CN105777477B - 一种提取高纯度角鲨烯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种角鲨烯的提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；(2)将植物脱臭馏出物或其初步提纯物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；其中，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度≥1wt％的初步提纯物；(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到角鲨烯馏分；(4)去除所述步骤(3)获得的角鲨烯馏分中的溶剂，获得角鲨烯产品。

Description

一种提取高纯度角鲨烯的方法

技术领域

本发明属于脂类加工领域，涉及一种制备高纯度角鲨烯的方法。具体而言，本发明涉及一种从植物油脱臭馏出物中提取高纯度角鲨烯的方法。

背景技术

角鲨烯是一种高度不饱和的烃类化合物，具体为高度不饱和的直链三萜类化合物，具有特殊气味，为无色油状液体。其系统命名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，分子式为C₃₀H₅₀，其结构如化学式I所示。

化学式I角鲨烯结构式

角鲨烯广泛分布在人体的皮肤、内膜、肝脏、皮下脂肪、指甲、脑等器官和组织中，其在脂肪细胞中的浓度很高，而成年人的指甲中，占特征性脂类成分的37.172％。另外，角鲨烯在人体的皮脂细胞中含量也较多，每人每天角鲨烯分泌量约为125～425mg，以头皮脂分泌最多。

角鲨烯具有抗氧化、促进皮肤健康、促进心血管健康、辅助防治肿瘤、提高人体耐缺氧能力等诸多功效，广泛应用在医药、化妆品领域，近些年来在保健品领域的应用也逐步扩展。

目前市场上的角鲨烯主要是从深海鲨鱼的肝油中提取而来。随着深海鲨鱼数量逐步减少，部分物种濒临灭绝，这一来源日趋匮乏，供应紧张，所以寻找新的角鲨烯来源并开发相应的获取方法就显得非常重要。

为了扩充角鲨烯来源，科研工作者进行了各种尝试，以对角鲨烯进行化学或生物合成。

就目前而言，化学法偶合合成角鲨烯反应是最具工业前景的方法。例如，CN101891579A公开的方法以二氯丁烷为原料，与亚磷酸三乙酯反应生成磷酸酯，随后在碱的作用下和香叶基丙酮发生Wittig-Horner反应得到角鲨烯。但是，化学反应的工艺流程长，多利用有毒的化学药剂。并且，这样的制备工艺距离工业化大规模生产还存在一定的距离。此外，化学合成的角鲨烯双键结构与天然角鲨烯的全反式结构存在差别。

生物合成法主要利用微生物在特殊培养基上培养或发酵而获得角鲨烯。例如，CN103266137A公开了一种能够产生角鲨烯的大肠杆菌菌株；CN102787074A公开了一种能够生产角鲨烯的微藻，其角鲨烯含量达到1g/100g干重生物质。考虑到天然油料作物、油脂中角鲨烯含量基本都低于1wt％，这样的方法有力地提高了原料中角鲨烯的含量。就生物合成而言，其关键在于构建合适并具有实用价值的株系。目前，上述方法在菌株品系和角鲨烯得率等方面都还不理想，均存在特定缺陷，也无法大规模生产。

相比之下，从植物油脱臭馏出物(特别是橄榄油脱臭馏出物)中提取角鲨烯已成为获得角鲨烯的一种有效方法。然而，根据我国国情，大部分橄榄油都是依靠进口，从而缺乏橄榄油脱臭馏出物的稳定资源。因此，从我国现有的油脂资源中开发设计分离角鲨烯的工艺是一种经济可行的处理方式。

例如，CN103483305A涉及的方法采用尿素、溶剂为助剂，将其与馏出物溶解混合进行真空脱气并密封，施加超高压使馏出物中的饱和脂肪酸、脂肪烃和甾醇等快速结晶凝聚，并压滤分离后得到滤渣和滤液，脱除溶剂后可得较高纯度的维生素E(V_E)、角鲨烯和多不饱和脂肪酸。但是，该工艺在超高压下进行，需要真空脱气并引入尿素反应，增加了能耗和后续处理的难度。

