CN105779472B - Gaussia荧光素酶基因突变体及其融合蛋白 - Google Patents

Gaussia荧光素酶基因突变体及其融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Gaussia荧光素酶基因突变体，其核酸序列如SEQ ID No:1或3所示。还提供了一种Gaussia荧光素酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No:2或4所示。还提供了一种Gaussia荧光素酶突变体的融合蛋白，如SEQ ID No:21或23所示，编码该融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No:22或24所示。还提供了一种表达载体，所述表达载体含有SEQ ID No:1或3或22或24所示的核酸序列。本发明解决了Gluc内部翻译起始的问题，从而能更忠实地反映融合蛋白的特性。

Description

Gaussia荧光素酶基因突变体及其融合蛋白
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基因突变体和融合蛋白，具体涉及一种Gaussia荧光素酶基因突变体及其融合蛋白。
背景技术
融合蛋白是指利用基因工程技术，将两种或两种以上在自然状态下互相分离的蛋白质融合到一起，被融合的各个部分都处在同一条氨基酸链上，作为一个整体进行表达。融合蛋白在生命科学相关研究领域及生物产业均有广泛用途。将两种蛋白质融合表达，通常的方法是将编码这两种蛋白的DNA序列按顺序连接在一起，形成一个融合的DNA分子，将该DNA分子转入细胞后，在真核启动子的驱动下，即可转录出相应的mRNA，继而以这些mRNA为模板，利用细胞的翻译机器产生融合蛋白。
Gaussia荧光素酶(Gluc)是一种从海洋桡脚类动物Gaussiaprinceps体内分离到的具有荧光素酶活性的蛋白质，由185个氨基酸组成，分子量约19.9KD。Gluc能以coelenterazine(CTZ)为底物，催化发光反应。相较其他常用的荧光素酶，如虫荧光素酶，海肾荧光素酶，Gluc的催化反应能产生更强的光信号，因此，Gluc常被作为报告基因，广泛用于各种生命科学研究。除了用作报告基因用于转录活性及转录调控研究以外，Gluc也可与其他蛋白分子一起构建融合蛋白，使待研究的蛋白分子带上发光标记，以便进行定位、示踪研究等。我们在一项前期研究中发现，构建Gluc融合蛋白时存在一个问题，即当Gluc位于融合蛋白的C端时，有部分表达产物不是预期的融合蛋白，而是一些截短的Gluc蛋白，造成这种现象的原因，是Gluc内部有一些非典型的翻译起始位点，从这些位点所起始翻译的产物同样具有Gluc荧光素酶活性。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种能够消除Gluc内部翻译起始的Gaussia荧光素酶基因突变体及其融合蛋白。
本发明一方面提供了一种Gaussia荧光素酶基因突变体，其核酸序列如SEQ IDNo:1或3所示。
本发明的另一方面提供了一种Gaussia荧光素酶突变体，该突变体的氨基酸序列由SEQ ID No:1编码，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；或者，该突变体的氨基酸序列由SEQ ID No:3编码，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
本发明的另一方面提供了一种Gaussia荧光素酶突变体的融合蛋白，该融合蛋白为将前述的SEQ ID No:2所示的荧光素酶突变体与乙肝病毒E抗原N端93个氨基酸连接得到，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示。本发明还提供了编码该融合蛋白的核酸序列，其序列如SEQ ID No:22所示。
本发明的另一方面提供了一种Gaussia荧光素酶突变体的融合蛋白，该融合蛋白为将前述的SEQ ID No:4所示的荧光素酶突变体与乙肝病毒E抗原N端93个氨基酸连接得到，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示。本发明还提供了编码该融合蛋白的核酸序列，其序列如SEQ ID No:24所示。
本发明的另一方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有SEQ ID No:1或3或22或24所示的核酸序列。
