CN105771937A - 一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法和用途 - Google Patents

一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取玉米赤霉烯酮的免疫亲和柱。本发明所提供的免疫亲和柱用来提取谷物和饲料中的霉菌毒素玉米赤霉烯酮，包括玉米赤霉烯酮特异性抗体、偶联有玉米赤霉烯酮特异性抗体的CNBr active Sepharose 4B、装载亲和材料的塑料管以及保存液。本发明的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱使用方便，具有高特异性、可快速提取谷物和饲料中残留的玉米赤霉烯酮。

Description

一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于谷物和饲料中真菌毒素残留检测分析技术领域。具体而言，本发明涉及一种玉米赤霉烯酮的免疫亲和层析柱及其制备方法和用途。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)为一种白色结晶，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。1962年Stob等首先从发霉的玉米中分离得到了该毒素，命名为玉米赤霉烯酮。
ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品如饲料等。Toshitsugu对19个国家和地区的谷物、食品及饲料中所含的ZEN进行了调查发现，包括中国、阿根廷、加拿大、波兰及也门等众多国家和地区的样品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，ZEN及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。ZEN对动物及人类危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症。造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统，免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。SchoentalR在进行致癌试验时发现，试验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿瘤；此外，试验组和对照组大鼠还发生了乳腺纤维瘤、腺瘤、腺癌、垂体腺癌、睾丸间质肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类似情况发生，这些肿瘤所涉及的器官表明，它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此认为，它们是由污染饲料的ZEN或其代谢产物引起的。
玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)。但是，目前所用的确证方法对样品要求高，前处理复杂，限制了监测的效率。实际工作中，由于生物样本的成分复杂，而且大多数取样量很少，这对分析方法的特异性和灵敏度提出了很高的要求。因此，有必要建立一种操作快捷，且具有很高的特异性和灵敏度的方法。
免疫亲和层析技术是一种即免疫反应和层析技术相结合的分析方法，在提纯物质上是一项效率高、提纯物质纯度高、快速的技术，可以使免疫检恻技术(如ELISA等)和层析技术在特异性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，避免了免疫分析法直接测定样品的不足。
免疫亲和柱是上个世纪90年代在分析领域中得到应用的技术，但用免疫亲和柱提取样品中的玉米赤霉烯酮未见报道。因此，本发明人通过大量试验，研制成功了一种具有高特异性和灵敏度且操作快捷的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。
发明内容
本发明目的是提供一种快速提取玉米赤霉烯酮的免疫亲和柱及其制备方法和用途。
本发明的原理是根据抗原抗体的特异性反应和可解离的特性，用玉米赤霉烯酮抗体提取谷物和饲料中的玉米赤霉烯酮残留。
一方面，本发明提供了一种制备玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的方法，该方法包括下列步骤：
该方法包括下列步骤：
a)称取CNBractiveSepharose4B柱料1g，加入1mMHCl溶液10ml，浸泡30min，使之溶胀。
b)然后以3000～8000r/min转速离心2～10min分离柱料，用0.1MPH9.0CB缓冲液洗涤溶胀的基质3～5次，每次加入缓冲液10ml，以5000r/min离心10min分离柱料。
c)向溶胀好的柱料中加入抗体30mg，再加入0.1MPH9.0CB缓冲液10ml，于37℃条件下150r/min震荡反应1h。
d)离心分离柱料，用0.1MPH8.3NaHCO3缓冲液洗柱料3～5次，10ml/次。
e)加入含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液10ml于结合有抗体的柱料中，4℃过夜或者37℃，150r/min反应2h封闭未结合位点。
f)用含0.5MNaCl的0.1MPH4.0的醋酸钠洗脱液与含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液交替洗涤3～5遍，最终用含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl洗脱液10ml复溶。
g)按每支1ml抗体结合凝胶溶液进行装柱，加20％的乙醇保存液，4～8℃，可保存一年以上。
另一方面，本发明提供了一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，该免疫亲和柱包括偶联有玉米赤霉烯酮特异性抗体的CNBractiveSepharose4B与装载该亲和柱的塑料管，以及保存液。
其中所述的玉米赤霉烯酮特异性抗体为单克隆抗体。本发明所述的玉米赤霉烯酮特异性单克隆抗体通过下述方法制备：1)按小分子半抗原的免疫方法制备玉米赤霉烯酮与载体蛋白偶联物；2)用该偶联物作为免疫原免疫动物(例如，小鼠)；3)通过杂交瘤技术获得单克隆抗体。
其中所述的载体蛋白包括但不限于，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)。
另一方面，本发明提供了一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的使用方法，该方法包括：
a)将亲和柱从2～8℃环境中取出，回温至室温；将免疫亲和柱连接于10ml的注射器下。
b)1ml的亲和柱产品需将柱体上方塞子取下，剪掉塞子的下部，再插回亲和柱上连接注射器。3ml的亲和柱产品使用转接头进行连接；
c)准确吸取5ml待测液加入到注射器中，使用注射器控制待测液流速为1～2秒每滴通过亲和柱；用5ml去离子水淋洗亲和柱2次，使用注射器控制流速为0.5～1秒每滴，待液体通过后，排干亲和柱内的液体；
d)准确吸取1ml甲醇，进行洗脱操作，使用注射器控制流速为2～3秒每滴，收集全部洗脱液，用于分析。
