CN105779407A - 一种THp-GSK-3β-KD表达载体以其应用 - Google Patents

一种THp-GSK-3β-KD表达载体以其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种THp‑GSK‑3β‑KD表达载体以其应用。GSK‑3β‑KD蛋白序列是将GSK‑3β蛋白的第85位的赖氨酸突变为精氨酸得到的。所获得的GSK‑3β‑KD不能与ATP结合而丧失磷酸化底物的活性，但其仍能与底物结合，因而能竞争性抑制野生型GSK‑3β活性，同时也可避免小分子化合物因为针对激酶结构设计而产生的非特异性。在GSK‑3β‑KD序列上游加上酪氨酸羟化酶的THp启动子，使THp‑GSK‑3β‑KD的表达范围大大减少，主要集中在PD病灶区的黑质多巴胺神经元。利用本发明的THp‑GSK‑3β‑KD表达载体可用于帕金森病的新药开发及疾病治疗。

Description

一种THp-GSK-3β-KD表达载体以其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种THp-GSK-3β-KD表达载体以其应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病，全球有超过600万PD病人，仅中国已逾170万。PD的病理特征为黑质多巴胺能神经元选择性、进行性死亡/凋亡，伴胞浆内路易小体(Lewy bodies)形成，从而导致黑质纹状体通路中多巴胺(DA)减少。患者表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等，临床主要以左旋多巴(L-DOPA)补充治疗。但是L-DOPA仅能改善PD病人的症状，且使用三至五年后疗效减退，并不能有效阻止多巴胺能神经元进行性死亡。目前，仍然缺乏针对“黑质多巴胺能神经元死亡”的保护性干预药物和手段。因此，研发一种保护性干预黑质多巴胺神经元进行性凋亡的创新药物就显得十分必要。
GSK-3β (glycogen synthase kinase-3β) 是介导神经元死亡的关键激酶。临床研究发现：在PD病人中，编码GSK-3β的基因有两个单核苷酸多态性(SNPs)位点，一个使GSK-3β转录活性增高，另一个使GSK-3β转录本增加，后者的产物与GSK-3β全长相比缺少C末端一段氨基酸且激酶活性增高；另有报道，在PD病人黑质、纹状体组织样本及外周血淋巴细胞，GSK-3β呈高表达且活性增高。这些资料表明GSK-3β与PD的发生有密切关系。已有多家实验室用同样的动物模型肯定这一结果，均证实了抑制GSK-3β对黑质多巴胺能神经元的保护作用。在多巴胺能神经元敏感毒物如MPP+，6-OHDA，rotenone(鱼藤酮)和paraquat(百草枯)诱导的PD细胞模型中，GSK-3β激活并介导了神经元死亡。上述证据充分表明：GSK-3β对神经元死亡和PD发病非常关键，是一个潜在的治疗PD的药物靶标。
GSK-3β是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸类激酶，在所有真核生物中都有分布，GSK-3β于1980年被鉴定出来，在此之后的近10年里，人们曾一度认为GSK-3β正如其名字一样简单，仅仅是一个调节糖原代谢的蛋白激酶。但越来越多的研究证实，GSK-3β除了磷酸化肝糖原合成酶以调控该酶催化糖酵解的活性外，还参与Wnt /β-catenin、Hedgehog以及Notch等信号传导通路，在调控细胞的增殖、分化、 代谢、 凋亡以及基因表达等方面都起着重要作用。越来越多的证据表明，这些信号传导途径的失调与Ⅱ型糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默病、心肌肥厚、癌症等疾病密切相关。目前已合成出一系列的抑制GSK-3β活性的小化合物，但目前仍未有特异的GSK-3β小分子化合物通过临床试验最终应用于临床的，究其原因，除化合物特异性不够导致脱靶带来副作用外，GSK-3β的广泛分布及参与多方面的细胞活动的特点是限制其成药性的重要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种THp-GSK-3β-KD表达载体以其应用。
本发明所采取的技术方案是：
GSK-3β-KD蛋白序列，其中，GSK-3β-KD蛋白序列是将GSK-3β蛋白的第85位的赖氨酸突变为精氨酸得到的。
优选的，编码GSK-3β-KD蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。
具体的，将GSK-3β(NM_002093.3)从人CDNA克隆出来，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。根据GSK-3β的结构特点，采用Overlap PCR的方法将Lys85突变为Arg85（AAG→AGA），获得GSK-3β-KD，其核酸序列如SEQ ID NO：2所示。即将GSK-3β蛋白质与ATP结合的关键位点Lys85突变为Arg85，使GSK-3β不能与ATP结合而丧失磷酸化底物的活性（GSK-3β-KD）。
优选的，克隆GSK-3β基因所用的引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物F1：ATCCGCTAGCATGTCAGGGCGGCCCAGA（SEQ ID NO：4）；
