CN105785035B - 一种用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒，该试剂盒包括DCD抗体和DCD标准品。DCD作为原发性肝细胞癌的血清标志物，具有较高的准确度、较高的可行性和较广的适用性，该试剂盒具有较有较高的准确度。

Description

一种用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒。
背景技术
肝癌即肝脏恶性肿瘤，是外科疾病中的常见病和多发病，肝脏恶性肿瘤可分为原发性和继发性两大类。原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，简称HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤中位居世界第5位，死亡率居第2位。HCC在我国占全球肝癌发病率及死亡率的一半，且发病率正在逐年升高，严重威胁着人类的健康。
目前可作为诊断HCC的补充指标有AFP、CEA，CA242，AFU，GP73，GPC3等。而这些指标存在诊断率不高等等问题。
Dermcidin(DCD)第一次是从人体汗液中分离出来的一种天然活性肽，其编码基因dermcidin最初被认为在汗腺中特异性表达。DCD在汗腺中表达并分泌至汗液中，具有抗菌活性。后来Porter等研究发现在前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺组织、肝细胞中都有dermcidin的表达，并同时证实它是一种潜在的致癌因子。
研究证明，DCD是作为在组织缺氧或氧化性应激状态下前列腺癌细胞，氧化性应激下肝瘤细胞的存活因子。Porter(2003)等证明DCD的表达和乳腺癌细胞的增长和生存有关，DCD被认为是乳腺癌的癌基因。Cunningham等研究了氧化性应激在神经元变性的作用和证明了一种由30个氨基酸组成的生存促进肽，名为Y-P30。后来证明Y-P30是110氨基酸多肽的组成部分，Cunningham称之为DSEP，发现神经元细胞可以增强抵抗氧化性应激。
DCD基因位于12q13.1染色体上，编码不同生物功能的蛋白质。110氨基酸多肽蛋白包含47个氨基酸组成的DCD-1肽和30个氨基酸组成的诱导蛋白酶水解的核心肽，后者和Y-P30是一致的。DCD蛋白与恶病质伴随蛋白和DSEP是一致的。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒，包括DCD标准样品和DCD抗体。
作为优选，所述DCD抗体的制备方法如下：向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kgb.w.的剂量皮下注射DCD标准样品进行免疫，第5天以同样的剂量再次免疫，第15天收集存活小鼠或大鼠的血清，凝胶电泳分离出DCD抗体。
作为优选，该试剂盒还包括生物素标记抗体。
作为优选，该试剂盒还包括含HRP的亲和素。
作为优选，该试剂盒还包括TMB显色液、TMB终止液和PBS缓冲液。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供一种用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒，该试剂盒包括DCD抗体和DCD标准品。DCD作为原发性肝细胞癌的血清标志物，具有较高的准确度、较高的可行性和较广的适用性。该试剂盒具有较有较高的准确度。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为实施例1的DCD的标准曲线图；
图2为检测实施例2的DCD和AFP作为原发性肝细胞癌的血清标志物的ROC曲线图。
具体实施方式
在以下具体实施方式中，本中心收集了33例乙肝肝硬化、82位已确诊的肝癌患者和44例健康对照者的血清样本，通过Elisa方法检测血清中DCD的含量，并采用电化学发光免疫分析法分别检测AFP指标，即目前最常用的原发性肝癌血清检查项目；分别分析以上述DCD和AFP血清标志物的含量分布曲线和ROC曲线，以研究DCD作为原发性肝细胞癌的血清标志物的准确性和可行性。
如未特别说明，以下具体实施方式中，所采用的试剂或仪器设置均可通过市售途径获得。
实施例1：DCD的检测方法
DCD检测采用用于诊断原发性肝细胞癌的试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：1、冻干DCD标准样品购自Kamiya Biomedical Company；2、生物素标记抗体；3、含HRP的亲和素；4、TMB显色液；5、TMB终止液；6、PBS缓冲液；7、DCD抗体。
其中，DCD抗体的制备方法如下：向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kg b.w.的剂量皮下注射DCD标准样品进行免疫，第5天以同样的剂量再次免疫，第15天收集存活小鼠或大鼠的血清，凝胶电泳分离出DCD抗体。
DCD的检测包括以下步骤：
1)采血：取受试者清晨空腹外周静脉血8mL，静置30分钟，离心采集血清样本，储存于-80℃超低温冰箱备用；