本发明的有益效果是：对Gluc进行了截短突变和点突变研究，鉴定了Gluc中的非典型翻译起始位点，以这些研究为基础，对Gluc进行改造，得到了两种新的Gluc突变体，一种是全长Gluc，但其N端的4个非典型翻译起始位点被突变(G4S-GICN)；另一种是去除GlucN端28个氨基酸，同时含有2个非典型翻译起始位点的突变(命名为Gluc84 M1+M2)。这两种经过改造的Gluc突变体，均很大程度上消除了Gluc内部的翻译起始，可用于构建与其他各种蛋白分子的融合蛋白表达载体，这些表达载体能避免从Gluc基因内部起始翻译的情况，从而能更忠实地反映融合蛋白的特性。
利用这两种突变体，构建了其与乙肝病毒E抗原(HBeAg)N端93个氨基酸连接的融合蛋白表达载体Pcore-G4S-GICN和Pcore-C-Gluc84M2，这两种载体均主要从预期的位点起始融合蛋白翻译，而避免了从序列内部起始翻译，可以用于构建乙肝病毒复制细胞模型，用于指示乙肝病毒的转录复制水平，在乙肝病毒相关科学研究以及抗病毒药物筛选方面有良好的应用价值。
附图说明
图1是质粒C-Gluc和C-E-Gluc结构示意图。
图2是质粒Δ1817-1900、Δ1817-2093和Δ1817-G4S结构示意图。
图3是Gluc氨基酸突变位置示意图。
图4是各种Gluc表达载体的荧光素酶活性结果图。
具体实施方式
本发明实施例中所用试剂来源如下：
PCMV-Gluc质粒：NEB公司，美国
质粒pCH9/3091：德国弗莱堡大学Michael Nassal赠送
2×PrimeSTAR HS Mix：Takara公司，日本
胶回收试剂盒：QIAGEN公司，德国
pLR-TK、大肠杆菌JM109感受态细胞：Promega公司，美国
BsmB I、Tango buffer、DTT：Thermo scientific公司，美国
T7 ligase：Enzymatics公司，美国
ATP：New England Biolabs公司，美国
实施例一、Gaussia荧光素酶(Gluc)基因内部存在非典型翻译起始位点的发现和鉴定
一、Gaussia荧光素酶(Gluc)基因内部存在非典型翻译起始位点的发现
按照一般的认识，一个克隆到表达载体上的基因，应该从其第一个起始密码子ATG起始翻译，然而，申请人在研究中发现，Gluc基因内部存在非典型翻译起始位点。具体发现过程如下：申请人构建了一种Gluc与乙肝病毒E抗原(HBeAg)N端融合蛋白表达载体，HBeAg的N末端93个氨基酸通过一段长度为51个氨基酸的G4S接头连接于Gluc的N端(Gluc的第一个氨基酸密码子ATG被去除)，该融合蛋白的表达由乙肝病毒核心启动子驱动(载体命名为C-Gluc，结构如图1中A所示)。作为阴性对照，我们将整段融合蛋白表达框置于CMV启动子下游，并且将HBeAg的起始密码子ATG突变为TTG(命名为C-E-Gluc，结构如图1中B所示)。由于在Gluc上游不存在任何同框ATG，我们预期C-E-Gluc将不能表达Gluc融合蛋白，然而，当转染HepG2细胞24h后，荧光素酶活性检测表明，C-E-Gluc与C-Gluc的荧光素酶活性相近(图4)，提示C-E-Gluc仍能表达具有活性的Gluc或Gluc融合蛋白。
C-E-Gluc仍能有效表达具有荧光素酶活性的产物，显然，该产物是从载体所翻译的。翻译的起始位点，可能位于Gluc之内，G4S接头序列内，或者是G4S序列上游HBeAg N端序列内部。为了将范围缩小，我们构建了3种截短突变体，即Δ1817-1900，Δ1817-2093和Δ1817-G4S(结构如图2所示)(D基因型HBV基因组长度为3182bp，习惯的定位方法是以其中的EcoR1酶切位点处为第1位，1817是对应HBV基因组上的序列，不是在C-E-Gluc上的位置。在HBV基因组上，HBeAg的起始密码子是1814-1816，1817是第二个密码子开始的位置)。Δ1817-1900去除了C-E-Gluc中第1817到1900位的序列，Δ1817-2093去除了C-E-Gluc中HBeAg的所有序列，Δ1817-G4S去除了HBeAg和G4S的全部序列。这三种载体转染后，测试Gluc活性，结果显示，它们都具有Gluc活性(图4)，其中Δ1817-1900，Δ1817-2093与C-E-Gluc类似，Δ1817-G4S虽稍有降低，但仍相当可观。由于Δ1817-G4S已经去除了Gluc上游的外源序列，因此可以推断，有相当一部分Gluc活性源于Gluc内部的某些位点起始的翻译产物。
为了弄清Gluc内部的有效翻译起始位置，我们进一步以Δ1817-G4S为基础，构建了4种截短突变体，分别为Δ1817-Gluc33、Δ1817-Gluc84、Δ1817-Gluc129、Δ1817-Gluc175，Δ1817-Gluc33表示第1817到Gluc第33个核苷酸(不计算起始密码子ATG)的序列缺失，Δ1817-Gluc84表示第1817到Gluc第84个核苷酸(不计算起始密码子ATG)的序列被缺失，Δ1817-Gluc129表示第1817到Gluc第129个核苷酸(不计算起始密码子ATG)的序列被缺失，Δ1817-Gluc175表示第1817到Gluc第175个核苷酸(不计算起始密码子ATG)的序列被缺失。这些载体转染细胞后，Gluc活性检测显示，Δ1817-Gluc34与Δ1817-G4S活性相似，Δ1817-Gluc84的Gluc活性下降约50％，而Δ1817-Gluc129均大幅度下降(数百倍)，接近背景水平(图4)。这些结果提示，Gluc nt85-129之间的的某处，存在活性较高的翻译起始位点。