本发明使用谷物及饲料进行了回收率实验，结果表明玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的回收率不低于85％，回收率达到了分析方法的回收率要求。
因此，另一方面，本发明提供了所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱在提取谷物和饲料中玉米赤霉烯酮残留的用途。
一个具体实施方案中，所述的谷物为玉米、大豆、花生、小麦、大麦、大米。
具体实施例
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
实施例1抗玉米赤霉烯酮抗体的制备
1.1玉米赤霉烯酮半抗原的制备
取玉米赤酶烯酮32mg，1，3-丙二胺0.1mL及少量4-二甲氨基吡啶加入5mL干燥的二甲基甲酰胺中，作为A液；取N，N’-二环己基碳二亚胺40mg溶解于1mL干燥的二甲基甲酰胺，作为B液；0℃条件下缓慢滴加B液于A液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应24小时。蒸除溶剂，柱层析纯化后得到羧丙基玉米赤酶烯酮，合成路线如图1。
取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，1.1-2.7ppm之间增加的丙二胺片段伤的烷基信号峰，说明半抗原合成成功。
1.2免疫原的制备
取7mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液0.1mL，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取载体蛋白(具体可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白)30mg，使之充分溶解在2.7mL0.1mol/LCB(pH9.6)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到载体蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用5M的硼氢化钠水溶液0.2mL进行还原反应4小时，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天换透析液3次，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。
1.3单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并发现，其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株，将该抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆化，并进行扩增，以备冻存保存。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。
实施例2玉米赤霉烯酮免疫亲和柱制备
(1)称取CNBractiveSepharose4B柱料1g，加入1mMHCl溶液10ml，浸泡30min，使之溶胀。
(2)然后以3000～8000r/min转速离心2～10min分离柱料，用0.1MPH9.0CB缓冲液洗涤溶胀的基质3～5次，每次加入缓冲液10ml，以5000r/min离心10min分离柱料。
(3)向溶胀好的柱料中加入抗体30mg，再加入0.1MPH9.0CB缓冲液10ml，于37℃条件下150r/min震荡反应1h。
(4)离心分离柱料，用0.1MPH8.3NaHCO3缓冲液洗柱料3～5次，10ml/次。
(5)加入含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液10ml于结合有抗体的柱料中，4℃过夜或者37℃，150r/min反应2h封闭未结合位点。
(6)用含0.5MNaCl的0.1MPH4.0的醋酸钠洗脱液与含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液交替洗涤3～5遍，最终用含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl洗脱液10ml复溶。
(7)按每支1ml抗体结合凝胶溶液进行装柱，加20％的乙醇保存液，4～8℃，可保存一年以上。实施例3样品前处理
3.1溶液的配制
(1)配液1：60％甲醇溶液
将去离子水与甲醇按4：6体积比进行混合，用于处理样本。
(2)配液2：A液
分别称取3.03g三羟甲基氨基甲烷，7.31g氯化钠，加入200ml去离子水，搅拌至完全溶解，用盐酸调节PH值至8.5±0.1，然后定容至250ml。
(3)配液3：B液
分别称取2.05g醋酸钠，7.31g氯化钠，加入200ml去离子水，搅拌至完全溶解，用醋酸调节PH值至4.5±0.1，然后定容至250ml。
(4)配液4：保存液(20％乙醇)
将去离子水与乙醇按4：1体积比进行混合
3.2样本前处理方法
用均质器均质样品；称取5.0±0.05g样品至样品瓶中，分别加入1.0±0.05g氯化钠，25ml60％甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5min,或者摇床震荡20min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；(如不具备离心条件，该步骤也可用如下操作替代：静置后取10ml上清液过滤)；吸取5ml(相当于1g样品)离心后的上清液/滤液，加入5ml去离子水，混匀，待用。
实施例4样品液过柱净化
用实施例2所述方法制备的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱提取谷物和饲料中玉米赤霉烯酮免疫残留。
(1)将亲和柱从2～8℃环境中取出，回温至室温；将免疫亲和柱连接于10ml的注射器下。
(2)1ml的亲和柱产品需将柱体上方塞子取下，剪掉塞子的下部，再插回亲和柱上连接注射器(附图3)。3ml的亲和柱产品使用转接头进行连接(附图4)；
(3)准确吸取5ml待测液加入到注射器中，使用注射器控制待测液流速为1～2秒每滴通过亲和柱；用5ml去离子水淋洗亲和柱2次，使用注射器控制流速为0.5～1秒每滴，待液体通过后，排干亲和柱内的液体；
(4)准确吸取1ml甲醇，进行洗脱操作，使用注射器控制流速为2～3秒每滴，收集全部洗脱液，用于分析。
在上述步骤中，如试验室具备条件，可选用蠕动泵控制过柱的流速。同时.如果需要进行大量的样品检测试验，使用泵流操作架进行过柱操作，可减小工作强度，缩短试验时间。
实施例5亲和柱再生操作
本发明所提供的免疫亲和柱可经再生操作后再次用于样品液的净化，其中，亲和柱使用过后，应在30分钟内进行柱再生处理，否则柱体内载体干燥萎缩后，亲和柱将无法再生利用。
分别使用A液、B液交替冲洗使用过的亲和柱，每次5ml，共3次。然后加入保存液，置于2-8℃/35.6-46.4℉保存。
同时建议使用亲和柱不超过两次，如不需进行再生使用，本步骤可忽略。
实施例6回收率
使用本发明所提供的免疫亲和柱提取谷物样品以及饲料样品中的玉米赤霉烯酮残留，根据后续试验结果计算回收率。
表1回收率实验结果
结果表明，用免疫亲和柱提取谷物样品以及饲料样品中的玉米赤霉烯酮残留，回收率均大于85％，满足分析方法的回收率要求。