下游引物R1：AATTGCGGCCGCTCAGGTGGAGTTGGAAGC（SEQ ID NO：5）。
优选的，克隆GSK-3β基因PCR反应体系为：
Buffer 2.5μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
Tag酶 0.5μL
dNTP 0.5μL
模板 0.2μL
ddH2O 20.3μL
总体积 25μL。
优选的，PCR 反应的条件为：在 94℃预变性 5 分钟；94℃变性 30 秒；迅速冷却至 58℃退火30秒；72℃延伸2分钟，30个循环 ；72℃延伸 10 分钟；4℃冷却保存。
优选的，采用Overlap PCR将85位的Lys突变为Arg。
优选的，采用Overlap PCR将85位的Lys对应的碱基AAG突变为Arg对应的碱基AGA。
优选的，Overlap PCR所采用的引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物F1：ATCCGCTAGCATGTCAGGGCGGCCCAGA（SEQ ID NO：4）；
下游引物R1：AATTGCGGCCGCTCAGGTGGAGTTGGAAGC（SEQ ID NO：5）；
上游引物F2：CTGGTCGCCATCAGAAAAGTATTGCAGGAC（SEQ ID NO：6）；
上游引物R2：GTCCTGCAATACTTTTCTGATGGCGACCAG（SEQ ID NO：7）。
优选的，Overlap PCR反应体系为：
Buffer 2.5μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
Tag酶 0.5μL
dNTP 0.5μL
模板 0.2μL
ddH2O 20.3μL
总体积 25μL。
优选的，Overlap PCR 反应的条件为：在 94℃预变性 5 分钟；94℃变性 30 秒；迅速冷却至 58℃退火30秒；72℃延伸2分钟，30个循环 ；72℃延伸 10 分钟。
具体的，分别以引物F1、R2，以及F2、R1按上述条件进行PCR反应，获得2段DNA序列，其中包含Lys85突变为Arg85的序列，再将两段PCR产物等量混合，变性退火后延伸，获得突变型全长序列GSK-3β-KD。
THp-GSK-3β-KD核酸序列，是在编码GSK-3β-KD蛋白的核酸序列上添加酪氨酸羟化酶的THp启动子序列得到，启动子THp序列如SEQ ID NO：3所示。
在GSK-3β-KD序列上游加上酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的启动子（THp），而获得THp-GSK-3β-KD。由于TH只在儿茶酚胺能神经元表达，其中主要是中脑黑质多巴胺神经元，因而TH启动子将使GSK-3β-KD的表达范围大大减少，主要集中在PD病灶区的黑质多巴胺神经元。
优选的，扩增酪氨酸羟化酶的启动子THp所用的引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物F3：ATTCGTTAACCAGATGGCACTCCTAGGAACCAC（SEQ ID NO：8），
下游引物R3：ATTCTCTAGATCAGTGTGGAGGTCCGGGCTCCG（SEQ ID NO：9）。
一种THp-GSK-3β-KD表达载体，是将THp-GSK-3β-KD核酸序列转入表达载体中得到的。
优选的，THp-GSK-3β-KD表达载体用于帕金森病的新药开发及疾病治疗中。
优选的，THp-GSK-3β-KD表达载体通过脂质体、阳离子多聚物或纳米基因载体的介导用于帕金森病的新药开发及疾病治疗中。
优选的，表达载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
THp-GSK-3β-KD表达载体在帕金森病的新药开发中的应用，其中THp-GSK-3β-KD表达载体如上任一项所述。
THp-GSK-3β-KD表达载体在治疗帕金森病的应用，其中THp-GSK-3β-KD表达载体如上任一项所述。
本发明的有益效果是：
本发明的GSK-3β-KD蛋白序列是特异性将GSK-3β蛋白质与ATP结合的关键位点Lys85突变为Arg85，使GSK-3-KD不能与ATP结合而丧失磷酸化底物的活性。所获得的GSK-3β-KD仍能与底物结合，因而能竞争性抑制野生型GSK-3β活性，同时也可避免小分子化合物因为针对激酶结构设计而产生的非特异性。因此，GSK-3β-KD就是GSK-3β特异性抑制剂，可用于抑制过度激活的GSK-3β而治疗PD。也就是说，本发明的GSK-3β-KD蛋白可以适度抑制活性GSK-3β，达到抑制病灶高活性的GSK-3β作用，但不抑制其正常活性，可以避免副作用的产生。
在GSK-3β-KD序列上游加上酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的启动子（THp），而获得THp-GSK-3β-KD。由于TH只在儿茶酚胺能神经元表达，其中主要是中脑黑质多巴胺神经元，因而THp启动子使THp-GSK-3β-KD的表达范围大大减少，主要集中在PD病灶区的黑质多巴胺神经元，具有特异性和靶向性。此外THp-GSK-3β-KD不会抑制GSK-3β的正常活性，可以避免副作用的产生。
本发明通过慢病毒双启动子载体体外证实LV-THp-GSK-3β-KD特异表达于儿茶酚胺能神经元细胞系SK-N-BE-2-M17，而不表达于非儿茶酚胺能细胞系HepG2。
