CN105778896B - 苯基（4‑哌啶基）甲酮类hERG钾离子通道的小分子荧光探针 - Google Patents

苯基（4‑哌啶基）甲酮类hERG钾离子通道的小分子荧光探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苯基（4‑哌啶基）甲酮类hERG钾离子通道的小分子荧光探针，并公开了其制备方法和应用。该荧光探针的结构通式如下所示：式中，R1为甲磺酰胺基、羟基、甲基或卤素的单取代基；R2为荧光团；n＝1‑6。小分子荧光探针在hERG钾离子通道高表达的细胞或组织标记中、在hERG钾离子通道抑制剂的高通量筛选以及在新药心脏毒性评价中、在作为识别hERG钾离子通道的探针以及在hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病研究中的应用。

Description

苯基（4-哌啶基）甲酮类hERG钾离子通道的小分子荧光探针
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种苯基(4-哌啶基)甲酮类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
人类果蝇相关基因—hERG(human ether-a-go-go-related gene)是通过筛选人类海马 cDNA与小鼠同源性分离出来的第一个Ethere-a-go-go家族成员，其编码的hERG钾离子通道由4个α亚基组成，每个亚基包含6个跨膜螺旋区域(称为S1-S6区域)和一个孔区域。其中S1-S4区域构成电压传感器，这一区域可随着膜电压的变化而在膜内移动，调节活性孔道的开放和关闭，S5-P-S6区域共同环绕构成hERG K+通道的活性孔道，状似漏斗形结构。另外，位于细胞膜内侧的N—端和C—端部分，为β亚基，主要对hERG钾离子通道的功能起调节作用。
在生理条件下，hERG钾通道在神经组织及心肌组织中高表达。目前，一些初步研究表明，hERG在某些肿瘤组织中高表达，而在其相应来源的正常组织中不表达或低表达。hERG钾通道在维持心肌细胞动作电位的复极过程中起重要作用，维持心肌细胞正常的兴奋性，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化及侵袭性密切相关。近年来不断有新药候选化合物在研究后期由于发现其潜在的心脏毒性而终止研发。此外，一些上市药物由于它们对hERG钾通道具有抑制作用可进一步引起长QT综合征，诱发尖端扭转型室性心动过速，产生心脏不良反应，从而被撤出市场，如抗组胺药物(阿司咪唑)、抗心律失常药物(多非利特)、促胃动力药物(西沙必利)等。因此，各国新药审批部门要求新药上市前需进行hERG抑制作用研究以评价药物的安全性。另外，研究表明对hERG通道有特异性阻断作用的药物可以抑制肿瘤细胞的增殖。因而，hERG钾离子通道已经作为药物心脏毒性筛选的重要靶标，并且将有可能作为肿瘤治疗的药物靶标以及肿瘤形成的生物标记物。
近年来，用于hERG钾离子通道的高通量筛选方法有电压膜片钳技术、放射性配体结合实验、及基于荧光探针的检测方法等。尽管自动化的高通量电压膜片钳方法得以发展，但该技术需要专业操作者、活细胞，并且膜片钳测试较昂贵，不适合大批量化合物的筛选。放射性配体结合实验中，放射配体的制备、储存及处理增加了试验程序的成本及时间，并且会造成辐射污染，此外，该方法对于大规模筛选或常规化合物评价难以自动化。伴随着荧光分析法在生物化学、医学和化学研究中的发展，大量荧光探针因其高灵敏度、动态分辨率、简便快捷以及与生物细胞和生理学分子的兼容性，被广泛用于各种生物分析中。目前，用于钾离子通道相关的荧光探针主要采用荧光蛋白标记技术、免疫荧光技术、电压敏感荧光探针等，而高选择性、高灵敏度的小分子荧光探针在钾离子通道领域的应用较少。小分子荧光探针具有快速、灵敏、高通量和易于自动化等特点，已经广泛应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。