CN102146014A公开了以油茶籽为原料提取角鲨烯的方法。该方法的具体工艺流程依次涉及浸提、浓缩、甲酯化、配位剂-硼砂反应、大孔树脂色谱分离纯化、浓缩、萃取、洗涤后继续浓缩，最后，将得到的角鲨烯粗油进行超临界二氧化碳萃取，得到含量为80％以上的角鲨烯产品。该方法工艺路线复杂、溶剂能耗消耗大，并且所采用的色谱分离存在死吸附、填料需要再生的问题，增加了生产成本。

以植物油脱臭馏出物作为原料的物料体系组分复杂。根据传统方法，需要多步工序才能达到分离纯化的目的。这样的方法大多存在处理步骤多、工艺流程长、溶剂和能量消耗大以及生产效率低的缺陷。

作为改进的分离纯化技术，上世纪80年代由美国国立卫生院的Yoichiro Ito博士提出的高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)已被应用于多种天然产物的分离纯化过程。高速逆流色谱基于液液分配的基本原理，不采用任何固态的支撑物(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜等)，其固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附。该方法具有无样品的损失和污染、高效、快速和大制备量分离等优点。特别地，对于天然产物复杂混合物中特定成分的高纯度单体的分离纯化，高速逆流色谱技术具有以下优势：

(1)分离效率高：分配分离在旋转运动中进行，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场甩成微小的颗粒，待分离的样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并能在这些颗粒震荡与对流的环境中有效传递，实现上万次高效连续的溶剂萃取过程，达到充分分离与纯化。这样的一步分离就能够将复杂体系中的特定成分分离到98％以上。

(2)使用成本低：分离过程不是吸附与淋洗，而是对流穿透的过程，因此不使用填料，与使用填料的制备柱色谱相比可以节省昂贵的填料费用。并且，在大规模生产中可实现溶剂的回收再利用，运行使用的后续投入很低。

(3)制备量大：由于不使用固相填料，没有填料在柱内的占空体积，柱内空间全部是有效空间，从而负载能力强、制备量大。

(4)回收率高：由于无不可逆吸附，避免了污染、变性和填料失活造成的样品损失，样品的回收率高。

(5)洁净环保：整个实验生产过程可以封闭进行，避免溶剂挥发造成的环境污染及对操作人员的身体伤害。

(6)工艺放大好：在小型仪器上摸索的工艺条件易于在大型仪器和生产过程中实现。

现有技术中，Hai-Tao Lu等利用高速逆流色谱技术从微藻破囊壶菌ATCC26185中提纯角鲨烯[Hai-Tao Lu，Yue Jiang，Feng Chen，Journal of Chromatography A，2003(994):37-43，非专利文献1]。通过对溶剂体系进行优化选择，可将角鲨烯含量从粗品油的0.14wt％提升到成品的96wt％，回收率高达95wt％。该方法中，首先需要对微藻细胞进行破碎过滤、有机溶剂多次萃取和氮气吹干等复杂的预处理操作，方可得到角鲨烯含量为0.14wt％的粗品油。此外，已知的是，微藻粗品油的主要成分为脂肪酸酯，成分相对简单；而植物脱臭馏出物的成分与其存在很大差异：除了游离脂肪酸，还有甘油酯、长链烷烃、V_E、甾醇等多种复杂组分。上述此外，植物脱臭馏出物的组分复杂，且各组分结构相似。现有技术中，虽然对以微藻粗品油作为原料，利用HSCCC技术分离纯化角鲨烯进行了研究，但是，对于如何以植物脱臭馏出物作为原料，利用HSCCC技术进行分离纯化，本领域尚未有报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种角鲨烯的提取方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；

(2)将植物脱臭馏出物或其初步提纯物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

其中，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度≥1wt％的初步提纯物；

(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到角鲨烯馏分；

(4)去除所述步骤(3)获得的角鲨烯馏分中的溶剂，获得角鲨烯产品。

具体而言，本发明是通过如下技术方案实现的：

1.一种角鲨烯的提取方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；

(2)将植物脱臭馏出物或其初步提纯物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

其中，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度≥1wt％的初步提纯物；

(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到角鲨烯馏分；

(4)去除所述步骤(3)获得的角鲨烯馏分中的溶剂，获得角鲨烯产品。

2.如段落1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为介电常数小于2.8的一种或多种溶剂。

3.如段落1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为介电常数大于3.6的一种或多种溶剂。

4.如段落1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为选自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、碳数1-4的低级醇和水组成的组，所述碳数1-4的低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇。

