，因APRIL基因的基因组序列在单个片段中被修饰并从而通过包含必要调控序列保留正常功能性，而在非人动物中导致天然APRIL介导的信号转导。因此，在这样的实施方案中，April基因修饰不影响其它周围的基因或其它内源April基因。此外，在多个实施方案中，所述修饰不影响功能性跨膜蛋白在质膜上的组装，并通过细胞外部分与不受修饰影响的给定受体的结合和相互作用而维持与其受体的正常缔合。

图1中提供了内源性鼠和人APRIL基因的示意图(未按比例)。图2B中提供了人源化April基因的示意图(未按比例)。如所举例说明的，通过靶向构建体将含有人APRIL基因的外显子2至6的基因组DNA插入内源鼠April基因中。该基因组DNA包含编码负责受体结合的人APRIL蛋白的细胞外部分(例如，氨基酸87至250)的基因部分。

具有人源化April基因的非人动物(例如，小鼠)可通过本领域已知的任何方法制备。例如，可产生完整或部分地引入人APRIL基因和选择标记基因的靶向载体。图2A举例说明示例性靶向载体的构建的初始步骤，所述载体包含人APRIL基因的外显子2至6和位于人外显子3’的自删除新霉素盒(例如，两侧由LoxP序列侧接的新霉素抗性基因；参见US8,354,389和US8,518,392，所述两个专利均通过引用并入本文)。图2B举例说明包含使用图2A中描述的示例性靶向载体进行的人APRIL基因的外显子2至6的插入的小鼠基因组。如图所示，靶向构建体含有独特的5'和3'同源区域，这允许包含人APRIL基因的外显子2至6的人遗传物质通过同源重组进行精确插入。所述靶向构建体还含有自删除药物选择盒，其位于包含人APRIL基因的外显子2至6的遗传物质的3'。在同源重组后，人APRIL基因的外显子2至6被插入至内源鼠April基因中，所述内源鼠April基因已被专门工程改造来接受靶向载体中包含的人序列。产生人源化April基因，从而导致表达含有由人APRIL基因的外显子2至6编码的氨基酸的人源化April蛋白的细胞或非人动物。所述药物选择盒将以发育依赖性方式被去除，即，从其种系细胞含有上述人源化April基因的小鼠衍生的后代将在发育过程中从分化的细胞脱落选择标记。

通常取决于非人动物的预期用途，可如上所述或使用本领域中已知的方法制备本发明的非人动物以包含附加的人或人源化基因。可通过具有上述遗传修饰的细胞(例如胚胎干细胞)的基因组的进一步改变或通过本领域中已知的育种技术利用所需的其它经遗传修饰的品系，引入这样的附加的人或人源化基因的遗传物质。在一些实施方案中，制备本发明的非人动物以进一步包含选自BAFF-R、TACI和BCMA的一个或多个人或人源化基因。在一些实施方案中，制备本发明的非人动物以进一步包含人或人源化B细胞活化因子(BAFF)基因。在一些实施方案中，制备本发明的非人动物以进一步包含人或人源化TNF相关弱细胞凋亡诱导因子(TWEAK)。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含本文所述的人源化April基因和来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中所述遗传物质完整或部分地编码选自BAFF-R、TACI、BCMA、BAFF和TWEAK的一种或多种异源蛋白质。

除了具有上述人源化April基因的小鼠以外，本文中还提供了包含人源化APRIL基因的其它经遗传修饰的非人动物。在一些实施方案中，这样的非人动物包含可操作地连接至内源April启动子序列的人源化April基因。在一些实施方案中，这样的非人动物从内源April基因座表达人源化April蛋白，其中所述人源化April蛋白包含人APRIL蛋白的氨基酸残基87至250。

这样的非人动物可选自小鼠、大鼠、兔、猪、牛科动物(例如、母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，绒猴，猕猴)。对于其中适当的可经遗传修饰的ES细胞不容易获得的非人动物，采用其它方法来产生包含本文所述的遗传修饰的非人动物。这样的方法包括，例如，修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导的多能细胞)以及使用核转移来将经修饰的基因组转移至适当的细胞，例如卵母细胞，和在适当的条件下使经修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)在非人动物中妊娠以形成胚胎。

在一些实施方案中，本发明的非人动物是哺乳动物。在一些实施方案中，本发明的非人动物是小型哺乳动物，例如超家族跳鼠总科或鼠总科的哺乳动物。在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的动物是啮齿动物。在一些实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，本发明的啮齿动物选自超家族鼠总科。在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如，小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(攀鼠、岩鼠、具尾鼠(with-tailedrat)、马达加斯加大鼠和小鼠)，刺山鼠科(例如，刺榛睡鼠)和鼹形鼠科(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)的家族。在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的小鼠是来自鼠科的成员。在一些实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物。在某些实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，本发明的非人动物是小鼠。