研究建立针对hERG钾离子通道的小分子荧光探针高通量筛选与标记的方法，将直接反映化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，并以此探针分子作为工具去研究hERG钾通道的生理病理学特征，将对hERG钾通道的研究、药物研发及临床前药物的安全性评价具有重要意义。此外，人们发现一些肿瘤细胞高表达hERG钾离子通道，这为研究肿瘤细胞及其组织提供了新的启示。因此，如果能选取对hERG钾通道有高亲和力的配体小分子作为药效团与荧光基团相连接，从而获得hERG钾离子通道的小分子荧光探针，将其用于hERG 钾离子通道细胞和组织的荧光标记及药物筛选，将会为hERG钾离子通道病理学，生物学等相关研究提供新的研究工具，将成为更方便、更有效及全新的研究钾离子通道的手段。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种苯基(4-哌啶基)甲酮类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针，该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示：
式中，R1为甲磺酰胺基、甲基、羟基或卤素的单取代基；R2为荧光团；n＝1-6。
优选的，所述R1为甲磺酰胺基、甲基；R2为萘二酰亚胺类、SBD-Cl和香豆素类荧光团。
优选的，所述小分子荧光探针选自如下化合物：
N-(2-(4-(4-(甲基磺酰胺基)苯甲酰基)-1-哌啶基)丁基)-1,3-二羰基-2,3-二氢-1H-苯并[de] 异喹啉-6-乙酰胺；
N-(4-(1-(4-(6-(二甲氨基)-1,3-二羰基-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-丁基)-哌啶基-4-羰基)苯基)甲基磺酰胺；
7-(二乙氨基)-N-(2-(4-(4-(甲基磺酰氨基)苯甲酰基)-1-哌啶基)乙基)-2-氧-2H-苯并吡喃 -3-甲酰胺；
6-(二甲氨基)-2-(3-(4-(4-甲基苯甲酰基)-1-哌啶基)丙基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)二酮；
N,N-二甲基-7-((2-(4-(4-甲基苯甲酰基)-1-哌啶基)乙基)氨基)苯并[c][1,2,5]氧杂二唑-4- 磺胺；
7-(二乙氨基)-N-(2-(4-(4-甲基苯甲酰基)-1-哌啶基)乙基)-2-氧-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺。
优选的，所述小分子荧光探针具有如下结构式的化合物：
另外，当R1为羟基、卤素的单取代基时，本发明并没有给出具体化合物的结构，但是本领域的技术人员可以根据本发明的说明书公开的内容常规得到。
本发明的第二个方面，提供一种苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)识别基团的制备：1-乙酰基-4-哌啶甲酸、氯化亚砜和取代苯反应生成中间体1；然后所述中间体1与盐酸反应生成中间体2；
(2)荧光基团的制备：在荧光团上引出能发生取代的基团，得到具有取代基团的荧光基团；
(3)探针分子的制备：将步骤(2)中所述的具有取代基团的荧光团通过取代反应与步骤(1)中的中间体2反应，制备得到探针分子。
步骤(1)中，所述取代苯的结构通式如式(Ⅱ)所示：
式中，R1为甲磺酰胺基、羟基、甲基或卤素的单取代基。优选为甲苯、N-苯基甲磺酰胺。
所述中间体1的结构通式如式(Ⅲ)所示：
式中，R1为甲磺酰胺基、羟基、甲基或卤素的单取代基。
所述中间体2的结构通式如式(Ⅳ)所示：
式中，R1为甲磺酰胺基、羟基、甲基或卤素的单取代基。
优选的，所述1-乙酰基-4-哌啶甲酸、氯化亚砜和取代苯的摩尔比例为1:1:(0.5～1.5)。
优选的，所述中间体1的具体制备方法为：将1-乙酰基-4-哌啶甲酸溶于有机溶剂中，预热至30～50℃；将溶于有机溶剂的氯化亚砜加入上述1-乙酰基-4-哌啶甲酸体系中，在 55～75℃反应1～3h，然后在冰浴条件下加入取代苯和三氯化铝，在70～90℃反应9～11h，制备得到中间体1。
其中，所述有机溶剂优选为1,2-二氯乙烷。
优选的，所述中间体2的具体制备方法为：将中间体1加入盐酸中，在90～110℃进行反应16～20h，制备得到中间体2。
步骤(2)中，荧光团以及具有取代基团的荧光团的制备为本领域的常规技术，可以根据现有文献的报道，制备各种荧光团以及具有取代基团的荧光团。
优选的，当荧光基团为萘二酰亚胺类、SBD-Cl和香豆素类荧光团时，步骤(2)的具体方法为：
通过在萘二酰亚胺类、香豆素类及SBD-Cl类荧光团的结构上引出具有单取代卤素的烷基链，分别得到中间体3、4、5和6。
步骤(2)中所述具有单取代卤素的烷基链的萘二酰亚胺类中间体3和4结构通式分别如式(Ⅴ)和(Ⅵ)所示：