因此，本发明中，中脑黑质儿茶酚胺能神经元特异表达的THp-GSK-3β-KD序列可以应用于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体，及脂质体、阳离子多聚物和纳米基因载体等基非病毒基因治疗载体中，用于帕金森病的新药开发及疾病治疗。
附图说明
图1是本发明的THp-GSK-3β-KD序列结构示意图；
图2 是LV-THp-GSK-3β-KD特异表达于儿茶酚胺能神经元细胞系。
具体实施方式
本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例一：GSK-3β（NM_002093.3）基因全长cDNA序列的获得
1.RNA提取
1)组织处理：取10mg左右组织加入1ml Trizol，用匀浆机匀浆；离心15分钟，12000g，取上清；
2)向上清中加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟；
3)4℃，12000g离心15分钟，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA，中层为DNA，脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等；
4)取上清到新的EP管内；加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟；
5)小心去掉上清，加入1ml 75%乙醇，上下颠倒，使沉淀块重悬起；
6)4℃，12000g离心10分钟，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，若沉淀松动可再次离心。晾干约15分钟，至管壁无液体；
7)加入适量体积（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟；
8)取出2 ul定量，测量buffer为10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录，（1A260=40µg/ml, A260/A280=1.8～2.1）；
9)逆转录获得cDNA文库。
2.基因调取：
上游引物F1：ATCCGCTAGCATGTCAGGGCGGCCCAGA
下游引物R1：AATTGCGGCCGCTCAGGTGGAGTTGGAAGC
PCR反应体系 (25μL) ：Buffer2.5μL、上下游引物各 0.5μL、Tag 酶 0.5μL、dNTP 0.5μL、模板 0.2μL、ddH2O 20.3μL。
PCR反应的条件：在94℃预变性5分钟 ； 94℃变性30秒 ；迅速冷却至58℃退火30秒 ；72℃延伸2分钟，30个循环 ；72℃延伸10分钟 ；4℃冷却保存。扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在大约 1300bp 的位置上有特异性的目的条带。
3.PCR产物回收
1) PCR产物经电泳后，在紫外条件下，切取含目的片段的凝胶条带至干净1.5ml EP管中，按100mg凝胶对应100ul溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD；
2) 55℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次；
3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000g离心1min，弃滤液；
4)向柱上加入500ul溶液PE，室温12000g离心1min，弃滤液；
5)重复上一操作一次；
6)空柱12000g离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体；
7)将柱子置于新的1.5ml EP管上，向柱中央加入30µl 洗脱液，12000g离心1min以洗脱出DNA。
实施例二：将Lys85突变为Arg85（AAG→AGA）获得GSK-3β-KD
上游引物F2：CTGGTCGCCATCAGAAAAGTATTGCAGGAC
下游引物R2：GTCCTGCAATACTTTTCTGATGGCGACCAG
以GSK-3β序列为模板，分别以引物F1、R2，以及F2、R1按实施例一的条件进行PCR反应，获得2段DNA序列（含Lys85突变为Arg85的序列），再将两段PCR产物等量混合，变性退火后延伸，获得突变型全长序列GSK-3β-KD。
实施例三：LV-GSK-3β-KD慢病毒表达载体构建
1. GSK-3β-KD PCR产物回收
1) PCR产物经电泳后，在紫外条件下，切取含目的片段的凝胶条带至干净1.5ml EP管中，按100mg凝胶对应100ul溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD；
2) 55℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次；
3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000g离心1min，弃滤液；
4)向柱上加入500ul溶液PE，室温12000g离心1min，弃滤液；
5)重复上一操作一次；
6)空柱12000g离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体；