2)配制标准样品梯度液：取标准样品，使用PBS缓冲液稀释至浓度为50ng/mL，再依次等体积稀释得到25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL一组7个浓度的标准溶液；
4)加样：将DCD抗体预包被于96孔板；分别取标准溶液和血清样本加至板孔后依次加入生物素标记抗体；取TMB显色液加入板孔作为对照孔；96孔板加上盖，37℃反应；
5)加含HRP的亲和素：加入质量分数为10％的吐温水溶液洗涤，将含HRP的亲和素加入除对照孔以外的板孔，37℃反应；
6)显色检测：加入洗涤液洗涤，加入TMB显色液，37℃反应；加入TMB终止液；酶标仪在450nm测定O.D.值；标准溶液、TMB显色液的吸光值如表1所示。
表1DCD的标准溶液的浓度与吸光值
以浓度为纵坐标X，以O.D.值为横坐标Y，作标准曲线，得到标准方程Y＝0.049X+0.215，R2＝0.986。
7)计算浓度：通过标准曲线计算血清样本中DCD的浓度。
实施例2：AFP的含量的检测方法
受试者血清中AFP的含量采用Cobas E601化学发光分析仪进行分析检测。在无尘通风良好、无直接日照的环境中，采用无菌去离子水，对血清样本中的AFP指标进行分析。
检测结果分析
1、原发性肝细胞癌患者的临床病理特征
本中心收集的原发性肝细胞癌患者的年龄范围为29-84岁之间，男性63人，女性19人。其中，与HBV感染相关的有37人，占40.2％。肿瘤直径大于5CM的有46例，占56.1％，有40例发生转移，占48.8％。
检测实施例1、受试者DCD和AFP含量水平中位数、IQR比较
本中心对肝硬化、肝癌患者和健康对照者血清中，DCD和AFP含量水平进行比较，其结果见表2。
表2肝硬化、肝癌和健康对照者的DCD和AFP含量水平比较(中位数，IQR)
注：IQR:四分位间距
由表2可知，HCC组血清中DCD的含量(中位数27.03，IQR范围20.84-34.71ng/mL)显著高于健康组(18.98，13.19-24.26ng/mL)或肝硬化组(24.78，20.22-30.00ng/mL)。HCC组血清中AFP的含量(54.09，3.85-2311.57ng/ml)同样显著高于健康组(5.45，3.44-6.78ng/ml)或肝硬化组(3.79，2.34-11.52ng/ml)。差别有意义(P<0.01)。
检测实施例2、DCD作为原发性肝细胞癌的血清标志物与AFP的准确度比较
DCD和AFP作为原发性肝细胞癌的血清标志物，经本中心对肝癌患者的血清中DCD和AFP的含量数据收集和模拟计算、分析，得出ROC曲线图如图2所示，其ROC曲线下面积数据如表3所示，其可行性评价数据如表3所示。
表3DCD和AFP作为HCC血清标志物的ROC曲线下面积
由图2和表3可知，DCD比AFP有更大的曲线下面积(AUC＝0.769vs.0.729)。
表4DCD和AFP作为HCC血清标志物的准确度评价
如表4所示，对于肝癌，AFP的最佳判断界值为9.86ng/mL(AUC＝0.729；95％CI,49.6％-71.6％；敏感性，61.00％；特异性，100.00％)，与文献公开的10ng/mL界值相近。而DCD的最佳判断界值为25.75ng/mL(AUC＝0.769；95％CI：43.50-65.9；敏感性,54.88％；特异性,88.64％)。
单独DCD比单独AFP作为原发性肝细胞癌的血清标志物的准确度要高。联合DCD和AFP比单独DCD或AFP判断HCC的准确度高(AUC＝0.905，p<0.001)。
检测实施例3、DCD作为原发性肝细胞癌的血清标志物的拓展性研究
对于HCC转移组和无转移组，其DCD和AFP含量水平如表5所示。
表5HCC转移组和无转移组的DCD与AFP含量水平比较(中位数，IQR)
由表5可知，DCD作为原发性肝细胞癌的血清标志物，对判断HCC有无转移具有意义，p<0.001。
检测实施例4、DCD作为原发性肝细胞癌的血清标志物的适用性研究
4.1受试者的年龄、性别的统计数据如表6、表7所示，
表6DCD对受试者性别的适用性研究(中位数，IQR)
表7DCD对受试者年龄的适用性研究(中位数，IQR)
由表6和表7可知，DCD作为HCC的血清标志物，在不同性别和不同年龄的受试者上的表达没有明显差异，其具有较广的适用性。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (1)

1.检测DCD的试剂在用于制备诊断原发性肝细胞癌的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒包括DCD标准样品、DCD抗体、生物素标记抗体、TMB显色液、TMB终止液、PBS缓冲液、含HRP的亲和素和10%的吐温水溶液；所述试剂盒的检测样本为血清；所述DCD抗体的制备方法如下：向成年小鼠或大鼠以0.1-0.5mL/kg b.w.的剂量皮下注射DCD标准样品进行免疫，第5天以同样的剂量再次免疫，第15天收集存活小鼠或大鼠的血清，凝胶电泳分离出DCD抗体；所述试剂盒中DCD的判断界值为25.75ng/mL。
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