在一些实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物，所述啮齿动物是选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在某些实施方案中，本发明的小鼠是选自由以下的品系组成的组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见，例如，Festing等，1999,MammalianGenome10:836；Auerbach等，2000,Biotechniques29(5):1024-1028,1030,1032)。在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在某些实施方案中，本发明的小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在某些实施方案中，本文所述的混合物的129品系为129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施方案中，本发明的小鼠为BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施方案中，本发明的小鼠为BALB品系和另一种前述品系的混合物。

在一些实施方案中，本发明的非人动物为大鼠。在某些实施方案中，本发明的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley品系、Fischer品系、F344、F6和DarkAgouti。在某些实施方案中，本文所述的大鼠品系为选自Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和DarkAgouti的两个或更多个品系的混合物。

使用具有人源化APRIL基因的非人动物的方法

已报导了April转基因和敲除非人动物(例如，小鼠)(Stein等，2002,J.Clin.Invest.,109(12):1587-1598；Castigli等，2004,Proc.Nat.Acad.Sci.,101(11):3903-3908；Xiao等，2008,Eur.J.Immunol.,38(12):3450-3458)。这样的动物已在多种测定中被用来测定APRIL表达、功能及调控的分子方面。然而，它们并非没有局限性。例如，April转基因小鼠的使用因转基因的特定表达模式而受到限制，这可合理地归因于构建体设计。此外，在这样的转基因小鼠中，只在4个转基因品系中的两个品系中观察到可检测的April表达，但只在T细胞而非其它细胞类型中观察到所述表达。表达人APRIL的转基因小鼠已产生与以往研究矛盾的结果。例如，接受几次重组人APRIL的注射的小鼠显示T细胞的完全活化，然而表达人APRIL的转基因小鼠未能如此显示。虽然April转基因小鼠已被证明在阐明一些APRIL介导的生物功能中是有用的，但它们已显示所获得的结果的可变性，这至少部分地基于用于产生它们的不同方法。因此，目前利用APRIL介导的生物学的体内系统是不完善的。APRIL介导的生物学功能和信号转导途径的分子方面的完全潜力在转基因小鼠中尚未被利用。

本发明的非人动物提供了可用于各种测定的表达人APRIL的生物材料(例如，细胞)的改善体内系统和来源。在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于开发靶向人APRIL和/或调节APRIL介导的信号转导途径的治疗剂。各个实施方案中，本发明的小鼠被用于筛选和开发结合人APRIL的候选治疗剂(例如，抗体)。在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于测定拮抗剂和/或激动剂人源化APRIL在本文所述的非人动物的细胞表面上的结合谱。

在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于测量阻断或调节人APRIL信号转导(例如，磷酸化)的治疗作用和因细胞变化而引起的对基因表达的作用。在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于测量阻断或调节人APRIL-TACI和/或APRIL-BCMA信号转导通路(例如，NF-κB介导的DNA转录的调节)的治疗作用。在多个实施方案中，将本发明的非人动物或从其分离的细胞暴露于结合非人动物的细胞表面上的人APRIL蛋白的候选治疗剂并且，在随后的一段时间后，分析对APRIL依赖性过程(例如，B和T细胞的刺激、肿瘤生长的刺激、抗原特异性B细胞(例如，浆细胞)的长期存活和NF-κB活化)的作用。

本发明的非人动物表达人源化April蛋白，从而细胞、细胞系和细胞培养物可被产生来用作用于结合和功能测定(例如以测定APRIL拮抗剂或激动剂的结合或功能，特别是当所述拮抗剂或激动剂特异于人APRIL蛋白或表位时)的人源化April的来源。在多个实施方案中，由本文所述的非人动物表达的人源化April蛋白可包含变体氨基酸序列。已报导了具有与配体结合残基相关的变异的变体人APRIL蛋白。在多个实施方案中，本发明的非人动物表达人源化April蛋白变体。在多个实施方案中，变体在与配体结合相关的氨基酸位置上是多态性的。在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于测定通过与人APRIL的多态性变体相互作用的配体结合的作用。在一些实施方案中，本发明的非人动物表达人APRIL的选择性剪接变体。在某些实施方案中，本发明的非人动物表达表3中所示的人APRIL剪接变体蛋白。

来自本发明的非人动物的细胞可被分离并基于特设的基础使用，或可维持在培养物中持续许多代。例如，来自本发明的非人动物的细胞可被用于本领域已知的多种细胞测定。在多个实施方案中，使来自本发明的非人动物的细胞永生化，并在培养物(例如，在连续培养物中)中无限期地维持。

在多个实施方案中，本发明的细胞和/或非人动物被用于存活和/或增殖测定(例如，使用B或T细胞)以筛选和开发调节人APRIL的候选治疗剂。自身反应性B细胞的存活在自体免疫性疾病诸如系统性红斑狼疮(SLE)的慢性病理学中起着重要作用，因此，可使用本发明的非人动物的细胞和/或本文所述的非人动物来鉴定、表征和开发候选APRIL调节剂(例如，拮抗剂)。在一些实施方案中，本发明的细胞和/或非人动物被用于存活测定以测定在APRIL存在或不存在的情况下的抗原特异性血浆B细胞的数目。