7)将柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30µl 洗脱液，12000g离心1min以洗脱出DNA。
2. PCR回收产物取10 ul用NheI和NotI双切，酶切产物DNA凝胶回收试剂盒回收。
3.慢病毒载体为LV003-CMV-Flag-MCS-EF1-GFP。该载体是一个含双启动子的慢病毒表达载体，其中CMV和EF1是广泛表达的启动子，Flag是标签蛋白，MCS是多克隆位点，GFP为绿色荧光蛋白。取1 ug用NheI和NotI双切，酶切产物DNA凝胶回收试剂盒回收。
4. 目的片段与载体按3:1的比例用T4连接酶进行连接。
5. 连接产物的转化
1)冰浴中将连接产物分别加入至50μl Tran5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min；
2)42℃水浴热休克90s；
3)快速将管转移至冰浴中，冰浴2min；
4)分别加入500μl LB培养基，混匀，37℃、150g振荡培养40min；
5)将150ul菌液涂布于含氨苄青霉素（Amp）（100μg/ml）的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养；
6.从平板中挑取5个菌落进行菌落PCR鉴定阳性克隆，将鉴定正确的克隆送sanger测序鉴定。
实施例四：LV-THp-GSK-3β-KD慢病毒表达载体构建
提取人基因组DNA，PCR扩增酪氨酸羟化酶上游启动子THp（-493/+27序列）；所用引物序列如下：
上游引物F3：ATTCGTTAACCAGATGGCACTCCTAGGAACCAC
下游引物R3：ATTCTCTAGATCAGTGTGGAGGTCCGGGCTCCG
按照实施例一的条件进行PCR反应，PCR回收产物取10 ul用HpaI和XbaI双切，酶切产物DNA凝胶回收试剂盒回收；LV-GSK-3β-KD载体用HpaI和XbaI双切，酶切产物DNA凝胶回收试剂盒回收；THp启动子片段与LV-GSK-3β-KD载体酶切回收产物按3:1的比例用T4连接酶进行连接；转化后挑取单克隆进行鉴定并测序，得到儿茶酚胺能神经元特异表达的THp-GSK-3β-KD表达载体，即将LV-GSK-3β-KD载体的CMV启动子替换成THp启动子。THp-GSK-3β-KD序列结构示意图见图1。
实施例五：LV-THp-GSK-3β-KD慢病毒包装纯化及感染
1. 慢病毒包装
1)转染前24 h，用胰酶消化对数生长期的293T 细胞，传代到10 cm 细胞培养皿，37℃、 5% CO2 培养箱内培养。24 h 待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数；
2)转染前将细胞培养基更换为无血清培养基；
3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA 溶液(LV-THp-GSK-3β-KD载体 10 μg ，pGag/Pol载体5μg、pRev载体5μg、pVSV-G 载体5μg)，与相应体积的Opti-MEM 混合均匀，调整总体积为 1.5 ml；
4)将Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇匀，取60μl Lipofectamine 2000 试剂在另一管中与1.5ml Opti-MEM 混合，在室温下温育5 分钟；
5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000 进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；
6)混合后，在室温下温育20 分钟，以便形成DNA 与Lipofectamine 2000 稀释液的转染复合物；
7)将DNA与Lipofectamine 2000 混合液转移至293T 细胞的培养液中，混匀，于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养；
8)培养6小时后吸去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基10ml，于37 ℃、5% CO2 培养箱内继续培养48 小时。
2.病毒的收获及浓缩
1)收集转染后 48 小时和72小时（转染从0小时起计）的293T 细胞上清液；
2)于 4 ℃，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片；
3)以 0.45 μm 滤器过滤上清液于50 ml离心管中；
4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中；
5)组合好后，做好平衡，放在转头上；
6)在 5000 × g 离心，至需要的病毒浓缩体积；通常需要的时间为10-15 分钟；
7)离心结束后，过滤杯中的即为病毒浓缩液；
8)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，可在4℃保存一周，或-80 ℃长期保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定。
3.慢病毒感染细胞：
(1)根据细胞的量将细胞在1.5ml 管中离心收集然后用100-200ul 的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准；
