CN105777700B - 一种分离生育酚同系化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生育酚同系化合物的分离方法，所述方法包括如下步骤：(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；(2)将生育酚混合物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到生育酚各同系化合物与流动相的混合液；其中，所述生育酚各同系化合物分别为α‑生育酚，(β+γ)‑生育酚和δ‑生育酚；(4)去除所述步骤(3)获得的生育酚各同系化合物与流动相的混合液中的流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

Description

一种分离生育酚同系化合物的方法

技术领域

本发明属于脂类加工领域，具体涉及一种从天然混合生育酚中分离生育酚同系化合物的方法。

背景技术

天然维生素E(学名生育酚)是一种混合物，它包括α-、β-、δ-、γ-生育酚和与上述四种生育酚相对应的生育三烯酚共计8种化合物，具有清除自由基、抗癌、抗心血管疾病、提高免疫力和抗衰老的作用。

生育酚的各同系化合物之间结构差异很小。如图1所示，其基本结构均由一个6-色满醇(6-hydroxyls chroman)和在色满环的2′位具有一个被取代的饱和C₁₆侧链组成。根据甲基在色满醇的苯环上的位置和数量不同，可分为α-、β-、γ-、δ-生育酚四种不同的化合物：其中，α-生育酚在苯环上具有3个甲基(R₁＝-CH₃，R₂＝-CH₃)，分子式为C₂₉H₅₀O₂，分子量为430.71；β-生育酚(R₁＝-CH₃，R₂＝-H)和γ-生育酚(R₁＝-H，R₂＝-CH₃)在苯环上各有两个甲基，二者为同分异构体，分子式为C₂₈H₄₈O₂，分子量为416.68；δ-生育酚在苯环上具有一个甲基(R₁＝-H，R₂＝-H)，其分子式为C₂₇H₄₆O2，分子量为402.65。生育酚同系化合物的基本结构如下所示：

在各同系化合物中，α-生育酚的生物活性最强，因此，人们对其生理活性的研究报道比较广泛。近年来研究者发现，非α-生育酚也具有比较独特的生理功能，例如Jiang等人(Jiang Q，Wong J，Fyrst H等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2004，101(51)：17825-17830)发现γ-生育酚可以抑制乳腺癌和肺癌细胞的增殖，而α-生育酚没有此项功能。闵军霞等人(闵军霞、郭俊生、赵法等，卫生研究，2003，32(4)：343-345)发现维生素E的各同系化合物诱导肝癌细胞凋亡的作用不同，其效应排序为δ-生育酚>γ-生育酚>α-生育酚，显示δ-生育酚具有潜在的抗肝癌临床应用前景。由此可以看出，随着非α-生育酚的生育酚同系化合物在生物医学和药理学的重要性的揭示，将引发开发研究非α-生育酚的生育酚同系化合物作为药物或功能补充食品的热潮，而高纯度生育酚同系化合物产品的分离制备和其应用范围的拓展也会成为生育酚产品开发的新趋势。

由于α-、β-、γ-、δ-四种生育酚化合物在分子结构上相差很小，采用一般的分离方法往往只能得到这四种化合物同时存在的混合生育酚，难以获得高纯度的生育酚各同系化合物。为了从生育酚混合物获得高纯度的生育酚各同系化合物，目前多利用它们在结构上的微小差异，采用树脂柱分离的方法进行分离。

专利申请CN 103012352A公开了利用阴离子交换树脂，以混合生育酚为原料，分离制备天然维生素E各同系化合物的方法，该方法将含量为50％的混合生育酚溶解于一定比例的溶剂，配成上柱液后，上柱，在离子交换树脂柱中停留1h-10h后，再采用不同的溶剂对柱进行洗脱并进行减压蒸馏去除溶剂，分别得到d-(β+γ)生育酚和d-δ生育酚。该方法仅分离得到d-(β+γ)生育酚和d-δ生育酚，却未能对d-α生育酚进行有效分离；并且，所获得的d-(β+γ)生育酚和d-δ生育酚体纯度较低、分离也不完全。