式中，X1、X2为卤素原子，n＝1-6。
所述具有取代基团的香豆素类中间体5结构通式如式(Ⅶ)所示：
式中，X3为卤素原子，n＝1-6。
所述具有取代基团的SBD-Cl类中间体6结构通式如式(Ⅷ)所示：
式中，X4为卤素原子，n＝1-6。
步骤(3)中，所述的具有取代基团的荧光团与所述中间体2的摩尔比例为(1～2)：1。
优选的，步骤(3)的具体方法为：将所述的具有取代基团的荧光团、所述中间体2和缚酸剂溶于有机溶剂中，在70～90℃反应7～9h。
其中，所述有机溶剂优选为乙腈，所述缚酸剂优选为碳酸钾或三乙胺。
本发明的第三个方面，提供以下应用：
本发明的苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针在制备用于标记hERG钾离子通道及其高表达的肿瘤细胞或组织的药物中的应用。
本发明的苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针在作为识别hERG钾离子通道的探针以及在制备用于研究hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病的药物中的应用。
本发明的苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针可直接反映化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，在hERG钾离子通道抑制剂的高通量筛选以及在新药心脏毒性评价中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针对hERG钾离子通道具有高选择性和高灵敏度，可以用于hERG钾离子通道的标记，以及hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病的研究；可用于hERG钾离子通道抑制剂的筛选，直接反应化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，用于新药心脏毒性评价的研究中。
(2)本发明的苯基(4-哌啶基)甲酮类hERG钾离子通道的小分子荧光探针的制备方法简单、反应条件温和，原料便宜易得，化合物的后处理方法简便。
附图说明
图1为L1与hERG转染的HEK293细胞、结肠癌细胞(HT-29)以及加入抑制剂的成像结果。(a)：探针分子L1(8μM)在hERG转染的HEK293细胞(hERG-HEK293)的成像；探针分子L1(8μM)与阿司咪唑(Astimizole，50μM)同时孵育细胞作为阴性对照。 (b)：探针分子L1(8μM)在结肠癌细胞(HT-29)的成像；探针分子L1(8μM)与阿司咪唑(Astimizole，100μM)同时孵育细胞作为阴性对照。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：N-(2-(4-(4-(甲基磺酰胺基)苯甲酰基)-1-哌啶基)丁基)-1,3-二羰基-2,3-二氢-1H- 苯并[de]异喹啉-6-乙酰胺(L1)的制备：
具体合成路线如下：
(1)中间体1的制备：
将1-乙酰基-4-哌啶甲酸(2.0g，11.68mmol)溶于1,2-二氯乙烷(30mL)中，搅拌预热至40℃；然后向溶液中滴入氯化亚砜(1.39g，11.68mmol；溶于5mL 1,2-二氯乙烷中)，滴加完毕后，升温至65℃反应2h，反应液中有白色沉淀生成。反应完毕后，将反应液冷却至室温，在冰浴条件下加入N-苯基甲磺酰胺(2.0g，11.68mmol)和AlCl3(3.12g，3.36mmol)，搅拌30min后于80℃回流9h。将反应液倒入碎冰中，用二氯甲烷萃取(100mL×3)，合并有几层，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩拌样，过硅胶柱纯化，得白色固体，产率为39.2％。1H-NMR(400MHz,DMSO):δppm:10.36(s,1H),7.99(d,J＝12.0Hz,2H),7.30(d,J＝8.0Hz, 2H),4.38(d,J＝16.0Hz,1H),3.85(d,J＝16.0Hz,1H),3.63(tt,J＝8.0Hz,4.0Hz,1H),3.19 (m,1H),3.12(s,3H),2.72(td,J＝12.0Hz,4.0Hz,1H),2.00(s,3H),1.77(t,J＝12Hz,2H),1.51(qd,J＝12Hz,4.0Hz,1H),1.33(qd,J＝12Hz,4Hz,1H)。