二、Gaussia荧光素酶(Gluc)基因内部非典型翻译起始位点的鉴定
上述结果提示，Gluc nt85-129之间存在翻译起始位点。分析发现该段并无典型的起始密码子ATG，但是存在两个符合Kozak翻译起始规律的其他可能起始序列，分别是1号序列：nt88-94 GCCGTGG，2号序列nt109-115：ACCACGG。为了验证这两个位点的作用，我们在Δ1817-Gluc84基础上，构建了3种点突变体，分别将可能的起始密码子GTG和ACG突变为AAG。即Gluc84M1：GCCAAGG；Gluc84 M2：ACCAAGG；Gluc84 M1+M2(突变位置见图3所示)。荧光素酶活性检测显示，Gluc84M1与Δ1817-Gluc84活性接近，而Gluc84 M2活性下降约15倍，Gluc84M1+M2活性下降约25倍。这些结果提示，2号序列中的ACG至少是Gluc内部有效起始翻译的主要位点之一，其翻译产物保留了相当的荧光素酶活性。
通过前述实验，证明Gluc内部的至少部分非ATG翻译起始序列符合Kozak规律，为了在全长的Gluc中验证这一点，我们将全长Gluc基因中nt130以前的4个Kozak序列全部突变(突变位置见图3中阴影所示)，然后观测其表达情况。结果发现，这些位点突变后，的确使Gluc表达大幅度降低，证实Gluc内部的非典型翻译起始位点均符合Kozak规律。
申请人对质粒C-E-Gluc进行了分析，研究了该全长Gluc及HBeAg N端序列中的Kozak序列是否是造成该质粒能表达Gluc活性蛋白的原因。在C-E-Gluc表达框中，总共有7个符合Kozak规律的序列，其中3个位于HBeAg的N端序列内，4个位于Gluc内(如图3中所示)。如果还存在除了Kozak序列外的其他翻译起始点，那么在突变掉这7种序列后，应该仍能检测到相当水平的Gluc活性。为了对此进行验证，构建了同时含有这7处突变的质粒C-E-GlucM7，使这些位点均不符合Kozak翻译起始序列规律，同时尽量保持氨基酸序列不变(HBeAg内有两个氨基酸变化)。转染后Gluc活性检测显示，与未突变的C-E-Gluc相比，C-E-GlucM7的Gluc活性降低约30倍，即剩余活性约3.3％，荧光素酶活性测定结果如图4中所示，该结果提示C-E-Gluc表现出的Gluc活性，绝大部分可以归因于以上7处符合Kozak规律的翻译起始序列。我们将Gluc84M1+M2和C-E-GlucM7中的Gluc突变体序列，分别与突变的HBeAg的N端序列融合，并由HBV核心启动子驱动，构建了质粒Pcore-C-Gluc84M2和Pcore-G4S-GICN，与对照质粒ENM-Gluc84M2和C-E-GlucM7(这两个对照质粒与前述两个质粒相比，不同之处是由CMV启动子驱动，且HBeAg的起始密码子被突变)相比，前两个质粒可表达具有荧光素酶活性的产物，而后者活性很低，荧光素酶活性测定结果如图4中所示，证明Pcore-ENM-Gluc84M2和Pcore-ENM-GlucM7的表达产物主要为预期的融合蛋白，而很少存在基因内部的翻译起始情况。
实施例二、Gluc84 M1+M2和G4S-GICN表达质粒的构建
一、质粒Gluc84 M1+M2构建
1、GG1载体构建
为了后续克隆操作，我们首先构建了载体GG1。以92G4S-HBc质粒(其获得方法及序列参照专利申请CN 201510076239.1)为模板，扩增片段1，反应体系：20ng 92G4S-HBc模板，引物Ramp(10μM)及Fsv40GG2(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段。以92G4S-HBc为模板，扩增片段2，反应体系：20ng 92G4S-HBc模板，引物Famp(10μM)及RBsmb12nd(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min，95℃15s，58℃15s，72℃1min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段。
用以上两个片段1、2做Golden gate反应进行连接，反应体系：
BsmB I 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 ligase 0.25μl
ATP 1μl
片段1 1.5μl(80ng)
片段2 1μl(100ng)
ddH<sub>2</sub>O 补齐至10μl