专利CN 102432584B公开了一种利用反相层析柱对50％的混合生育酚进行分离的方法。在该方法中，原料经一次上柱，即得到3种生育酚同系化合物，然而由于该方法采用成本较高的反相填料柱，且对操作条件的要求较高，很容易因物料处理条件的微小差异而使得分离效果产生波动，因此不易在工业中操作实施。

专利申请CN 101220018A公开了一种生育酚同系化合物的分离方法，以50-100％的混合生育酚为原料，采用四区八柱的模拟移动床色谱系统(simulated moving bedchromatography，SMBC)，以正己烷等为流动相，以硅胶等为固定相对物料进行分离。该方法需要在固定相和流动相间将混合生育酚进行多次吸附和洗脱，按照不同的洗脱顺序得到四种生育酚同系化合物。并且，该方法需要在不同时间对区间阀门进行切换，而且不能一次性获得所分离的同系化合物，操作复杂，设备成本高，该分离方法的工业化存在难度。

综上所述，涉及生育酚同系化合物分离的现有方法均采用填料作为固定相进行分离，需要进行吸附、解吸、洗脱的操作，操作上相对复杂。固定相存在的不可逆吸附的问题给所分离样品造成损耗。此外，固定相使用一定时间就需要进行再生操作，并且，经过一定时间的使用之后，即使再生程序也不能恢复至最初的分离效果，只能废弃填料，从而增加了工业运行成本。

另一方面，上世纪80年代由美国国立卫生院的Yoichiro Ito博士提出的高速逆流色谱(High-Speed Counter Current Chromatography，HSCCC)已被应用于多种天然产物的分离纯化过程。高速逆流色谱基于液液分配的基本原理，不采用任何固态的支撑物(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜等)，其固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附。该方法具有无样品的损失和污染、高效、快速和大制备量分离等优点。特别地，对于天然产物复杂混合物中特定成分的高纯度分离纯化，高速逆流色谱技术具有以下优势：

(1)分离效率高：分配分离在旋转运动中进行，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场甩成微小的颗粒，待分离的样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并能在这些颗粒震荡与对流的环境中有效传递，实现上万次高效连续的溶剂萃取过程，达到充分分离与纯化。这样的一步分离就能够将复杂体系中的特定成分分离到98％以上。

(2)使用成本低：分离过程不是吸附与淋洗，而是对流穿透的过程，因此不使用填料，与使用填料的制备柱色谱相比可以节省昂贵的填料费用。并且，在大规模生产中可实现溶剂的回收再利用，运行使用的后续投入很低。

(3)制备量大：由于不使用固相填料，没有填料在柱内的占空体积，柱内空间全部是有效空间，从而负载能力强、制备量大。

(4)回收率高：由于无不可逆吸附，避免了污染、变性和填料失活造成的样品损失，样品的回收率高。

(5)洁净环保：整个实验生产过程可以封闭进行，避免溶剂挥发造成的环境污染及对操作人员的身体伤害。

(6)工艺放大好：在小型仪器上摸索的工艺条件易于在大型仪器和生产过程中实现。

本领域尚未有利用HSCCC技术对生育酚同系化合物的混合物进行分离的报道。另外，根据本发明的方法实现了生育酚混合物中α-生育酚、(β+γ)-生育酚和δ-生育酚的高纯度、理想分离。

发明内容

为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种生育酚同系化合物的分离方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；

(2)将生育酚混合物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到生育酚各同系化合物与流动相的混合液；

其中，所述生育酚各同系化合物分别为α-生育酚，(β+γ)-生育酚和δ-生育酚；

(4)去除所述步骤(3)获得的生育酚各同系化合物与流动相的混合液中的流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

具体而言，本发明是通过如下技术方案实现的：

1.一种生育酚同系化合物的分离方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；

(2)将生育酚混合物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到生育酚各同系化合物与流动相的混合液；