(2)中间体2的制备：
将中间体1(1g，3.08mmol)加入至30mL 1N HCl中，于100℃回流15h；将反应液真空浓缩，用乙酸乙酯重结晶，抽滤，干燥得白色固体，产率为74.5％。
(3)中间体3的制备：
向4-氨基-1,8-萘二酰亚胺(2.0g，9.3mmol)中加入4mL冰醋酸、20mL吡啶，回流反应 1h。然后加入30mL醋酸酐，回流反应5h。待反应液降至室温，倒入200mL冰水中，抽滤，滤饼用水洗涤，得粗品棕色固体，收率为71.3％。1H-NMR(400MHz,DMSO)：δppm: 10.53(s,1H),8.82(d,J＝8.0Hz,1H),8.55(d,J＝8.0Hz,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.39(d, J＝8.0Hz,1H),7.93(t,J＝8.0Hz,1H),2.31(s,3H)；ESI-MS([M+H]+)：256.3。
(4)中间体4的制备：
将中间体3(1.7g，6.66mmol)和4-氨基-1-丁醇(0.71g，7.96mmol)溶于无水乙醇中，回流反应6h。将反应液浓缩，用乙酸乙酯重结晶，抽滤，得棕色固体，收率为73.7％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δppm:8.63(dd,J＝7.2,0.9Hz,1H),8.59(d,J＝8.4Hz,1H),8.37(brs,1H),8.19(d,J＝8.1Hz,1H),7.83-7.75(m,2H),4.24(t,J＝7.2Hz,2H),3.76(t,J＝6.3Hz, 2H),1.89-1.79(m,2H),1.74-1.57(m,2H)；ESI-MS([M+H]+)：327.5。
(5)中间体5的制备：
将中间体4(0.6g，1.84mmol)溶于干燥乙酸乙酯中，再将0.5mL三溴化磷(溶于5mL乙酸乙酯中)在冰浴下逐滴加入至中间体4溶液中，滴加完毕后，于80℃回流反应6h。待反应液冷却至室温，将其倒入碎冰中，析出棕色固体，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥得棕色固体，收率95.2％。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δppm:8.63(d,J＝7.2Hz,1H),8.60(d,J＝8.1 Hz,1H),8.39(brs,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.81-7.75(m,2H),4.24(t,J＝6.9Hz,2H),3.49 (t,J＝6.3Hz,2H),2.38(s,3H),2.04-1.85(m,4H)；ESI-MS([M+H]+)：389.4。
(6)化合物L1的制备：
将中间体2(0.40g，1.25mmol)与中间体5(0.73g，1.88mmol)溶于20mL乙腈中，然后向溶液中加入三乙胺(0.26mL，2.5mmol)，80℃回流反应8h。将反应液拌样、过硅胶柱纯化，得黄绿色固体，收率为30％。1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ：10.51(s，1H)， 10.30(brs,1H)，8.75(d，J＝8Hz，1H)，8.52(d，J＝8Hz，1H)，8.48(d，J＝8Hz，1H)，8.31(d， J＝8Hz，1H)，7.97(d，J＝8Hz，1H)，7.88(t，J＝8Hz，1H)，7.31(d，J＝8Hz，2H)，4.07(d， 1H)，3.56(d，1H)，3.12(d,，3H)，2.86-2.75(m，4H)，2.30(d，3H)，1.91-1.69(m，8H)；
13C-NMR(400MHz,DMSO)：δ：200.49，170.10，164.04，163.47，143.69，140.88，132.12， 131.34，130.55，130.27，129.88，128.80，126.82，124.48，122.71，119.84，118.05，117.88， 51.77，26.84，25.57，24.57，22.35。
ESI-MS：([M+H]+)calcd for C31H34N4O6S：590.21971，found：591.2272。