5.如段落4所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水的混合溶剂，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

6.如段落1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为由正庚烷、正己烷、正戊烷和石油醚组成的组。

7.如段落6所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷。

8.如段落1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷，且所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

9.如段落8所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)。

10.如段落9所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为(10-30):(10-30):(0.5-1)(v/v/v)。

11.如段落10所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为(20-30):(20-30):(0.5-1)(v/v/v)。

12.如段落11所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、碳数1-2的低级醇和水的比例为25:25:(0.5-1)(v/v/v)。

13.如段落1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：

将所述一种或多种极性溶剂以及所述一种或多种非极性溶剂加入至分液漏斗，经振摇充分混合后静置分相，获得两相混合液。

14.如段落1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。

15.如段落14所述的方法，其特征在于，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。

16.如段落1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述植物脱臭馏出物为从油脂工业中脱臭环节提出的油脚；所述油脂工业的油料作物来源为选自于大豆、菜籽、棉籽、米糠、橄榄中的一种或多种。

16.如段落1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对所述植物脱臭馏出物进行初步提纯的所述常规处理工艺包括皂化、酯化、冷析、溶剂萃取、分子蒸馏和/或离子交换工艺。

17.如段落16所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度为1-25wt％的初步提纯物。

18.如段落17所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度为5wt％-15wt％的初步提纯物。

19.如段落18所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经皂化、酯化、冷析、溶剂萃取和/或分子蒸馏工艺提纯的、角鲨烯纯度为5wt％-15wt％的初步提纯物。

20.如段落17所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度为15wt％-25wt％的初步提纯物。

21.如段落20所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经皂化、酯化、冷析、溶剂萃取和/或离子交换工艺提纯的、角鲨烯纯度为15wt％-25wt％的初步提纯物。

22.如段落1-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm。

23.如段落22所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。

24.如段落1-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为25-35℃。

25.如段落1-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-15mL/min。

26.如段落25所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为5-10mL/min。

有益效果

本发明的方法解决了对植物脱臭馏出物复杂体系进行提纯的传统方法中效能低的问题，借助高速逆流色谱技术，通过对脱臭馏出物废料或其初步提纯物进行简单处理，即可将角鲨烯在溶剂中的浓度由1-3wt％提高到80wt％以上。特别地，通过对极性溶剂/非极性溶剂进行优化，可实现将所述浓度提高到90wt％以上。本发明的方法具有工艺简单、操作方便、样品损耗少、高效快速、所得产品纯度高的优点，是一种适合制备高纯度角鲨烯的良好方法。

附图说明

图1是根据本发明实施例4，利用高速逆流色谱分离角鲨烯的色谱分离图，峰1为角鲨烯馏分的峰。

图2是本发明实施例4获得的分离后角鲨烯的HPLC图，10.416min处的峰对应于角鲨烯。

具体实施方式

下文将详细阐述本发明。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为介电常数小于2.8的一种或多种溶剂。优选地，所述非极性溶剂选自于由正庚烷、正己烷、正戊烷和石油醚组成的组。更优选地，所述非极性溶剂为正庚烷或正己烷。最优选地，所述非极性溶剂为正己烷。

所述极性溶剂为选自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、碳数1-4的低级醇和水组成的组，所述碳数1-4的低级醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇；更优选地，所述极性溶剂为碳数1-2的低级醇和水的混合溶剂，所述碳数1-2的低级醇为甲醇或乙醇。

在一个优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正己烷，所述极性溶剂为甲醇和水。优选地，所述正己烷、甲醇和水的比例为正己烷:甲醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正己烷、甲醇和水的比例为正己烷:甲醇:水＝(10-30):(10-30):(0.5-1)(v/v/v)；进一步优选地，所述正己烷、甲醇和水的比例为正己烷:甲醇:水＝(20-30):(20-30):(0.5-1)(v/v/v)；最优选地，所述正己烷、甲醇和水的比例为正己烷:甲醇:水＝25:25:(0.5-1)(v/v/v)。