在多个实施方案中，本发明的细胞和/或非人动物被用于各种免疫方案以测定针对抗原的免疫应答中的APRIL介导的功能。在一些实施方案中，在本发明的非人动物中表征结合人APRIL或阻断人APRIL的一个或多个功能的候选治疗剂。合适的测量包括各种细胞测定、增殖测定、血清免疫球蛋白分析(例如，抗体滴度)、细胞毒性测定、配体-受体相互作用的表征(免疫沉淀测定)。在一些实施方案中，本发明的非人动物被用于表征调节针对抗原的免疫应答的APRIL介导的功能。在一些实施方案中，抗原与自身免疫性疾病或病况相关。在一些实施方案中，抗原是测试抗原(例如，卵白蛋白或OVA)。在一些实施方案中，抗原是与需要治疗的一个或多个患者所遭受的疾病或病况相关的靶。

在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于测定双链DNA(dsDNA)自身抗体产生的滴度的血清测定，以用于测试靶向人APRIL的候选治疗剂的药物毒理学方面。在一些实施方案中，本发明的非人动物中的双链DNA(dsDNA)自身抗体产生由非人动物中诱导的一个或多个自身免疫性疾病或病况引起。

在多个实施方案中，本发明的细胞和/或非人动物被用于表征在针对抗原的免疫应答中产生的抗体的库和/或特异性。在一些实施方案中，通过特异于本发明的非人动物的一个或多个组织的自身抗体的产生来表征免疫应答。在一些实施方案中，在本发明的非人动物中表征和/或开发化合物或生物试剂调节B细胞库的APRIL依赖性调节的治疗潜力。

在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于利用一种或多种抗原进行攻击以测定化合物或生物试剂调节免疫应答(包括但不限于针对给定抗原的特异性T细胞依赖性和B细胞依赖性应答)的APRIL依赖性调节的治疗潜力。

在多个实施方案中，本发明的非人动物被用于移植或继转移实验以测定化合物或生物试剂调节新的淋巴细胞及其免疫功能的APRIL依赖性调节的治疗潜力。在多个实施方案中，用人B细胞移植本发明的非人动物。

在多个实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用于T细胞测定，以测定化合物或生物试剂调节T细胞依赖性应答和功能的APRIL依赖性调节的治疗潜力。示例性T细胞测定包括，但不限于，ELISpot、细胞内细胞因子染色、主要组织相容性复合物(MHC)限制性、病毒抑制测定、细胞毒性测定、增殖测定和调节性T细胞抑制测定。

在多个实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用于肿瘤细胞生长测定，以测定化合物或生物试剂调节肿瘤细胞生长的APRIL依赖性调节和/或刺激的治疗潜力。

在多个实施方案中，在本发明的一个或多个非人动物中诱发自身免疫性疾病或病况，以提供用于测定化合物或生物试剂调节自身免疫性疾病或病况的一个或多个功能的APRIL依赖性调节的治疗潜力的体内系统。在一些实施方案中，自身免疫性病况是炎性病况，例如关节炎(例如，胶原诱导的关节炎，CIA)。

本发明的非人动物提供用于药物或疫苗的分析和测试的体内系统。在多个实施方案中，可将候选药物或疫苗递送至本发明的一个或多个非人动物，随后监测非人动物以测定针对药物或疫苗的一个或多个免疫应答、药物或疫苗的安全特征、或对疾病或病况的作用。用于测定安全特征的示例性方法包括毒性的测量、最佳剂量浓度、药物或疫苗的功效和可能的风险因素。可在这样的非人动物中改良和/或开发这样的药物或疫苗。

本发明的非人动物提供了用于开发和表征用于癌症的候选治疗剂的改良的体内系统。在多个实施方案中，可将肿瘤植入本发明的非人动物，随后施用候选治疗剂。可允许足够的时间以在非人动物内的一个或多个部位建立肿瘤。可在施用候选治疗剂之前和之后测量肿瘤细胞增殖、生长等。还可根据需要，在非人动物中测量候选治疗剂的细胞毒性。

本发明的非人动物提供了用于通过过继转移阐明人细胞间相互作用的机制的改良的体内系统。在多个实施方案中，可用肿瘤异种移植物植入本发明的非人动物，随后通过过继转移在非人动物中进行肿瘤浸润淋巴细胞的第二植入来测定消除实体瘤或其它恶性肿瘤的有效性。由于人APRIL的唯一性存在(不存在与非人动物的内源APRIL竞争)，可利用人细胞(例如，B细胞淋巴瘤)进行这样的实验。此外，可在这样的非人动物中改良和/或开发用于异种移植的治疗剂和药物。

本发明的非人动物提供了用于通过植入维持和开发人造血干细胞的改良的体内系统。在多个实施方案中，本发明的非人动物提供了人干细胞在非人动物内的改善的开发和维持。在多个实施方案中，在非人动物的血液、骨髓、脾和胸腺中观察到增加的分化的人B和T细胞群体。在多个实施方案中，本发明的非人动物提供了相较于表达内源非人和异源(例如，人)APRIL的非人动物升高的人造血干细胞植入水平。