其中，所述生育酚各同系化合物分别为α-生育酚，(β+γ)-生育酚和δ-生育酚；

(4)去除所述步骤(3)获得的生育酚各同系化合物与流动相的混合液中的流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

2.如段落1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为介电常数小于2.8的一种或多种溶剂。

3.如段落1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为介电常数大于3.6的一种或多种溶剂。

4.如段落1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为选自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、碳数1-4的低级醇和水组成的组，所述碳数1-4的低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇。

5.如段落4所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水的混合溶剂，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

6.如段落1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为由正庚烷、正己烷、正戊烷和石油醚组成的组。

7.如段落6所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷。

8.如段落1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷，且所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水的混合溶剂，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

9.如段落8所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)。

10.如段落9所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为(10-25):(10-25):(0.5-1)(v/v/v)。

11.如段落1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：

将所述一种或多种极性溶剂以及所述一种或多种非极性溶剂加入至分液漏斗，经振摇充分混合后静置分相，获得两相混合液。

12.如段落1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。

13.如段落12所述的方法，其特征在于，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。

14.如段落1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述生育酚混合物为50wt％-100wt％的天然混合生育酚。

15.如段落1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm。

16.如段落15所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。

17.如段落1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为25-35℃。

18.如段落1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-15ml/min。

19.如段落18所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为5-10ml/min。

20.如段落1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的检测器的波长为210-295nm。

本发明所述的“室温”是指环境温度在16-26℃的温度范围。

有益效果

本发明的方法解决了传统色谱柱分离方法具有死吸附体积、色谱柱寿命短、成本高的问题，采用高速逆流色谱法，通过一次操作即可将生育酚混合物中的各同系化合物分离，得到α、(β+γ)和δ生育酚同系化合物，具有工艺简单、操作方便、样品损耗少、高效快速、所得产品纯度高的优点，是一种适合制备高纯度生育酚同系化合物的良好方法。

附图说明

图1是根据本发明实施例4，利用高速逆流色谱分离生育酚混合物的色谱分离图。从谱图上可以看出，混合生育酚进样后分离出三个独立的峰，其中，经HPLC检测后可以确定得到峰1为δ-生育酚，峰2为(β+γ)-生育酚，峰3为α-生育酚。

具体实施方式

下文将详细阐述本发明。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为介电常数小于2.8的一种或多种溶剂。优选地，所述非极性溶剂选自于由正庚烷、正己烷、正戊烷和石油醚组成的组。更优选地，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷。最优选地，所述非极性溶剂为正己烷。

根据本发明的一个实施方式，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为介电常数大于3.6的一种或多种溶剂。所述极性溶剂为选自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、碳数1-4的低级醇和水组成的组，所述碳数1-4的低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇；更优选地，所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水的混合溶剂，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

在一个优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正己烷，所述极性溶剂为甲醇和水的混合溶剂。优选地，所述正己烷、甲醇和水的比例为正己烷:甲醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正己烷、甲醇和水的比例为正己烷:甲醇:水＝(10-25):(10-25):(0.5-1)(v/v/v)。

在另一优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷，所述极性溶剂为甲醇和水的混合溶剂。优选地，所述正庚烷、甲醇和水的比例为正庚烷:甲醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正庚烷、甲醇和水的比例为正庚烷:甲醇:水＝(10-25):(10-25):(0.5-1)(v/v/v)。

在又一个优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正己烷，所述极性溶剂为乙醇和水的混合溶剂。优选地，所述正己烷、乙醇和水的比例为正己烷:乙醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正己烷、乙醇和水的比例为正己烷:乙醇:水＝(10-25):(10-25):(0.5-1)(v/v/v)。

在另一优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷，所述极性溶剂为乙醇和水的混合溶剂。优选地，所述正庚烷、乙醇和水的比例为正庚烷:乙醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正庚烷、乙醇和水的比例为正庚烷:乙醇:水＝(10-25):(10-25):(0.5-1)(v/v/v)。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：将所述一种或多种极性溶剂以及所述一种或多种非极性溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。