实施例2：6-(二甲氨基)-2-(3-(4-(4-甲基苯甲酰基)-1-哌啶基)丙基-1H-苯并[de]异喹啉 -1,3(2H)二酮(L4)的制备。
具体合成路线如下：
(1)中间体1的制备：
将1-乙酰基-4-哌啶甲酸(2.0g，11.68mmol)溶于40mL 1,2-二氯乙烷中，预热至40℃；将氯化亚砜(0.85mL，11.68mmol)溶于1,2-二氯乙烷(5mL)中，逐滴加入预热的溶液中，然后升温至65℃回流反应2h，室温冷却；在冰浴条件下加入甲苯(1.08g，8.1mmol) 和三氯化铝(3.12g，3.36mmol)，搅拌30min后升温至80℃回流反应10h。反应完毕后，将反应液倒入碎冰中，用二氯甲烷萃取(100mL×3)，合并有机层，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩拌样，过硅胶柱纯化得白色固体，产率为30.2％。1H-NMR(400MHz,DMSO):δppm:7.91 (d,J＝8.0Hz，2H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),4.38(d,J＝16.0Hz,1H),3.85(d，J＝12.0Hz,1H), 3.67(tt,J＝8.0Hz,J＝4.0Hz,1H),(t,J＝8.0Hz,1H),2.72(t,J＝8.0Hz,1H),2.38(s,3H), 2.00(s,3H),1.77(t,J＝8.0Hz,2H),1.50(qd,J＝12.0Hz,4.0Hz,1H),1.33(qd,J＝12.0Hz, 4.0Hz,1H)。
(2)中间体2的制备：
将中间体1(0.7g，2.86mmol)加入至30mL 1N HCl中，于100℃回流18h；将反应液真空浓缩，用乙酸乙酯重结晶，抽滤，干燥得白色固体，产率为98.0％。1H-NMR(400MHz,DMSO):δppm:7.92(d,J＝8.0Hz,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,2H),3.73(tt,J＝12.0Hz,4.0Hz,1H),3.41(s,1H),3.29(d,J＝12.0Hz,2H),3.02(q,J＝12.0Hz,2H),2.39(s,3H),1.91(d,J＝ 12.0Hz,2H),1.78(m,2H).
(3)中间体3的制备
将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1.50g，5.41mmol)溶于40mL DMF中，向其中加入40％二甲胺水溶液(2.00g，44.36mmol)和CuSO4.5H2O(0.13g，0.54mmol)，与150℃回流10 h。反应完毕后将反应液用蒸馏水洗涤，二氯甲烷萃取(100mL×3)，用无水MgSO4干燥有机层、过滤，将母液浓缩，加入无水乙醇，有黄色固体析出，过滤并干燥得黄色固体，收率84.7％。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm:8.59(d,J＝8.0Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H), 8.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.77(m,1H),7.20(d,J＝8.0Hz,1H),3.17(s,6H)。
(4)中间体4的制备
将中间体3(0.2g，0.83mmol)溶于20mL无水乙醇中，然后加入3-氨基-1-丁醇(0.093 g，1.24mmol)，于80℃回流10h。反应完毕后，用适量蒸馏水洗涤反应液，用二氯甲烷萃取(100mL×3)并合并有机层，用无水MgSO4干躁，真空抽滤，将母液浓缩拌样，过硅胶柱纯化，得黄色固体，收率92.9％。1H-NMR(400MHz,CD3OD):δppm:8.43-8.38(m,2H), 8.29(d,J＝8.0Hz,1H),7.60(dd,J＝8.0Hz,8.0Hz,1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),4.12(t,J＝ 8.0Hz,2H),3.55(t,J＝8.0Hz,2H),3.03(s,6H),1.83(m,2H)。
(5)中间体5的制备