本发明的非人动物提供了用于通过植入维持和开发人B细胞(例如，来自人供体)的改良的体内系统。在多个实施方案中，本发明的非人动物提供了人B细胞在非人动物中的改善的开发和维持。在多个实施方案中，在非人动物的血液、骨髓、脾或淋巴结的一个或多个中观察到增加的免疫后分化的人B细胞群体。在各个实施方案中，本发明的非人动物提供了相较于表达内源非人April的非人动物升高的人B细胞植入水平。

实施例

提供以下实施例，以描述本领域普通技术人员如何产生和使用本发明的方法和组合物，并且不旨在限制本发明人将其视为其发明的对象的范围。除非另有说明，否则温度以摄氏度表示，压力为大气压或接近大气压。

实施例1.内源非人增殖诱导配体(April)基因的人源化

本实施例举例说明在非人动物诸如啮齿动物(例如，小鼠)中人源化编码增殖诱导配体(April)的内源基因的示例性方法。已知人APRIL以几种变体(或等位基因)形式存在。按照需要，本实施例中描述的方法可用于使用任何人变体(或等位基因)或人变体(或等位基因或片段)的组合来人源化非人动物的内源April基因。在本实施例中，采用在人基因组组装(GRCh37)中出现的人APRIL基因来人源化小鼠的内源April基因。

使用细菌同源重组和技术来构建用于April基因的细胞外区域的人源化的靶向载体(参见，例如，U.S.6,586,251和Valenzuela等，High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,2003,NatureBiotech.21(6):652-659)。用于小鼠的内源April基因的人源化的示例性过程示于图2A和图2B中。

简言之，通过从头DNA合成(BlueHeronBiotech)产生含有人APRIL基因的外显子2至6的～2293bpDNA片段。在人APRIL基因序列的3’末端工程改造含有AsiSI、AgeI和MluI限制性识别位点的独特多接头。所述DNA片段还包含分别对应于小鼠April基因的内含子1和3’UTR的5’和3’侧翼小鼠序列。分别地，将侧连有来自质粒pFHa0019的重组酶识别位点(例如，LoxP；参见U.S.8,354,389和U.S.8,518,392，所述两个专利通过引用并入本文)的自删除新霉素盒工程改造以分别在盒的5’和3’末端含有独特的AsiSI和MluI限制性位点。用AsiSI和MluI分别消化含有侧连有小鼠April基因序列的人APRIL基因的外显子2至6的DNA片段和自删除新霉素盒，以产生相容性粘性片段。将所述片段连接在一起以将自删除盒插入在人APRIL外显子6与含有小鼠April基因的3’UTR的部分的3’侧翼小鼠序列之间。在氨苄青霉素(来自pUC载体)和新霉素(SDC)上选择阳性细菌克隆。通过PCR和限制性内切酶图谱法确认正确连接的片段。

单独地，对小鼠BAC克隆BMQ-223f24(Invitrogen)进行特异性修饰，以在细菌细胞中通过同源重组插入上述含有人APRIL基因的外显子2至6的工程改造的DNA片段。通过利用HindIII消化来线性化含有人APRIL基因的外显子2至6的DNA片段。随后将线性化的片段用于在细菌细胞中通过同源重组替代BAC克隆BMQ-223f24中对应的小鼠序列。使用氯霉素和新霉素选择含有小鼠April外显子2至6的～1776bp缺失的阳性克隆。最终的靶向载体从5'到3'含有小鼠基因组序列包括小鼠Tweak(Tnfsf12)基因和小鼠April基因的5’序列、小鼠April外显子1、～100bp的小鼠April基因的内含子1、～202bp的人APRIL基因的内含子1、人APRIL基因的外显子2至6、人APRIL基因的外显子6的3’的～126bp的人序列、侧连有LoxP重组酶识别位点的自删除新霉素盒、小鼠基因组序列包括小鼠April基因的3’UTR(包括出现在小鼠April基因中的终止密码子3’的～83bp)、小鼠基因组序列(包括小鼠April基因下游和小鼠Senp3基因上游的～350bp)、和小鼠Senp3基因。

将最终的靶向载体用于对BALB-Rag2^-/-IL2Rγc^-/-(DKO)小鼠胚胎干(ES)细胞进行电穿孔，以产生经修饰的ES细胞，所述经修饰的ES细胞在内源April基因座上包含从小鼠April基因的内含子1的大致中间(剪接供体位点3’的～100bp)至被大致插入在小鼠April基因的3’UTR的中间的人APRIL基因的多腺苷化位点的3’的约100bp被人源化的April基因(图2B)。通过检测人APRIL基因序列的存在和确认小鼠April序列的丧失的测定(Valenzuela等，同上)来鉴定含有人源化April基因的阳性靶向的ES细胞。表4显示了用于确认如上所述的内源April基因的人源化的引物和探针。hAPRIL:人APRIL；mApril：小鼠April。