在另一优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷，所述极性溶剂为甲醇和水。优选地，所述正庚烷、甲醇和水的比例为正庚烷:甲醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正庚烷、甲醇和水的比例为正庚烷:甲醇:水＝(10-30):(10-30):(0.5-1)(v/v/v)；进一步优选地，所述正庚烷、甲醇和水的比例为正庚烷:甲醇:水＝(20-30):(20-30):(0.5-1)(v/v/v)；最优选地，所述正庚烷、甲醇和水的比例为正庚烷:甲醇:水＝25:25:(0.5-1)(v/v/v)。

在又一个优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正己烷，所述极性溶剂为乙醇和水。优选地，所述正己烷、乙醇和水的比例为正己烷:乙醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正己烷、乙醇和水的比例为正己烷:乙醇:水＝(10-30):(10-30):(0.5-1)(v/v/v)；进一步优选地，所述正己烷、乙醇和水的比例为正己烷:乙醇:水＝(20-30):(20-30):(0.5-1)(v/v/v)；最优选地，所述正己烷、乙醇和水的比例为正己烷:乙醇:水＝＝25:25:(0.5-1)(v/v/v)。

在另一优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷，所述极性溶剂为乙醇和水。优选地，所述正庚烷、乙醇和水的比例为正庚烷:乙醇:水＝(5-30):(5-30):(0.5-1)(v/v/v)；更优选地，所述正庚烷、乙醇和水的比例为正庚烷:乙醇:水＝(10-30):(10-30):(0.5-1)(v/v/v)；进一步优选地，所述正庚烷、乙醇和水的比例为正庚烷:乙醇:水＝(20-30):(20-30):(0.5-1)(v/v/v)；最优选地，所述正庚烷、甲醇和水的比例为正庚烷:乙醇:水＝25:25:(0.5-1)(v/v/v)。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：将所述一种或多种极性溶剂以及所述一种或多种非极性溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液。根据本发明的一个实施方式，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。根据本发明的一个实施方式，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(2)中，所述植物脱臭馏出物为从油脂工业中脱臭环节提出的油脚。所述油脂工业的油料作物来源为选自于大豆、菜籽、棉籽、米糠、橄榄中的一种或多种。根据本发明的另一实施方式，对所述植物脱臭馏出物进行初步提纯的所述常规处理工艺包括皂化、酯化、冷析、溶剂萃取、分子蒸馏和/或离子交换工艺。

在一个实施方式中，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为：对从所述油脂工业中脱臭环节提出的油脚中的V_E和甾醇进行进一步提取，获得1wt％-25wt％角鲨烯初步提纯物。在一些实施方式中，所述植物脱臭馏出物中角鲨烯的纯度为1wt％-3wt％；在另一些实施方式中，所述植物脱臭馏出物初步提纯物中，角鲨烯的纯度为1wt％-25wt％、优选5wt％-25wt％、更优选5wt％-15wt％或15wt％-25wt％。例如，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经皂化、酯化、冷析、溶剂萃取和/或分子蒸馏工艺提纯的、角鲨烯纯度为5wt％-15wt％的初步提纯物。或者，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度为15wt％-25wt％的初步提纯物。

对从所述油脂工业中脱臭环节提出的油脚中的V_E进行进一步提取的方法为本领域所公知。例如，如《大豆油脱臭馏出物中角鲨烯提取工艺研究》(陈璐等，中国油脂，2014，39(9))所记载的，以大豆油脱臭馏出物为原料，采用碱性乙醇对其进行皂化处理并分离不皂化物；在反应温度90℃，反应时间40min，碱浓度1.6mol/L，料液比1:2的条件下用正己烷提取3次，获得10.34wt％的角鲨烯。或者，根据《大豆油脱臭馏出物中角鲨烯的分离提取研究》(齐德珍，天津大学硕士论文，2012年)采用二级分子蒸馏，在系统压力为0.1Pa，蒸发温度175℃、进料速率4ml/min、刮膜转速200rpm、预热温度70℃的条件下，于第二级轻相中得到含量为21.01wt％的角鲨烯。