Claims (6)

1.一种制备玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的方法，该方法包括下列步骤：
a)称取CNBractiveSepharose4B柱料1g，加入1mMHCl溶液10ml，浸泡30min，使之溶胀；
b)然后以3000～8000r/min转速离心2～10min分离柱料，用0.1MPH9.0CB缓冲液洗涤溶胀的基质3～5次，每次加入缓冲液10ml，以5000r/min离心10min分离柱料；
c)向溶胀好的柱料中加入抗体30mg，再加入0.1MPH9.0CB缓冲液10ml，于37℃条件下150r/min震荡反应1h；
d)离心分离柱料，用0.1MPH8.3NaHCO3缓冲液洗柱料3～5次，10ml/次；
e)加入含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液10ml于结合有抗体的柱料中，4℃过夜或者37℃，150r/min反应2h封闭未结合位点；
f)用含0.5MNaCl的0.1MPH4.0的醋酸钠洗脱液与含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液交替洗涤3～5遍，最终用含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl洗脱液10ml复溶；
g)按每支1ml抗体结合凝胶溶液进行装柱，加20％的乙醇保存液，4～8℃，可保存一年以上。
2.根据权利要求1所述方法制备的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，其特征在于，该免疫亲和柱包括偶联有玉米赤霉烯酮特异性抗体的CNBractiveSepharose4B与装载其的塑料管，以及保存液。
3.权利要求2所述的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，其特征在于，其中所述的玉米赤霉烯酮特异性抗体为单克隆抗体。
4.权利要求2所述的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的使用方法，该方法包括以下步骤：
a)将亲和柱从2～8℃环境中取出，回温至室温，将免疫亲和柱连接于10ml的注射器下；
b)1ml的亲和柱产品需将柱体上方塞子取下，剪掉塞子的下部，再插回亲和柱上连接注射器，3ml的亲和柱产品使用转接头进行连接；
c)准确吸取5ml待测液加入到注射器中，使用注射器控制待测液流速为1～2秒每滴通过亲和柱，用5ml去离子水淋洗亲和柱2次，使用注射器控制流速为0.5～1秒每滴，待液体通过后，排干亲和柱内的液体；
d)准确吸取1ml甲醇，进行洗脱操作，使用注射器控制流速为2～3秒每滴，收集全部洗脱液，用于分析。
5.权利要求2所述的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的用途，其特征在于，所述用途为提取谷物样品以及饲料样品中的玉米赤霉烯酮残留。
6.权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的谷物样品为：玉米、大豆、花生、小麦、大麦、大米。
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