随后使用法(参见，例如，U.S.7,294,754和Poueymirou等，F0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedEScellsallowingimmediatephenotypicanalyses,2007,NatureBiotech.25(1):91-99)，将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠，以产生含有人APRIL基因的外显子2至6至小鼠的内源April基因中的插入的一窝幼崽。通过使用测定检测人APRIL基因序列的存在的等位基因测定的改良法(Valenzuela等，同上)，对从剪尾物分离的DNA进行基因分型来再次确认具有内源April基因的外显子2至6的人源化的小鼠。对幼崽进行基因分型，并将对于人源化April基因是杂合的动物的队列选择用于进行表征。

或者，可利用同源重组通过BAC克隆的直接修饰来进行April基因的细胞外区域的人源化，而无需如上所述的从头DNA合成。对于此方法，可将出现在人BAC克隆CTD-2126o8中的人APRIL基因用于人源化小鼠的内源April基因。

简言之，对人BAC克隆CTD-2126o8(Invitrogen)进行修饰以删除包括起始于人APRIL基因的3’的约350bp处的人SENP3基因的人APRIL基因的3’区域。使用线性化的靶向载体(例如，pFHa0019)在细菌细胞中通过同源重组进行修饰，所述靶向载体含有侧连有重组酶识别位点(例如，LoxP，参见US8,354,389和US8,518,392，所述两个专利通过引用并入本文)的自删除新霉素盒和位于盒的3’上的独特AsiSI限制性位点。靶向载体的5’同源臂包括位于人BAC克隆的人APRIL与SENP3基因之间的基因组序列。靶向载体的3’同源臂包括BAC载体主链的序列。由与靶向载体的同源重组导致的经修饰的人BAC克隆示于图3A中。选择氯霉素/新霉素双抗性细菌克隆，将其生长用于制备含有人SENP3基因的缺失的经修饰的BACDNA。通过PCR和测序确认正确修饰的BAC克隆。

以类似的方式，在第二步骤中修饰经修饰的人CTD-2126o8BAC克隆(上述的)，以删除人BAC克隆中含有的5’人TWEAK基因。靶向载体被构建来包括含有BAC载体主链中的选择标记(例如，氯霉素)上游的BAC载体序列的5’同源臂。这允许通过由来自BAC载体主链的选择标记(例如，氯霉素)提供的抗性的丧失和来自靶向载体中的不同选择标记的抗性的获得，来容易地筛选所得的双靶向BAC克隆。此处使用的示例性选择标记是壮观霉素。利用含有独特限制性位点(例如，I-CeuI)和对应于人APRIL基因的内含子1的人基因组DNA序列的3’同源臂工程改造靶向载体。将在如图3A中被描绘为pSVi0029的靶向载体在细菌细胞中用于同源重组，以产生含有人TWEAK基因、人APRIL的外显子1和人SENP3基因的缺失的双靶向人BAC克隆。含有正确的双靶向人BAC克隆的所得细菌细胞是壮观霉素/新霉素抗性的。最终的人APRIL靶向载体从5’至3’含有壮观霉素盒、I-CeuI位点、～202bp的人APRIL基因的内含子1、人APRIL基因的外显子2至6、人APRIL基因的外显子6的3’的～126bp人序列、侧连有LoxP重组酶识别位点的自删除新霉素盒以及AsiSI位点。

单独地，通过在细菌细胞中进行同源重组来特异性修饰小鼠BAC克隆BMQ-223f24(Invitrogen)，以删除含有小鼠April基因的外显子2至6的小鼠基因组序列。示例性靶向载体可包含与存在于BAC克隆中的选择标记(例如，氯霉素)不同的的选择盒(例如，潮霉素)。将含有例如潮霉素盒的靶向载体工程改造，以附加含有分别对应于小鼠内含子1和包括小鼠April基因的3’UTR(包括出现在小鼠April基因中的终止密码子的3’的～83bp)的序列的小鼠基因组序列的5’和3’同源臂。还对靶向载体进行工程改造以在选择盒的5’和3’末端包含独特的限制性位点(例如，I-CeuI和AsiSI)。具有上述特征的示例性靶向载体pNTu0002示于图3B中。随后将线性化的靶向载体用于在细菌细胞中通过同源重组替代BAC克隆BMQ-223f24中的对应小鼠序列。使用氯霉素和潮霉素选择含有小鼠April外显子2至6的～1776bp缺失的阳性克隆。

用I-CeuI和AsiSI分别消化人APRIL靶向载体和含有小鼠April外显子2至6的缺失的经修饰的小鼠BAC克隆BMQ-223f24，以产生相容性粘性片段(图3B)。通过所述相容性限制性片段的连接产生的用于人源化小鼠April基因的最终的靶向载体从5’至3’含有小鼠基因组序列包括小鼠Tweak(Tnfsf12)基因和小鼠April基因的5’序列、小鼠April外显子1、～100bp的小鼠April基因的内含子1、～202bp的人APRIL基因的内含子1、人APRIL基因的外显子2至6、人APRIL基因的外显子6的3’的、～126bp人序列、侧连有LoxP重组酶识别位点的自删除新霉素盒、小鼠基因组序列包括小鼠April基因的3’UTR(包括出现在小鼠April基因中的终止密码子的3’的～83bp)、包括小鼠April基因下游和小鼠Senp3基因的上游的～350bp的小鼠基因组序列、以及小鼠Senp3基因。