(2)吸取LV-THp-GSK-3β-KD病毒液加入细胞中，将1.5ml 管放在37℃度培养箱中孵育30 分钟；另取LV-GFP空载体对照病毒感染做对照细胞系；
(3)将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里；
(4)加入足够量的新鲜培养液；
(5)12 小时后换液；
(6)48小时后进行免疫荧光实验观察THp-GSK-3β-KD表达情况，此外用LV-GFP作对照，进行结果的对比（见图2）。
图2 是LV-THp-GSK-3β-KD特异表达于儿茶酚胺能神经元细胞系。LV-THp-GSK-3β-KD及其对照LV-GFP慢病毒感染儿茶酚胺能神经元细胞系SK-N-BE-2-M17及非儿茶酚胺能细胞系HepG2，免疫荧光检测Flag及GFP，结果显示THp-GSK-3β-KD特异性的在儿茶酚胺能神经元细胞系表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广州永诺生物科技有限公司
<120> 一种THp-GSK-3β-KD表达载体以其应用
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tggtctgctg gctgtgtgtt ggctgagctg ttactaggac aaccaatatt tccaggggat 780
agtggtgtgg atcagttggt agaaataatc aaggtcctgg gaactccaac aagggagcaa 840
atcagagaaa tgaacccaaa ctacacagaa tttaaattcc ctcaaattaa ggcacatcct 900
tggactaagg attcgtcagg aacaggacat ttcacctcag gagtgcgggt cttccgaccc 960
cgaactccac cggaggcaat tgcactgtgt agccgtctgc tggagtatac accaactgcc 1020
cgactaacac cactggaagc ttgtgcacat tcattttttg atgaattacg ggacccaaat 1080
gtcaaactac caaatgggcg agacacacct gcactcttca acttcaccac tcaagaactg 1140
tcaagtaatc cacctctggc taccatcctt attcctcctc atgctcggat tcaagcagct 1200
gcttcaaccc ccacaaatgc cacagcagcg tcagatgcta atactggaga ccgtggacag 1260
accaataatg ctgcttctgc atcagcttcc aactccacct ga 1302
<210> 2
<211> 1302
<212> DNA
<213> human
<400> 2
atgtcagggc ggcccagaac cacctccttt gcggagagct gcaagccggt gcagcagcct 60
tcagcttttg gcagcatgaa agttagcaga gacaaggacg gcagcaaggt gacaacagtg 120
gtggcaactc ctgggcaggg tccagacagg ccacaagaag tcagctatac agacactaaa 180
gtgattggaa atggatcatt tggtgtggta tatcaagcca aactttgtga ttcaggagaa 240
ctggtcgcca tcagaaaagt attgcaggac aagagattta agaatcgaga gctccagatc 300
atgagaaagc tagatcactg taacatagtc cgattgcgtt atttcttcta ctccagtggt 360
gagaagaaag atgaggtcta tcttaatctg gtgctggact atgttccgga aacagtatac 420
agagttgcca gacactatag tcgagccaaa cagacgctcc ctgtgattta tgtcaagttg 480
tatatgtatc agctgttccg aagtttagcc tatatccatt cctttggaat ctgccatcgg 540
gatattaaac cgcagaacct cttgttggat cctgatactg ctgtattaaa actctgtgac 600
tttggaagtg caaagcagct ggtccgagga gaacccaatg tttcgtatat ctgttctcgg 660
tactataggg caccagagtt gatctttgga gccactgatt atacctctag tatagatgta 720
tggtctgctg gctgtgtgtt ggctgagctg ttactaggac aaccaatatt tccaggggat 780
agtggtgtgg atcagttggt agaaataatc aaggtcctgg gaactccaac aagggagcaa 840
atcagagaaa tgaacccaaa ctacacagaa tttaaattcc ctcaaattaa ggcacatcct 900
tggactaagg attcgtcagg aacaggacat ttcacctcag gagtgcgggt cttccgaccc 960