总体积 10μl
反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次；80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为GG1。
2、质粒G4S-Gluc构建
首先从PCMV-Gluc质粒扩增Gluc基因片段(不含有N端17个氨基酸)，反应体系：20ng PCMV-Gluc模板，引物FGlucGG(10μM)及RGlucGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，命名为Gluc。
以前述制备得到的载体GG1为模板，扩增一个片段，反应体系：20ng GG1模板，引物Fsv40GG2(10μM)及R2nd(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃3min，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，命名为G4S。
以上述得到的两个片段Gluc、G4S做Golden gate反应进行连接，反应体系：
反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为G4S-Gluc。
3、质粒Δ1817-G4S构建
以质粒G4S-Gluc为基础，构建缺失G4S上游HBV序列的载体，构建策略采用单一片段Golden gate反应。首先以G4S-Gluc为模板，扩增一个片段，反应体系：10ng模板G4S-Gluc，引物Fg4sGG(10μM)及R1817GG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃3min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，命名为Δ1817，该片段做自身的Golden gate连接反应，反应体系：
BsmB I酶 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 ligase 0.25μl
ATP 1μl
Δ1817 2μl(80ng)
ddH<sub>2</sub>O 补齐至10μl
总体积 10μl
反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为Δ1817-G4S。
4、质粒Δ1817-Gluc84构建
以质粒Δ1817-G4S为基础，构建缺失整个HBV序列+G4S序列+Gluc基因前84个碱基对的载体，构建策略采用单一片段Golden gate反应。反应体系：10ng模板Δ1817-G4S，引物FGluc84GG(10μM)及R1817GG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃3min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，命名为Gluc84，该片段做自身的Golden gate连接反应，反应体系：
BsmB I酶 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 ligase 0.25μl
ATP 1μl
Gluc84 2μl(90ng)
ddH<sub>2</sub>O 补齐至10μl
总体积 10μl
反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次；80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为Δ1817-Gluc84。
5、质粒Gluc84 M1+M2构建
以质粒Δ1817-Gluc84为基础，构建含有nt91(G变A)、nt92(T变A)、nt113(C变A)点突变的质粒。构建分两步进行，首先构建含前两个点突变的质粒，构建策略仍采用单一片段Golden gate反应。反应体系：10ng模板Δ1817-Gluc84，引物FGluc84M1GG(10μM)及RGluc84M1GG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃3min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，命名为M1，该片段做自身的Golden gate连接反应，反应体系：
BsmB I酶 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 ligase 0.25μl
ATP 1μl
M1 2μl(86ng)
ddH<sub>2</sub>O 补齐至10μl
总体积 10μl
