CN103543145B - 基于化学发光酶联免疫分析的潜在指纹成像的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于化学发光酶联免疫分析的潜在指纹成像的方法，包括：将指印转移到基底上，得到指印样本；往所述指印样本的指印上加入手指代谢物的抗体溶液进行孵育，孵育完成后用缓冲液进行冲洗；将所述的指印样本干燥，然后向指印上加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育；孵育后，用所述的缓冲液冲洗指印样本，干燥后将指印样本置于化学发光反应底物溶液中，采集指纹图像。本发明的方法简单、快速、发光强度高，成像效果好。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和指纹检测技术领域，尤其涉及一种基于化学发光酶联免疫分析的潜在指纹成像的方法。
背景技术
潜在指纹是经身体自然分泌物（如汗液）转移形成的指纹纹路，目视不易发现，是案发现场中最常见的指纹。据我国各地不完全统计，警方侦破的刑事案件中，利用指纹破案占七成以上，并且比例正在逐年上升。通常情况下，指纹是犯罪分子在现场留下的最直接物证，所以，研究潜在指纹的显现技术，是提高指纹物证的采取率和利用率的重要环节。
现代指纹学的发展已经具有上百年的历史，按照显现原理的不同，传统的潜在指纹显现方法主要分为三类：光学显现法、化学显现法以及物理吸附法。其基本原理是使用一种光线或物质作用于指纹印痕的汗液物质，使不能看见的潜在指纹变为可见的。发展至今，指纹检测不仅在法医鉴定、个体识别方面起着重要作用，同时广泛应用于日常生活中的安全检验、访问控制、个人认证等领域。近年来随着分析科学的发展，人们对指纹的研究已不仅仅停留在利用传统物理或化学手段对其形貌进行观察，同时更加致力于发展各种新兴技术如质谱成像、红外/拉曼成像、扫描电化学显微镜以及荧光免疫成像等，对指纹中的成分进行分析检测，从而发掘出更多有价值的生物学和医学信息。比如，恐怖分子是否接触过爆炸物、一个人是否具有吸烟的习惯，科学家都可以通过指纹检测来获取相关信息。
尽管指纹显现技术在刑侦及分析科学中发挥着重大作用，但是目前在指纹显现领域中仍然存在诸多困难。例如，在传统方法中，大多要引用一种外源物质来对潜在指纹进行显现，处理过程较为繁琐复杂，同时对样本具有破坏性。目前广泛使用的烟熏法和刷粉法中采用的小粒度粉末对技术人员存在一定的身体损伤。而新兴的指纹技术如质谱成像法和红外/拉曼成像法，则需要用到昂贵的大型仪器和专业的操作知识，不利于普及。因此目前仍然需要一种简单、快速、适用范围广的方法对潜在指纹进行显现。
化学发光酶联免疫分析是将抗原与抗体的高特异性免疫反应与高灵敏的化学发光检测技术相结合的分析方法。它克服了放射性免疫因使用放射性同位素而引起的放射性危害及污染问题，克服了荧光免疫分析中所需仪器复杂、背景干扰大的缺点，具有灵敏度高、仪器价格低、使用简便、安全、无放射性污染等独特的优势，已成为标记免疫的重要研究方向。伴随着高灵敏度、高分辨率CCD检测装置的出现，化学发光成像检测技术有了显著进步。与常规化学发光分析技术相比，化学发光成像技术可以提供直观图像，能产生光学图像的动态信息，用于生物分祈、医学临床诊断时也显得更为方便。目前并未有利用化学发光酶联免疫分析来对指纹进行检测和成像的报道。
发明内容
本发明提供了一种基于化学发光酶联免疫分析的潜在指纹成像的方法，该方法简单、快速、灵敏且发光强度高，能够对指纹进行清晰的成像。
一种基于化学发光酶联免疫分析的潜在指纹检测与成像的方法，包括：
（1）将指印转移到基底上，得到指印样本；
（2）往所述指印样本的指印上加入手指代谢物的抗体溶液进行孵育，孵育完成后用缓冲液进行冲洗；
（3）将所述的指印样本干燥，然后向指印上加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育；
（4）孵育后，用所述的缓冲液冲洗指印样本，干燥后将指印样本置于化学发光反应底物溶液中，采集指纹图像。
人类指纹皮肤表面布满汗腺，触物留痕。一般来说留在客体表面的指纹物质较少，一般为0.11mg，其中99%为水分，会迅速蒸发掉；固体物质只占1%，其中2/3是有机物质，如：氨基酸、蛋白质、脂肪酸、尿素等；剩余1/3是无机物质。首先选择手指代谢物的抗体（一抗），以及辣根过氧化氢酶（HRP）标记的二抗，通过抗体与代谢物的特异性免疫反应，使HRP间接标记到指纹上，然后通过化学发光反应，即可显示出指纹纹路。
步骤（1）中，所述的指印可以为血指印或汗潜指印。
所述的基底并没有特殊要求，可以为玻璃板、塑料板、不锈钢板、锡箔、纸片、胶带等。
当所述的指印为血指印时，所述的手指代谢物具体可以为IgG。
当所述的指印为汗潜指印时，所述的手指代谢物为表皮生长因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermcidin。