将中间体4(0.2g，0.67mmol)溶于30mL乙酸乙酯中，冰浴条件下，向其中逐滴加入2mL三溴化磷(溶于5mL乙酸乙酯中)，滴加完毕后，于80℃反应8h。反应完毕后，冷却至室温，将反应液倒入200mL碎冰中，析出固体，抽滤干燥得黄色固体。收率94.9％。1H-NMR(400MHz,DMSO):δppm:8.51(d,J＝8.0Hz,1H),8.46(d,J＝8.0Hz,1H),8.34(d,J ＝8.0Hz,1H),7.76(t,J＝8.0Hz,1H),7.22(d,J＝12.0Hz,1H),4.15(t,J＝8.0Hz,2H),3.60(d, J＝8.0Hz,2H),3.09(s,6H),2.18(m,2H)。
(6)化合物L4的制备
将化合物2(0.18g，0.75mmol)、K2CO3(0.24g，1.50mmol)与化合物5(0.25g，0.90mmol)溶于30mL MeCN中，于油浴80℃回流反应8h。反应完毕后，用适量蒸馏水洗涤反应液，二氯甲烷萃取(100mL×3)，无水MgSO4干燥有机层，过滤、浓缩母液并拌样，过硅胶柱纯化，得黄色固体，收率为24.8％。1H-NMR(400MHz，DMSO):δppm:8.49 (d,J＝8.0Hz,1H),8.44(d,J＝8.0Hz,1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,2H), 7.74(t,J＝8.0Hz,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,1H),4.08(t,J＝8.0Hz,2H), 3.25(s,1H),3.09(s,6H),2.88(d,J＝12.0Hz,2H),2.39(s,1H),2.36(s,3H),1.97(s,2H),1.79 (m,2H),1.64(d,J＝12.0Hz,2H),1.35(q,J＝12.0Hz,2H)。
13C-NMR(400MHz,CD3OD):δppm:202.28,164.18,163.54,156.97,143.78,133.55,132.60, 131.87,130.89,130.06,129.78,128.64,125.43,124.73,122.89,113.98,113.44,56.28,52.95, 44.85,43.02,38.56,28.82,25.06,21.57。
ESI-HRMS:([M+H]+)calcd for C30H33N3O3:483.2522；found:484.2604。
实施例3：光学性质的测定
表1：探针分子的光学特征
注：以上所有光学性质均在pH＝7.4的磷酸缓冲液中测量。
实施例4：探针分子在hERG钾离子通道细胞成像中的应用
以探针分子L1为研究对象，考察其在细胞成像中的应用，选择hERG转染的HEK293细胞(hERG-HEK293)、结肠癌细胞(HT-29)为阳性细胞，相同条件下，加入抑制剂阿司咪唑作为阴性对照。
具体步骤为：hERG转染的HEK293细胞用含有10％胎牛血清和400μg/mL G418的DMEM培养基；结肠癌细胞(HT-29)用含有10％胎牛血清的1640培养基，在5％CO2空气及37℃的环境中进行培养，细胞成像前，将细胞接种于共聚焦小皿中，培养12-24h； hERG-HEK293细胞成像时，将培养小皿中的培养基吸掉，用不含血清的培养基洗涤一次，加入探针L1(8μM，用不含血清的培养基配制)；相同条件下，另一小皿加入探针L1与抑制剂阿司咪唑(用不含血清培养基配制，L1浓度为8μM，阿司咪唑浓度为80μM)作阴性对照；孵育10min，然后吸出培养基，用不含血清的培养基洗涤一次，加入不含血清培养基1mL，用ZeissAxio ObserverA1成像。HT-29细胞的成像同hERG-HEK293细胞，采用的探针L1浓度为8μM；作阴性对照时，探针L1的浓度为8μM，阿司咪唑为100μM。
成像结果如图1所示，探针分子能够识别标记hERG转染的HEK293细胞 (hERG-HEK293)及hERG钾通道高度表达的结肠癌细胞(HT-29)，该探针在hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病的研究中有广阔的应用前景。
另外，经过大量的实验验证，本发明的其他探针分子(L2、L3、L4、L5、L6以及其他探针分子)在hERG钾离子通道细胞成像中也具有良好的应用前景，在此不再赘述。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针，其特征是，该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示：