将最终的人源化APRIL靶向载体用于对BALB-Rag2^-/-IL2Rγc^-/-(DKO)小鼠胚胎干(ES)细胞进行电穿孔以产生经修饰的ES细胞，所述经修饰的ES细胞包含从小鼠April基因的内含子1的大致中间(剪接供体位点的3’的～100bp)至被大致插入在小鼠April基因的3’UTR的中间的人APRIL基因的多腺苷酸化位点的3’的约100bp被人源化的April基因(图3B)。通过检测人APRIL基因序列的存在和确认小鼠April基因序列的丧失的测定(Valenzuela等，同上)鉴定含有人源化April基因的阳性靶向的ES细胞。表4显示了用于确认上文所述的内源April基因的人源化的引物和探针。hAPRIL：人APRIL；mApril：小鼠April。

使用法(参见，例如，U.S.7,294,754和Poueymirou等，F0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedEScellsallowingimmediatephenotypicanalyses,2007,NatureBiotech.25(1):91-99)将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠，以产生含有人APRIL基因的外显子2至6至小鼠的内源April基因中的插入的一窝幼崽。通过使用检测人APRIL基因序列的存在的等位基因测定的改良法(Valenzuela等，同上)，对从剪尾物分离的DNA进行基因分型来鉴定具有内源April基因的外显子2至6的人源化的小鼠。对幼崽进行基因分型，并将对于人源化April基因是杂合的动物的队列选择用于进行表征。

表4

实施例2.人源化增殖诱导配体(APRIL)在非人动物中的表达

本实施例举例说明人源化April基因在如实施例1中所述的非人动物的细胞中的特征性表达。人源化April基因编码包含连接至非人April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的April多肽。在本实施例中，使用位于人源化April基因的人和小鼠外显子序列中的引物，通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)确认包含小鼠April基因的外显子1和人APRIL基因的外显子2至6的mRNA转录物。

简言之，使用标准方法产生来自从野生型(WT)小鼠和对于人源化April基因是杂合的小鼠分离的骨髓和脾的细胞悬浮物。通过用补充有胎牛血清、丙酮酸钠、HEPES、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的完全RPMI培养基冲洗从股骨收集骨髓。用胶原酶D(RocheBioscience)灌注脾，利用基于氯化铵的裂解缓冲液(例如，ACK裂解缓冲液)裂解来自脾和骨髓制备物的红细胞，随后用完全RPMI培养基进行洗涤。使用TRIzol^TM(Invitrogen)或QiagenRNeasy^TMMini试剂盒(Qiagen)从脾和骨髓制备物提取RNA，并使用Superscript^TMIIIOne-StepRT-PCR系统(Invitrogen)，利用特异于小鼠April外显子1(mF1；AGTCAGAGAGCCAGCCCTT；SEQIDNO:25)和人APRIL外显子5(hR3；ACATCGGAATAGAGTCTCCTGC；SEQIDNO:26)的引物进行引发。通过琼脂糖电泳分析来自每一个反应的等分式样(5–10μL)(图4)。使用mF1和hR3引物产生的预测扩增产物为526bp。对反应产物进行凝胶纯化，并通过测序进行确认。

如图4中所示，在杂合小鼠的脾和骨髓中清楚地检测到编码包含连接至非人April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的April多肽的转录物的表达。

等同物

在如此地描述了本发明的至少一个实施方案的几个方面后，本领域技术人员将理解，各种改变、修改和改良对于本领域技术人员来说将可容易地进行。这样的改变、修改和改良旨在是本公开内容的一部分，且旨在处于本发明的精神和范围之内。因此，前述说明书和附图仅仅作为示例的方式，并且本发明通过下面的权利要求进行详细描述。

在权利要求中使用序数术语如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求元素，其本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先性、优先级或顺序或者其中执行方法行为的时间顺序，而是仅用作区分具有某一名称的一个权利要求元素与具有同一名称的另一个元素(但使用序数术语)的标记，以区分权利要求元素。

除非明确地指出相反，否则冠词“a(一个/种)”和“an(一个/种)”在本说明书和权利要求中应被理解为包括复数的所指对象。除非指出相反或根据上下文明显不同，否则如果组成员的一个、多于一个或全部存在于、应用于或以其它方式相关于给定的产物或过程，则在该组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足的。本发明包括其中组的正好一个成员存在于、应用于或以其它方式相关于给定的产物或过程的实施方案。本发明还包括其中多于一个或全部组成员存在于、应用于或以其它方式相关于给定的产物或过程的实施方案。此外，应理解，除非以其它方式指出或除非对于本领域普通技术人员很明显的会产生矛或不一致，否则本发明包括其中将来自一个或多个所列的权利要求的一个或多个限制、元素、条款、说明性术语等引入另一项依赖于相同基础权利要求(或，相关地，任何其它要求)的权利要求的所有变化、组合和排列。当元素被表示为列表(例如，以马库什组或类似格式)时，应当理解，元件的每一个亚组也被公开，并且可从组中移除任何元素。应理解，一般地，当本发明或本发明的方面被称为包含特定元素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由或基本上由这样的元素、特征等组成。为简单起见，那些实施方案没有在每一种情况下以如此多的语句具体地示于本文中。还应该理解的是，本发明的任何实施方案或方面可从权利要求被明确地排除在外，而不管特定排除是否记载于说明书中。