试验发现，以IgG、表皮生长因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermcidin四种代谢物为目标对象进行检测，可成功对指纹成像，且指纹纹理清晰。
其中，IgG的抗体为羊抗人IgG，具体可购自生工生物工程有限公司，货号为DAC1011；表皮生长因子抗体具体可购自生工生物工程有限公司，货号为DA1709；溶菌酶抗体可购自生工生物工程有限公司，货号为DA2322；人汗腺抗菌肽Dermcidin抗体可购自百奇生物科技有限公司，货号AP6718b。
所述抗体溶液的浓度为0.05～0.2mg/mL，优选的，所述抗体溶液的浓度为0.1mg/mL。抗体溶液的浓度过高不仅浪费试剂，还会导致非特异性结合，或显色背景重，而浓度过低，则会导致抗原与抗体的反应不完全，化学发光强度弱，从而影响指纹成像效果。
为使反应充分进行，加入抗体溶液后，所述孵育的时间为25～35min，优选为30min。
所述辣根过氧化物酶标记的二抗的浓度为0.005～0.015mg/mL，优选为0.01mg/mL。二抗浓度过高会增加非特异性结合，且发光强度也不会无限增强，二抗浓度过低则导致化学发光强度弱，指纹成像不清晰。
为使反应充分进行，加入辣根过氧化物酶标记的二抗后，所述孵育的时间为25～35min，优选为30min。
步骤（2）和（4）中，所述的缓冲液为含0.1%吐温-20的PBS缓冲液。
所述的化学发光反应底物溶液为含0.15M NaCl、3.0×10-4M鲁米诺、1.4×10-4M对碘苯酚和1.2×10-3M过氧化氢的Tris-HCl缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液的pH为8.5。在辣根过氧化物酶的催化作用下，化学发光反应底物溶液中的H2O2与鲁米诺在指纹上产生波长425nm的化学发光，从而显现出指纹纹路。采用该种化学发光反应底物溶液可达到较好的发光效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明的方法简单、检测迅速，只需数秒钟即可得到完整的指纹图像，远远快于扫描电化学显微镜技术（十几至几十小时）。
（2）本发明的方法不需要昂贵仪器，便于现场快速实时检测，且发光试剂具有造价低、环境友好的优点。
（3）本发明以酶联免疫分析为检测手段、化学发光成像为信号获取方式，与广泛使用的荧光法相比，本发明的方法不需要外加激发光源，因此不存在背景光干扰，指纹图像更加显著清晰。
（4）本发明方法的灵敏度高，可实现汗潜指印中痕量代谢物（表皮生长因子、溶菌酶、人汗腺抗菌肽Dermcidin等）的特异性检测，能够在进行个体识别的同时还能实现汗潜指印成分分析的目的。
附图说明
图1是化学发光反应池的结构示意图；
其中，1、底座；2、池体；3、凹槽；4、O型密封圈；5、螺栓；6、样本；
图2a为羊抗人IgG浓度为0.01mg/mL时检测的血指印化学发光图；
图2b为羊抗人IgG浓度为0.1mg/mL时检测的血指印化学发光图；
图2c为羊抗人IgG浓度为0.2mg/mL时检测的血指印化学发光图；
图3a为兔抗羊IgG/HRP浓度为0.001mg/mL时检测的血指印化学发光图；
图3b为兔抗羊IgG/HRP浓度为0.01mg/mL时检测的血指印化学发光图；
图3c为兔抗羊IgG/HRP为0.05mg/mL时检测的血指印化学发光图；
图4a为一抗孵育时间为10min时检测的血指印化学发光图；
图4b为一抗孵育时间为30min时检测的血指印化学发光图；
图4c为一抗孵育时间为45min时检测的血指印化学发光图；
图5为采用优化后的试验条件，用羊抗人IgG检测得到的血指印化学发光图；
图6a为直接标记法检测的血指印化学发光图；
图6b为间接标记法检测的血指印化学发光图；
图7为用表皮生长因子抗体检测得到的潜在指纹化学发光图；
图8为用溶菌酶抗体检测得到的潜在指纹化学发光图；
图9为用人汗腺抗菌肽Dermcidin抗体检测得到的潜在指纹化学发光图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。
本发明采用的装置为化学发光反应池。如图1所示，该化学发光反应池包括底座1和池体2，均可采用聚四氟乙烯材料，底座1上具有用于容纳样本6的凹槽3。
池体2通过螺栓5固定在底座1上，池体2中空，池体2的中空部位正对凹槽3，且该中空部位设有O型密封圈4。
使用时，将样本置于凹槽3内，向池体内加入化学发光底物溶液，样本上产生的化学发光会被高灵敏CCD照相机捕获，由此得到指纹图像。
值得注意的是，本发明的实现并不依赖于该装置。
试剂溶液
（1）表皮生长因子抗体：购自生工生物工程有限公司，货号为DA1709；
（2）溶菌酶抗体：购自生工生物工程有限公司，货号为DA2322；
（3）人汗腺抗菌肽Dermcidin抗体：购自百奇生物科技有限公司，货号为AP6718b；