式中，R1为甲磺酰胺基、羟基、甲基或卤素的单取代基；R2为萘二酰亚胺类、SBD-Cl类和香豆素类荧光团；n＝1-6。
2.如权利要求1所述的小分子荧光探针，其特征是：所述R1为甲基、甲磺酰胺基。
3.如权利要求1所述的小分子荧光探针，其特征是，所述小分子荧光探针选自如下化合物：
N-(2-(4-(4-(甲基磺酰胺基)苯甲酰基)-1-哌啶基)丁基)-1,3-二羰基-2,3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-6-乙酰胺；
N-(4-(1-(4-(6-(二甲氨基)-1,3-二羰基-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-丁基)-哌啶基-4-羰基)苯基)甲基磺酰胺；
7-(二乙氨基)-N-(2-(4-(4-(甲基磺酰氨基)苯甲酰基)-1-哌啶基)乙基)-2-氧-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺；
6-(二甲氨基)-2-(3-(4-(4-甲基苯甲酰基)-1-哌啶基)丙基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)二酮；
N,N-二甲基-7-((2-(4-(4-甲基苯甲酰基)-1-哌啶基)乙基)氨基)苯并[c][1,2,5]氧杂二唑-4-磺胺；
7-(二乙氨基)-N-(2-(4-(4-甲基苯甲酰基)-1-哌啶基)乙基)-2-氧-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺。
4.如权利要求1所述的小分子荧光探针，其特征是，所述小分子荧光探针具有如下结构式的化合物：
5.如权利要求1所述的苯基(4-哌啶基)甲酮类小分子荧光探针的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)识别基团的制备：1-乙酰基-4-哌啶甲酸、氯化亚砜和取代苯反应生成中间体1；然后所述中间体1与盐酸反应生成中间体2；
(2)荧光基团的制备：在荧光团上引出能发生取代的基团，得到具有取代基团的荧光基团；
步骤(2)中，当荧光基团为萘二酰亚胺类、SBD-Cl和香豆素类荧光团时，步骤(2)的具体方法为：通过在萘二酰亚胺类、香豆素类及SBD-Cl类荧光团的结构上引出具有单取代卤素的烷基链，分别得到中间体3、4、5和6；其中，所述中间体3和4结构通式分别如式(Ⅴ)和(Ⅵ)所示：
所述中间体5结构通式如式(Ⅶ)所示：
所述中间体6结构通式如式(Ⅷ)所示：
式中，X1、X2、X3、X4为卤素原子，n＝1-6；
(3)探针分子的制备：将步骤(2)所述的具有取代基团的荧光团通过取代反应与步骤(1)中的中间体2反应，制备得到探针分子；
其中所述中间体1的结构通式如式(Ⅲ)所示：
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，所述取代苯的结构通式如式(Ⅱ)所示：
式中，R1为甲磺酰胺基、羟基、甲基或卤素的单取代基。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，所述1-乙酰基-4-哌啶甲酸、氯化亚砜和取代苯的摩尔比例为1:1:(0.5～1.5)。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，所述中间体1的具体制备方法为：将1-乙酰基-4-哌啶甲酸溶于有机溶剂中，预热至30～50℃；将溶于有机溶剂的氯化亚砜加入上述1-乙酰基-4-哌啶甲酸体系中，在55～75℃反应1～3h，然后在冰浴条件下加入取代苯和三氯化铝，在70～90℃反应9～11h，制备得到中间体1。
9.权利要求1～4中任一项所述的小分子荧光探针的应用，包括：
在制备用于标记hERG钾离子通道及其高表达的肿瘤细胞或组织药物中的应用；
在作为识别hERG钾离子通道的探针以及在制备用于研究hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病的药物中的应用；
在hERG钾离子通道抑制剂的高通量筛选以及在新药心脏毒性评价中的应用。
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