根据本发明的一个实施方式，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(2)中，所述生育酚混合物为50wt％-100wt％的天然混合生育酚。所述天然混合生育酚为油脂工业中脱臭馏出物提纯所得的市售产品。

本发明使用的高效逆流色谱技术的一般操作过程为本领域所公知。具体而言，以非极性-极性两相溶剂的一个相作为固定相，另一相作为流动相，将待分离样品溶解于其中一相中。首先，将固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速、柱温和检测波长，待系统稳定后，以一定的流速泵入流动相进行平衡；待平衡后，加入生育酚各同系化合物标准样检测出峰时间，随后加入待分离样品；根据检测器图谱的出峰情况，收集生育酚各种同系化合物与流动相的混合液。

就本发明而言，以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，将生育酚混合物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm；优选地，高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为25-35℃。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-15ml/min；优选地，所述流动相得流速为5-10ml/min。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的检测器的波长为210-295nm。

实施例

借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。

本发明实施例所使用的正己烷、正庚烷、甲醇和乙醇均为北京化学试剂公司生产的分析纯试剂，水为去离子水，生育酚混合物为油脂工业中脱臭馏出物提纯所得的市售产品。

本发明实施例所使用的高速逆流色谱仪为同田公司生产的TBE300C型高速逆流色谱，高效液相色谱仪为安捷伦1260型高效液相色谱。

在本发明中，通过HPLC对获得的生育酚各同系化合物的纯度和得率进行分析。生育酚的HPLC分析方法参考高贵秋等(高贵秋、李玲、代斌等，粮油加工，2009(1)：81-83)的检测方法，采用常规C18反相液相分析色谱柱作为固定相，CH₃CN:CH₃OH＝50:50(v/v)作为流动相；色谱条件为：流速：2.0ml/min；波长：292nm。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的标准样品为从Sigma公司采购。

实施例

实施例1

本实施例所使用的生育酚混合物为混合生育酚，经HPLC方法测定，α-生育酚、(β+γ)-生育酚和δ-生育酚的总含量为96.5wt％，其中，α-生育酚的含量为22.9wt％；(β+γ)-生育酚的含量为35.8wt％；δ-生育酚的含量为37.8wt％。

(1)按照正庚烷:乙醇:水＝5:5:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理25min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.052g生育酚混合物，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为700rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以2ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；将检测波长设为254nm，根据检测器图谱出峰位置收集生育酚各种同系化合物与流动相的混合液；

(4)将所述步骤(3)获得的混合液放入旋转蒸发仪中去除流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

经过HPLC分析，本实施例获得227mgα-生育酚，其纯度为61.2wt％、回收率57.7％；407mg(β+γ)-生育酚，其纯度为55.7wt％、回收率为60.2％；408mgδ-生育酚，其纯度为58.2wt％、回收率为59.7％。

实施例2

本实施例所使用的生育酚混合物为混合生育酚，经HPLC方法测定，α-生育酚、(β+γ)-生育酚和δ-生育酚的总含量为92.1wt％，其中，α-生育酚的含量为21.8wt％；(β+γ)-生育酚的含量为33.4wt％；δ-生育酚的含量为36.9wt％。

(1)按照正己烷:甲醇:水＝30:30:0.5(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理25min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.034g生育酚混合物，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为900rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以15ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；将检测波长设为254nm，根据检测器图谱出峰位置收集生育酚各种同系化合物与流动相的混合液；

(4)将所述步骤(3)获得的混合液放入旋转蒸发仪中去除流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

经过HPLC分析，本实施例获得215mgα-生育酚，其纯度为90.2wt％、回收率86.0％；374mg(β+γ)-生育酚，其纯度为70.9wt％、回收率为76.8％；391mgδ-生育酚，其纯度为74.5wt％、回收率为76.3％。