本发明使用的高效逆流色谱技术的一般操作过程为本领域所公知。具体而言，以非极性-极性两相溶剂的一个相作为固定相，另一相作为流动相，将待分离样品溶解于其中一相中。首先，将固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速和柱温，待系统稳定后，以一定的流速泵入流动相进行平衡；待流动平衡后，加入角鲨烯标准样检测出峰时间，随后加入待分离样品；根据检测器图谱的出峰情况收集角鲨烯馏分。

就本发明而言，以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，将植物脱臭馏出物或其初步提纯物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm；优选地，高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为25-35℃。

根据本发明的一个实施方式，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-15mL/min；优选地，所述流动相的流速为5-10mL/min。

实施例

借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。

本发明的实施例中所使用的正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇均为北京化学试剂公司生产的分析纯试剂，水为去离子水，大豆脱臭馏出物、米糠脱臭馏出物和菜籽脱臭馏出物的来源为油脂工厂。

本发明的实施例中所使用的高速逆流色谱仪为同田公司生产的TBE300C型高速逆流色谱仪，高效液相色谱仪为安捷伦1260型高效液相色谱仪。

在本发明中，通过HPLC对获得的角鲨烯产品的纯度和得率进行分析。角鲨烯的HPLC分析方法参考陈全斌(陈全斌、程忠泉、杨建香，广西植物，2006，26(6)：687-689)的检测方法，采用常规C18反相液相分析色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。HPLC条件为：流动相：CH₃CN:CH₃OH＝60:40(v/v)；流速：2.0mL/min；波长：210nm；灵敏度：0.64；柱温：40℃。角鲨烯标准样品从Sigma公司采购。

实施例

实施例1：以大豆脱臭馏出物作为原料，提取高纯度角鲨烯的方法

(1)按照正己烷:乙醇:水＝5:5:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.052g角鲨烯含量为1.83wt％的大豆脱臭馏出物，将其溶解于20mL步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为700rpm、柱温为35℃，待系统稳定后，以2ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待流动平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；根据检测器图谱出峰位置收集样品馏分；

(4)将所述步骤(3)获得的馏分放入旋转蒸发仪中去除溶剂，获得角鲨烯产品。

经过HPLC分析，本实施例获得25mg角鲨烯产品，纯度为21.2wt％。实施例2：以米糠脱臭馏出物的初步提纯物提取高纯度角鲨烯的方法

本实施例中，所述米糠脱臭馏出物的初步提纯物为：对米糠脱臭馏出物顺序进行皂化、酯化、冷析、溶剂萃取以及分子蒸馏处理，得到角鲨烯纯度为8.69wt％的米糠脱臭馏出物的初步提纯物。

(1)按照正庚烷:乙醇:水＝10:10:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.098g角鲨烯含量为8.69wt％的米糠脱臭馏出物的初步提纯物，将其溶解于20mL步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为900rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以15ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待流动平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；根据检测器图谱收集样品馏分；

(4)将所述步骤(3)获得的馏分放入旋转蒸发仪中去除溶剂，获得角鲨烯产品。

经过HPLC分析，本实施例获得78mg角鲨烯产品，纯度为55.2wt％。实施例3：以菜籽脱臭馏出物粗提物作为原料，提取高纯度角鲨烯的方法

本实施例中，所述菜籽脱臭馏出物的初步提纯物为：对菜籽脱臭馏出物顺序进行皂化、酯化、冷析、溶剂萃取以及离子交换处理，得到角鲨烯纯度为20.1wt％的菜籽脱臭馏出物的初步提纯物。

(1)按照正庚烷:甲醇:水＝30:30:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.033g角鲨烯含量为20.1wt％的菜籽脱臭馏出物的初步提纯物，将其溶解于20mL步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为850rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以5ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待流动平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；根据检测器图谱收集样品馏分；