（4）羊抗人IgG：购自生工生物工程有限公司，货号为DAC1011；
（5）兔抗羊IgG/HRP：购自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.，货号为305-065-003；
（6）羊抗兔IgG/HRP：购自北京博奥森生物技术有限公司，货号为bsb-0295G；
（7）PBS-T：0.1%吐温-20的PBS缓冲液，pH为7.4。
（8）化学发光反应底物溶液：含0.15M NaCl、3.0×10-4M鲁米诺、1.4×10-4M对碘苯酚和1.2×10-3M过氧化氢的Tris-HCl缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液的pH为8.5。
实施例1
1、不同羊抗人IgG浓度对指纹采集的影响
（1）手指上蘸少量新鲜血液，在载玻片上按一枚血指印；
（2）免疫标记：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，以避免抗体溶液扩散，将100μL羊抗人IgG（抗体溶解时的溶剂均为含2%BSA，0.1%吐温-20的PBS）滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再将100μL0.01mg/mL兔抗羊IgG/HRP滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗后氩气吹干。
（3）化学发光成像：将上述处理的载玻片（即样本）安装在化学发光反应池中，加入化学发光反应底物溶液，CCD照相机采集指纹图像。
按照上述方法，采用不同的一抗（羊抗人IgG）的浓度（分别为0.01、0.1、0.2mg/mL）进行试验，如图2a-2c所示，一抗浓度太低（0.01mg/mL）时化学发光较弱，指纹某些部位不够清晰，而一抗浓度为0.1mg/mL可以使反应充分，继续提高一抗的浓度（0.2mg/mL）也不会使化学发光更强，所以一抗的浓度选用0.1mg/mL时效果较佳。
2、不同二抗浓度对指纹采集的影响
按照“1、不同羊抗人IgG浓度对指纹采集的影响”的方法，羊抗人IgG的浓度为0.1mg/mL，二抗（兔抗羊IgG/HRP）的浓度分别为0.001、0.01、0.05mg/mL，其余条件不变。
采集的指纹图像如图3a-3c所示，可以看出二抗的浓度（0.001mg/mL）太低时化学发光较弱，指纹图像不清晰，二抗的浓度为0.01mg/mL可以使反应充分，继续提高二抗的浓度（0.05mg/mL）也不会使化学发光更强，所以二抗的浓度为0.01mg/mL时效果较佳。
3、一抗孵育时间对指纹采集的影响
按照“1、不同羊抗人IgG浓度对指纹采集的影响”的方法，羊抗人IgG的浓度为0.1mg/mL，二抗（兔抗羊IgG/HRP）的浓度为0.01mg/mL，加入一抗后，室温培养时间分别为10min、30min、45min，其余条件不变。
采集的指纹图像如图4a-4c所示，可以看出室温培养时间为10min时，反应不够充分，化学发光较弱，指纹图像不够清晰，室温培养时间为30min时反应充分，继续提高反应时间（45min）也不会使化学发光更强，所以反应时间优选为30min。
二抗的孵育时间可采用与一抗相同的孵育时间。
4、最优条件
（1）手指上蘸少量新鲜血液，在载玻片上按一枚血指印；
（2）免疫标记：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，以避免抗体溶液扩散，将100μL 0.1mg/mL羊抗人IgG滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再将100μL 0.05mg/mL兔抗羊IgG/HRP滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗后氩气吹干。
（3）化学发光成像：将上述处理的载玻片安装在化学发光反应池中，加入化学发光反应底物溶液，CCD照相机采集指纹图像。
图5示出了采用优化后的反应条件后采集的化学发光图像，指纹的纹线清晰分明。
对比例
（1）手指上蘸少量新鲜血液，在载玻片上按一枚血指印；
（2）免疫标记：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，以避免抗体溶液扩散，将100μL 0.1mg/mL羊抗人IgG/HRP滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗后氩气吹干。
（3）化学发光成像：将上述处理的载玻片安装在化学发光反应池中，加入化学发光反应底物溶液，CCD照相机采集指纹图像。
如图6a所示，直接用HRP标记的一抗进行处理指纹后成像（直接标记），指纹不清晰，而采用间接标记（即按照“4、最优条件”方法依次用一抗、HRP标记的二抗处理后成像）后，起到了明显的信号放大作用，发光更强（图6b）。