实施例3

本实施例所使用的生育酚混合物为混合生育酚，经HPLC方法测定，α-生育酚、(β+γ)-生育酚和δ-生育酚的总含量为52.8wt％，其中，α-生育酚的含量为7.8wt％；(β+γ)-生育酚的含量为30.4wt％；δ-生育酚的含量为14.6wt％。

(1)按照正庚烷:甲醇:水＝25:25:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理25min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.003g生育酚混合物，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为850rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以10ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；将检测波长设为254nm，根据检测器图谱出峰位置收集生育酚各种同系化合物与流动相的混合液；

(4)将所述步骤(3)获得的混合液放入旋转蒸发仪中去除流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

经过HPLC分析，本实施例获得79mgα-生育酚，其纯度为91.3wt％、回收率92.2％；300mg(β+γ)-生育酚，其纯度为81.7wt％、回收率为80.4％；175mgδ-生育酚，其纯度为60.7wt％、回收率为72.5％。

实施例4

本实施例所使用的生育酚混合物为混合生育酚，经HPLC方法测定，α-生育酚、(β+γ)-生育酚和δ-生育酚的总含量为94.2wt％，其中，α-生育酚的含量为23.6wt％；(β+γ)-生育酚的含量为35.9wt％；δ-生育酚的含量为34.7wt％。

(1)按照正己烷:甲醇:水＝12.5:12.5:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理25min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.086g生育酚混合物，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为850rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以10ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；将检测波长设为254nm，根据检测器图谱出峰位置收集生育酚各种同系化合物与流动相的混合液；

(4)将所述步骤(3)获得的混合液放入旋转蒸发仪中去除流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

经过HPLC分析，本实施例获得250mgα-生育酚，其纯度为92.3wt％、回收率90.0％；415mg(β+γ)-生育酚，其纯度为90.2wt％、回收率为96.0％；391mgδ-生育酚，其纯度为91.2wt％、回收率为94.6％。

实施例5

本实施例所使用的生育酚混合物为混合生育酚，经HPLC方法测定，α-生育酚、(β+γ)-生育酚和δ-生育酚的总含量为92.0wt％，其中，α-生育酚的含量为9.0wt％；(β+γ)-生育酚的含量为54.2wt％；δ-生育酚的含量为28.8wt％。

(1)按照正己烷:甲醇:水＝12:12:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理25min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取0.869g生育酚混合物，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为800rpm、柱温为35℃，待系统稳定后，以5ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；将检测波长设为254nm，根据检测器图谱出峰位置收集生育酚各种同系化合物与流动相的混合液；

(4)将所述步骤(3)获得的混合液放入旋转蒸发仪中去除流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

经过HPLC分析，本实施例获得50mgα-生育酚，其纯度为78.7wt％、回收率50.3％；424mg(β+γ)-生育酚，其纯度为88.4wt％、回收率为79.6％；350mgδ-生育酚，其纯度为71.2wt％、回收率为99.6％。

Claims (16)

1.一种生育酚同系化合物的分离方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；

其中，所述极性溶剂为选自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、碳数1-4的低级醇和水组成的组，所述碳数1-4的低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇；所述非极性溶剂为选自于由正庚烷、正己烷、正戊烷和石油醚组成的组；

(2)将生育酚混合物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到生育酚各同系化合物与流动相的混合液；

其中，所述生育酚各同系化合物分别为α-生育酚，(β+γ)-生育酚和δ-生育酚；

(4)去除所述步骤(3)获得的生育酚各同系化合物与流动相的混合液中的流动相溶剂，获得生育酚各同系化合物产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水的混合溶剂，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷，且所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水的混合溶剂，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为(10-25):(10-25):(0.5-1)(v/v/v)。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：

将所述一种或多种极性溶剂以及所述一种或多种非极性溶剂加入至分液漏斗，经振摇充分混合后静置分相，获得两相混合液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生育酚混合物为50wt％-100wt％的天然混合生育酚。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。

13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为25-35℃。

14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-15ml/min。

15.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为5-10ml/min。

16.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的检测器的波长为210-295nm。