(4)将所述步骤(3)获得的馏分放入旋转蒸发仪中去除溶剂，获得角鲨烯产品。

经过HPLC分析，本实施例获得195mg角鲨烯产品，纯度为92.3wt％。实施例4：以大豆脱臭馏出物的初步提纯物作为原料，提取高纯度角鲨烯的方法

本实施例中，所述大豆脱臭馏出物的初步提纯物为：对大豆脱臭馏出物顺序进行皂化、酯化、冷析、溶剂萃取以及离子交换处理，得到角鲨烯纯度为24.8wt％的大豆脱臭馏出物的初步提纯物。

(1)按照正己烷:甲醇:水＝25:25:0.5(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.021g角鲨烯含量为24.8wt％的大豆脱臭馏出物的初步提纯物，将其溶解于20mL步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为850rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以5ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待流动平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；根据检测器图谱收集样品馏分；

(4)将所述步骤(3)获得的馏分放入旋转蒸发仪中去除溶剂，获得角鲨烯产品。

经过HPLC分析，本实施例获得246mg角鲨烯产品，纯度为97.2wt％。实施例5：以角鲨烯纯度为1.94％的大豆脱臭馏出物作为原料，提取高纯度角鲨烯的方法

(1)按照正己烷:甲醇:水＝25:25:0.5(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.109g角鲨烯含量为1.94wt％的大豆脱臭馏出物，将其溶解于20mL步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为850rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以10ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待流动平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；根据检测器图谱收集样品馏分；

(4)将所述步骤(3)获得的馏分放入旋转蒸发仪中去除溶剂，获得角鲨烯产品。

经过HPLC分析，本实施例获得265mg角鲨烯产品，纯度为96.2wt％。实施例6：以米糠脱臭馏出物的初步提纯物作为原料，提取高纯度角鲨烯的方法

本实施例中，所述米糠脱臭馏出物的初步提纯物为：角鲨烯纯度为2.12wt％的米糠脱臭馏出物的初步提纯物。

(1)按照正己烷:甲醇:水＝25:25:1(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。

(2)取1.075g角鲨烯含量为2.12wt％的米糠脱臭馏出物的初步提纯物，将其溶解于20mL步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为800rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以5ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待流动平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入；根据检测器图谱收集样品馏分；

(4)将所述步骤(3)获得的馏分放入旋转蒸发仪中去除溶剂，获得角鲨烯产品。

经过HPLC分析，本实施例获得19mg角鲨烯产品，纯度为89.7wt％。

Claims (16)

1.一种角鲨烯的提取方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将一种或多种极性溶剂与一种或多种非极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；

(2)将植物脱臭馏出物或其初步提纯物溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；

其中，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度为1wt％-25wt％的初步提纯物；

(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，得到角鲨烯馏分；

(4)去除所述步骤(3)获得的角鲨烯馏分中的溶剂，获得角鲨烯产品；

其中，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为选自于由甲醇和水组成的组；所述非极性溶剂为选自于由正庚烷和正己烷组成的组；所述非极性溶剂、甲醇和水的体积比为25-30:25-30:0.5-1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂、甲醇和水的体积比为25:25:0.5-1。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：

将所述一种或多种极性溶剂以及所述一种或多种非极性溶剂加入至分液漏斗，经振摇充分混合后静置分相，获得两相混合液。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述植物脱臭馏出物为从油脂工业中脱臭环节提出的油脚；所述油脂工业的油料作物来源为选自于大豆、菜籽、棉籽、米糠、橄榄中的一种或多种。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对所述植物脱臭馏出物进行初步提纯的所述常规处理工艺包括皂化、酯化、冷析、溶剂萃取、分子蒸馏和/或离子交换工艺。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度为5wt％-15wt％的初步提纯物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经皂化、酯化、冷析、溶剂萃取和/或分子蒸馏工艺提纯的、角鲨烯纯度为5wt％-15wt％的初步提纯物。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经常规处理工艺初步提纯的、角鲨烯纯度为15wt％-25wt％的初步提纯物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述植物脱臭馏出物的初步提纯物为经皂化、酯化、冷析、溶剂萃取和/或离子交换工艺提纯的、角鲨烯纯度为15wt％-25wt％的初步提纯物。

12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。

14.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为25-35℃。

15.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-15mL/min。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为5-10mL/min。