实施例2
（1）在载玻片上按一枚汗潜指印；
（2）免疫标记：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，以避免抗体溶液扩散，将100μL 0.1mg/mL表皮生长因子抗体滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再将100μL 0.01mg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗后氩气吹干。
（3）化学发光成像：将上述处理的载玻片安装在化学发光反应池中，加入化学发光反应底物溶液，CCD照相机采集指纹图像，得到图7所示的化学发光图像。
图7示出了本实施例采集的化学发光图像，指纹的纹线清晰分明。
实施例3
（1）在载玻片上按一枚汗潜指印；
（2）免疫标记：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，以避免抗体溶液扩散，将100μL 0.1mg/mL溶菌酶抗体滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再将100μL 0.01mg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗后氩气吹干。
（3）化学发光成像：将上述处理的载玻片安装在化学发光反应池中，加入化学发光反应底物溶液，CCD照相机采集指纹图像。
图8示出了本实施例采集的化学发光图像，指纹的纹线清晰分明。
实施例4
（1）在载玻片上按一枚汗潜指印；
（2）免疫标记：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，以避免抗体溶液扩散，将100μL 0.05mg/mL人汗腺抗菌肽Dermcidin抗体滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再将100μL 0.01mg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室温培养30min，用PBS-T冲洗后氩气吹干。
（3）化学发光成像：将上述处理的载玻片安装在化学发光反应池中，加入化学发光反应底物溶液，CCD照相机采集指纹图像。
图9示出了本实施例采集的化学发光图像，指纹的纹线清晰分明。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于化学发光酶联免疫分析的潜在指纹成像的方法，其特征在于，包括：
(1)将指印转移到基底上，得到指印样本；
(2)往所述指印样本的指印上加入手指代谢物的抗体溶液进行孵育，孵育完成后用缓冲液进行冲洗；
(3)将所述的指印样本干燥，然后向指印上加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育；
(4)孵育后，用所述的缓冲液冲洗指印样本，干燥后将指印样本置于化学发光反应底物溶液中，采集指纹图像；
所述抗体溶液的浓度为0.05～0.2mg/mL，所述辣根过氧化物酶标记的二抗的浓度为0.005～0.015mg/mL。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基底为玻璃板、塑料板、不锈钢板、锡箔、纸片或胶带。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的指印为血指印或汗潜指印。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的指印为血指印时，所述的手指代谢物为IgG。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的指印为汗潜指印时，所述的手指代谢物为表皮生长因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermcidin。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中，所述孵育的时间为25～35min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为含0.1％吐温-20的PBS缓冲液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的化学发光反应底物溶液为含0.15M NaCl、3.0×10-4M鲁米诺、1.4×10-4M对碘苯酚和1.2×10-3M过氧化氢的Tris-HCl缓冲溶液。
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