反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次；80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为Gluc84M1。以Gluc84M1为基础，构建质粒Gluc84 M1+M2。首先扩增片段，反应体系：10ng模板Gluc84M1，引物FGluc84M2GG(10μM)及RGluc84M2GG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HSMix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃3min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，命名为M1+M2，该片段做自身的Goldengate连接反应，反应体系：
BsmB I酶 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 ligase 0.25μl
ATP 1μl
M1+M2 2μl(95ng)
ddH<sub>2</sub>O 补齐至10μl
总体积 10μl
反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为Gluc84M1+M2，其荧光素酶活性测定结果如图4中所示，该载体中含有去除了Gluc N端28个氨基酸、同时含有2个非典型翻译起始位点的突变序列，该Gluc突变体的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
二、质粒G4S-GICN构建
以前述制备得到的质粒G4S-Gluc为基础，构建nt130上游4个Kozak序列突变的载体G4S-GICN，构建策略采用一个片段Golden gate反应。以G4S-Gluc为模板，反应体系：10ng模板G4S-Gluc，引物FGICN65GG(10μM)及
RGICN12GG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃3min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，命名为GICN，该片段做自身的Golden gate连接反应，反应体系：
BsmB I酶 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 ligase 0.25μl
ATP 1μl
GICN 2μl(80ng)
ddH<sub>2</sub>O 补齐至10μl
总体积 10μl
反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次；80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为G4S-GICN，其荧光素酶活性测定结果如图4中所示，该载体中含有全长Gluc，但GlucN端的4个非典型翻译起始位点被突变，该Gluc突变体(GICN)的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
实施例二中用到的引物序列如下(依次如序列表中SEQ ID No:5～20所示)：
实施例三、融合蛋白表达质粒Pcore-C-Gluc84M2和Pcore-G4S-GICN的构建
以实施例二中制备得到的两种Gluc突变体Gluc84M1+M2和G4S-GICN为基础，构建它们分别与乙肝病毒E抗原N端93个氨基酸的融合蛋白表达载体，这两个载体在可以表达目标融合蛋白的同时避免从基因内部起始翻译的非预期产物。
一、构建融合蛋白表达质粒Pcore-C-Gluc84M2
1、以质粒HBc(其获得方法及序列参照专利申请CN 201510076239.1)为模板，用引物F1814M+R2448扩增得到一个片段，再用该片段替换HBc相应区域，得到质粒EM3，该质粒中HBeAg起始密码子被突变。
2、以质粒PCH9/3091(德国弗莱堡大学Micheal Nassal赠送)为模板，用引物F1903GG2+Ramp扩增得到一个片段；以质粒EM3为模板，用引物Famp+R1903GG2扩增得到另一个片段；这两个片段通过Golden gate克隆得到质粒C-E-PCH9。
3、以C-E-PCH9为模板，用引物Famp+R2093GG扩增得到一个片段；以G4S-Gluc为模板，用引物Fg4sGG+Ramp扩增得到另一个片段，这两个片段通过Golden gate克隆得到质粒C-E-Gluc。
4、以C-E-GLuc为模板，通过一个片段Golden gate克隆方法得到gg④10.1(结构为Pcmv 1814-2093-G4S-Gluc,1814ATG>CAG,1901ATG>TTG)，所用引物为：F1814GG和R1814GG。