本领域技术人员将理解可归因于本文所述的测定或其它方法中获得的值的典型标准偏差或误差。

本文中提及的描述本发明的背景和提供关于其实践的另外细节的出版物、网站和其它参照材料在此通过引用并入。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含用含有人APRIL基因的外显子2-6的人基因组区段对内源啮齿动物增殖诱导配体(April)基因的外显子2-5和部分外显子6的替代以形成人源化April基因，其中所述替代是在内源啮齿动物April基因座上，其中所述人源化April基因处于所述内源啮齿动物April基因座上的啮齿动物April启动子的控制之下，并且编码人源化April蛋白，所述人源化April蛋白包含连接至由所述小鼠April基因编码的小鼠April蛋白的细胞内部分的由所述人APRIL基因编码的人APRIL蛋白的细胞外部分，并且其中所述经遗传修饰的啮齿动物表达所述人源化April蛋白。

2.权利要求1的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物不以可检测地表达全长内源啮齿动物April蛋白。

3.权利要求1或2的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

4.权利要求3的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠。

5.权利要求4的经遗传修饰的啮齿动物，其中被替代的内源小鼠April基因的基因组区段包含所述内源小鼠April基因的外显子2、3、4和5以及部分外显子6。

6.权利要求5的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化April蛋白包含SEQIDNO：5的氨基酸87至250。

7.权利要求6的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化April基因包含所述内源小鼠April基因的外显子1。

8.权利要求7的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化April蛋白包含SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。

9.一种啮齿动物胚胎干(ES)细胞，其基因组包含用含有人APRIL基因的外显子2-6的人基因组区段对内源啮齿动物April基因的外显子2-5和部分外显子6的替代以形成人源化April基因，其中所述替代是在内源啮齿动物April基因座上，其中所述人源化April基因处于所述内源啮齿动物April基因座上的啮齿动物April启动子的控制之下，并且编码人源化April蛋白，所述人源化April蛋白包含连接至由所述啮齿动物April基因编码的啮齿动物April蛋白的细胞内部分的由所述人APRIL基因编码的人APRIL蛋白的细胞外部分。

10.一种啮齿动物胚胎，其由权利要求9的ES细胞产生。

11.权利要求9的啮齿动物ES细胞或权利要求10的啮齿动物胚胎，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

12.一种产生从内源April基因座表达人源化April蛋白的啮齿动物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用含有人APRIL基因的外显子2-6的基因组区段替代啮齿动物胚胎干(ES)细胞中的内源April基因座上的内源啮齿动物April基因的基因组区段，以在内源啮齿动物April基因座上形成人源化April基因，其中所述人源化April基因处于所述内源啮齿动物April基因座上的啮齿动物April启动子的控制之下，并且编码人源化April蛋白，所述人源化April蛋白包含连接至由所述啮齿动物April基因编码的啮齿动物April蛋白的细胞内部分的由所述人APRIL基因编码的人APRIL蛋白的细胞外部分；

(b)获得在内源啮齿动物April基因座上包含所述人源化April基因的经修饰的啮齿动物ES细胞；和

(c)使用(b)的经修饰的ES细胞产生啮齿动物。

13.权利要求12的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

14.权利要求12或13的方法，其中所述啮齿动物不以可检测地表达全长内源啮齿动物April蛋白。

15.一种将人细胞移植入小鼠的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供小鼠，所述小鼠的基因组包含用含有人APRIL基因的外显子2-6的人基因组区段对内源小鼠April基因的外显子2-5和部分外显子6的替代以形成人源化April基因，其中所述替代是在内源小鼠April基因座上，其中所述人源化April基因处于所述内源小鼠April基因座上的小鼠April启动子的控制之下，并且编码人源化April蛋白，所述人源化April蛋白包含连接至由所述小鼠April基因编码的小鼠April蛋白的细胞内部分的由所述人APRIL基因编码的人APRIL蛋白的细胞外部分；和

(b)将一个或多个人细胞移植入所述小鼠。

16.权利要求15的方法，其中所述人细胞是人造血干细胞。

Claims (52)

1.一种表达April多肽的非人动物，所述April多肽包含连接至非人April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分。