cgaactccac cggaggcaat tgcactgtgt agccgtctgc tggagtatac accaactgcc 1020
cgactaacac cactggaagc ttgtgcacat tcattttttg atgaattacg ggacccaaat 1080
gtcaaactac caaatgggcg agacacacct gcactcttca acttcaccac tcaagaactg 1140
tcaagtaatc cacctctggc taccatcctt attcctcctc atgctcggat tcaagcagct 1200
gcttcaaccc ccacaaatgc cacagcagcg tcagatgcta atactggaga ccgtggacag 1260
accaataatg ctgcttctgc atcagcttcc aactccacct ga 1302
<210> 3
<211> 520
<212> DNA
<213> human
<400> 3
cagatggcac tcctaggaac cacgtctaca agacacacgg cctggaatct tctggagaag 60
caaacaaatt gcctcctgac atctgaggct ggaggctgga ttccccgtct tggggctttc 120
tgggtcggtc tgccacgagg ttctggtgtt cattaaaagt gtgcccctgg gctgccagaa 180
agcccctccc tgtgtgctct cttgagggct gtggggccaa gggggccctg gctgtctcag 240
ccccccgcag agcacgagcc cctggtcccc gcaagcccgc gggctgagga tgattcagac 300
aagggctggg gagtgaaggc aattagattc cacggacgag ccctttctcc tgcgcctccc 360
tccttcctca cccacccccg cctccatcag gcacagcagg caggggtggg ggatgtaagg 420
aggggaaggt gggggaccca gagggggctt tgacgtcagc tcagcttata agaggctgct 480
gggccagggc tgtggagcgg agcccggacc tccacactga 520
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atccgctagc atgtcagggc ggcccaga 28
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aattgcggcc gctcaggtgg agttggaagc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctggtcgcca tcagaaaagt attgcaggac 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtcctgcaat acttttctga tggcgaccag 30
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attcgttaac cagatggcac tcctaggaac cac 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
attctctaga tcagtgtgga ggtccgggct ccg 33

Claims (9)

1.GSK-3β-KD蛋白序列，其特征在于：GSK-3β-KD蛋白序列是将GSK-3β蛋白的第85位的赖氨酸突变为精氨酸得到的。
2.根据权利要求1所述的蛋白序列，其特征在于：编码GSK-3β-KD蛋白的核酸序列如SEQID NO：2所示。
3.THp-GSK-3β-KD核酸序列，其特征在于：是在编码GSK-3β-KD蛋白的核酸序列上添加酪氨酸羟化酶的THp启动子序列得到的。
4.一种THp-GSK-3β-KD表达载体，其特征在于：是将THp-GSK-3β-KD核酸序列转入表达载体中得到的。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：THp-GSK-3β-KD表达载体用于帕金森病的药物开发及疾病治疗中。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：THp-GSK-3β-KD表达载体通过脂质体、阳离子多聚物或纳米基因载体的介导用于帕金森病的药物开发及疾病治疗中。
7.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：表达载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
8.THp-GSK-3β-KD表达载体在帕金森病的药物开发中的应用，其特征在于：THp-GSK-3β-KD表达载体如权利要求4-7任一项所述。
9.THp-GSK-3β-KD表达载体在治疗帕金森病的应用，其特征在于：THp-GSK-3β-KD表达载体如权利要求4-7任一项所述。
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