5、以gg④10.1为模板，通过一个片段Golden gate克隆方法得到HICN-G4S-Gluc(结构为Pcmv-HICN-G4S-Gluc)，所用引物为FHICN2012GG和RHICN1880GG。
6、以Gluc84M1+M2为模板，用引物FGLUC91-109+Ramp扩增得到一个片段；以HICN-G4S-GLuc为模板，用引物Famp+Rg4s11.13扩增得到另一个片段，将以上两个片段通过Golden gate连接得到质粒HICN-G4S-Gluc85M1+M2。
7、以PCH9/3091为模板，用引物F1070GG+R1901GG扩增得到一个片段；以pLR-TK为模板，用引物FrlucGG2+RrlucGG2扩增得到第二个片段；以HBc为模板，用引物Fsv40GG2+RCMVGG扩增得到第三个片段，这三个片段通过Golden gate克隆得到质粒ACB。
8、以质粒ACB为模板，用引物Rmrluc+FampnoGG扩增得到一个片段，再用该片段替换ACB，得到质粒ACBM，该质粒中HBcAg起始密码子被突变。
9、以C-E-Gluc为模板，用引物F1093GG2+Ramp扩增得到一个片段；以ACBM为模板，用引物Famp+R1903GG2扩增得到另一个片段，这两个片段通过Golden gate克隆得到质粒C-Gluc；
10、以C-Gluc为模板，用引物Famp+RHICN1880gg扩增得到一个片段；以HICN-G4S-Gluc85M1+M2为模板，用引物FHICN2012GG+Ramp扩增得到另一个片段；以上两个片段通过Golden gate连接得到质粒Pcore-C-Gluc84M2(其结构为pCORE-HICN-G4S-Gluc 84M1+M2)，融合蛋白Pcore-C-Gluc84M2的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示，编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:22所示。
二、构建融合蛋白表达质粒Pcore-G4S-GICN
1、以G4S-Gluc为模板，用引物FGICN65GG+RGICN12GG扩增得到一个片段，用该片段做自身的Golden gate克隆，得到质粒G4S-GICN。
2、以G4S-GICN为模板，用引物Fg4sGG+Ramp扩增得到一个片段；以HICN-G4S-Gluc84M1+M2为模板，用引物Famp+R2093GG扩增得到另一个片段，这两个片段通过Goldengate反应，得到质粒HICN-G4S-GICN。
3、以G4S-GICN为模板，用引物Fg4sGG+Ramp扩增得到一个片段；以Pcore-Gluc84M1+M2为模板，用引物Famp+R2093GG扩增得到另一个片段，这两个片段通过Golden gate反应，得到质粒HICN-G4S-GICN。
4、以G4S-GICN为模板，用引物Fg4sGG+Ramp扩增得到一个片段；以HICN-G4S-GICN为模板，用引物Famp+R2093GG扩增得到另一个片段，这两个片段通过Golden gate反应，得到质粒Pcore-G4S-GICN，融合蛋白Pcore-G4S-GICN的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示，编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:24所示。
实施例三中所用引物序列如下(依次如序列表中SEQ ID No:25～42所示，其余未列出的引物序列见实施例二中所列引物序列)：

Claims (5)

1.一种Gaussia荧光素酶基因突变体，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.一种Gaussia荧光素酶突变体，其特征在于，该突变体的氨基酸序列由SEQ ID No:1编码，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.一种Gaussia荧光素酶突变体的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白为将权利要求2所述的荧光素酶突变体与乙肝病毒E抗原N端93个氨基酸连接得到，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示。
4.一种分离的核酸序列，其特征在于：所述核酸序列为编码权利要求3所述融合蛋白的核酸序列，其序列如SEQ ID No:22所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1或者4所述的核酸序列。
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