2.权利要求1的非人动物，其中所述人APRIL蛋白的细胞外部分由人APRIL基因的外显子2至6编码。

3.权利要求2的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少50％的同一性。

4.权利要求2的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少60％的同一性。

5.权利要求2的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少70％的同一性。

6.权利要求2的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少80％的同一性。

7.权利要求2的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少90％的同一性。

8.权利要求2的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6相同。

9.前述权利要求的任一项的非人动物，其中所述非人动物不以可检测方式表达全长内源April蛋白。

10.前述权利要求的任一项的非人动物，其中所述April多肽从内源April基因座上的人源化April基因表达。

11.权利要求10的非人动物，其中所述人源化April基因包含非人April外显子1。

12.权利要求11的非人动物，其中所述人源化April基因还包含完整或部分的非人April外显子6。

13.一种包含人源化April基因的非人动物，所述人源化April基因包含可操作地连接至APRIL启动子的人APRIL基因的一个或多个外显子。

14.权利要求13的非人动物，其中所述APRIL启动子为非人April启动子。

15.权利要求13的非人动物，其中所述APRIL启动子为人APRIL启动子。

16.权利要求13-15的任一项的非人动物，其中所述人源化April基因包含人APRIL基因的外显子2至6。

17.权利要求16的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少50％的同一性。

18.权利要求16的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少60％的同一性。

19.权利要求16的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少70％的同一性。

20.权利要求16的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少80％的同一性。

21.权利要求16的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6具有至少90％的同一性。

22.权利要求16的非人动物，其中所述人APRIL基因的外显子2至6与表3中所示的人APRIL基因的外显子2至6相同。

23.权利要求13-22的任一项的非人动物，其中所述人源化April基因包含非人April外显子1。

24.权利要求23的非人动物，其中所述人源化April基因还包含完整的或部分的非人April外显子6。

25.前述权利要求的任一项的非人动物，其中所述非人动物为啮齿动物。

26.一种人源化April基因，其包含可操作地连接至人APRIL基因的一个或多个外显子的非人April基因的一个或多个外显子。

27.权利要求26的人源化April基因，其中所述人源化APRIL基因包含可操作地连接至人APRIL外显子2至6的非人April外显子1。

28.权利要求27的人源化April基因，其中所述人源化APRIL基因还包含侧翼连接所述非人April外显子1和所述人APRIL外显子6的5’和3’非人非翻译区。

29.一种April多肽，其由权利要求26-28的任一项的人源化April基因编码。

30.一种分离的细胞或组织，其是权利要求1-25的任一项的非人动物的分离的细胞或组织。

31.一种分离的细胞，其包含权利要求26-28的任一项的人源化April基因。

32.一种小鼠胚胎干细胞，其包含权利要求26-28的任一项的人源化April基因。

33.一种小鼠胚胎干细胞，其基因组包含编码连接至非人April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的人源化April基因。

34.权利要求33的ES细胞，其中所述人源化April基因包含人APRIL基因的外显子2至6。

35.权利要求32、33或34的小鼠ES细胞用于产生小鼠的用途。

36.一种小鼠胚胎，其产生自从权利要求32、33或34的胚胎干细胞。

37.一种产生从内源April基因座表达April蛋白的非人动物的方法，其中所述April蛋白包含人序列，所述方法包括以下步骤：

(a)用包含编码完整或部分的人APRIL蛋白的人核苷酸序列的基因组片段靶向非人ES细胞中的内源April基因座上的内源April基因；

(b)获得在内源April基因座上包含含有(a)的人序列的人源化April基因的经修饰的非人ES细胞；和

(c)使用(b)的经修饰的ES细胞产生非人动物。

38.权利要求37的方法，其中所述人核苷酸序列包含人APRIL基因的外显子2至6。

39.权利要求37的方法，其中所述人核苷酸序列编码人APRIL蛋白的氨基酸残基87至250。

40.权利要求37-39的任一项的方法，其中所述非人动物为小鼠或大鼠。

41.一种小鼠或大鼠，其可从权利要求37-40的任一项的方法获得。

42.一种提供小鼠的方法，所述小鼠的基因组包含编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的人源化April基因，所述方法包括：

修饰小鼠的基因组，以使得其含有编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的人源化April基因，由此提供所述小鼠。

43.权利要求42的方法，其中所述人源化April基因包含人APRIL基因的外显子2至6。

44.一种将人细胞移植入小鼠的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供其基因组包含编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的人源化April基因的小鼠；和

(b)将一个或多个人细胞移植入所述小鼠。

45.权利要求44的方法，其还包括以下步骤：

(c)测定所述小鼠中的一个或多个人细胞的植入。

46.权利要求45的方法，其中测定的步骤包括：

将所述一个或多个人细胞的植入与在一个或多个野生型小鼠中或在一个或多个其基因组不包含编码连接至小鼠April蛋白的细胞内部分的人APRIL蛋白的细胞外部分的人源化April基因的小鼠中的植入进行比较。

47.权利要求44-46的任一项的方法，其中所述人源化April基因包含人APRIL基因的外显子2至6。

48.权利要求44-46的任一项的方法，其中所述人APRIL蛋白的细胞外部分包含对应于表3中所示的人APRIL蛋白的残基87至250的氨基酸。

49.权利要求44-48的任一项的方法，其中所述人细胞是造血干细胞。

50.权利要求44-49的任一项的方法，其中静脉内移植所述人细胞。

51.权利要求44-49的任一项的方法，其中腹膜内移植所述人细胞。

52.权利要求44-49的任一项的方法，其中皮下移植所述人细胞。