CN113960314A - 一种玉米赤霉醇免疫亲和柱及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉醇免疫亲和柱，包括偶联有玉米赤霉醇单克隆抗体的固相载体、装载其的塑料管及保存液，所述玉米赤霉醇单克隆抗体是以玉米赤霉醇半抗原‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述玉米赤霉醇半抗原是以玉米赤霉酮为起始原料，在L‑羟脯氨酸盐的催化下，与三甲基氰硅烷反应得到氰醇化合物，再对氰基进行水解反应得到的。本发明提供的玉米赤霉醇免疫亲和柱结构简单、使用方便、特异性强，可快速提取动物源性食品中的玉米赤霉醇残留。

Description

一种玉米赤霉醇免疫亲和柱及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于免疫亲和层析技术领域，具体而言，本发明涉及一种玉米赤霉醇免疫亲和柱及其制备方法和用途。
背景技术
玉米赤霉醇又名“右环十四酮酚”，商品名为“畜大壮”，是一种效果理想的皮埋增重剂，能提高畜禽饲料的转化率和酮体瘦肉率。但研究表明，玉米赤霉醇对哺乳动物具有一定的危害性，特别是生殖方面危害。虽然玉米赤霉醇在体内大部分会被代谢掉，但仍有一部分会残留在埋置部位，而且通过食物链食用含有玉米赤霉醇残留的动物源性食品后，导致消费者促性腺激素水平的降低、内分泌失调、生长发育障碍以及影响人体第二性征发育等不良影响，还具有潜在的致癌、致畸、致突变等毒性。1998年，欧盟禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖；2002年，我国农业部公告第235号明确规定玉米赤霉醇禁止用于所有动物，所有动物食品中不得检出。由于玉米赤霉醇作为畜禽增重剂效果好、经济效益高，仍被非法使用。
目前对动物源食品中玉米赤霉醇残留的主要检测方法有酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱法(UPLC)及其联合各种检测器如紫外(UV)、荧光(FL)、质谱(MS)等。进行痕量检测时要尽可能地降低背景干扰，因此对样品前处理的要求相对较高。常见的前处理方法有液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)等。但LLE需要使用大量的有机溶剂，操作繁琐，费时费力；SPE因其具有有机溶剂使用量小、吸附容量大、分离快速等特点，已成为最常用的萃取手段之一。目前常用于测定玉米赤霉醇的SPE柱有混合型阴离子交换柱(MAX柱)和亲水亲脂平衡柱(HLB柱)等，但因其不能选择性地吸附目标分子，在痕量药物测定过程中可能会引入干扰物。因此，有必要建立一种操作快捷，且具有很高的特异性和灵敏度的前处理方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种玉米赤霉醇免疫亲和柱及其制备方法和用途。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
提供一种玉米赤霉醇免疫亲和柱，所述免疫亲和柱包括偶联有玉米赤霉醇单克隆抗体的固相载体、装载其的塑料管及保存液，所述玉米赤霉醇单克隆抗体是以玉米赤霉醇半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述玉米赤霉醇半抗原是以玉米赤霉酮为起始原料，在L-羟脯氨酸盐的催化下，与三甲基氰硅烷反应得到氰醇化合物，再对氰基进行水解反应得到的，其分子结构式为：
Figure BDA0003304813770000021
按上述方案，所述固相载体为溴化氰活化琼脂糖凝胶4B。
按上述方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
提供所述玉米赤霉醇免疫亲和柱的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)固相载体活化：将溴化氰活化琼脂糖凝胶4B用1mmol/L HCl溶液浸泡30min，3000～8000r/min离心2～10min分离固相载体，再用0.1mol/L pH 9.0的CB缓冲液洗涤固相载体3～5次，5000r/min离心10min分离固相载体；
2)抗体偶联：向步骤1)活化的固相载体中加入玉米赤霉醇单克隆抗体，再加入0.1mol/L pH 9.0的CB缓冲液，37℃条件下150r/min震荡反应1h；反应结束后，离心分离偶联物，用0.1mol/L pH 8.3的NaHCO3缓冲液洗涤偶联物3～5次；
3)抗体封闭：向步骤2)的偶联物中加入0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液，4℃过夜或者37℃、150r/min反应2h封闭未结合位点；反应结束后，用0.1mol/L pH 4.0的含0.5mol/L NaCl的醋酸钠溶液与0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/LNaCl的Tris-HCl溶液交替洗涤3～5次，最后用0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液复溶；
4)装柱：按每支1mL抗体-固相载体偶联物进行装柱，加保存液，4～8℃保存。
提供所述玉米赤霉醇免疫亲和柱的用途，所述用途为提取动物源性食品中的玉米赤霉醇残留。
本发明使用猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉、鸡蛋、牛奶进行了回收率实验，结果表明玉米赤霉醇免疫亲和柱的回收率不低于85％，达到了分析方法的回收率要求。
本发明的原理是根据抗原抗体的特异性反应和可解离的特性，用玉米赤霉醇抗体提取动物源性食品中的玉米赤霉醇残留。本发明的免疫亲和柱具有高选择性，使样品前处理过程大大简化，分析质量得到改善；本发明的方法水相操作，步骤简单、净化效果好，免疫亲和柱可重复使用，减少了有机溶剂的用量，降低了分析成本和环境污染。
附图说明
图1为玉米赤霉醇半抗原合成图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。
实施例1玉米赤霉醇单克隆抗体的制备
1、玉米赤霉醇半抗原的合成(合成路线见附图1)
取玉米赤霉酮0.32g，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)10mL溶解，加L-羟脯氨酸钾0.13g，充分搅拌，加三甲基氰硅烷2.12g，室温搅拌8h，停止反应，加水20mL、1mol/L盐酸3mL，充分搅拌30min，停止搅拌，补加水50mL，加乙酸乙酯20mL×3萃取三次，合并有机相，蒸干得到红色油状物；将所得红色油状物用80％的硫酸溶解，90℃反应4h，停止反应，加6mol/L NaOH调节pH值到6，加二氯甲烷100mL萃取，分去水相，有机相旋蒸蒸干，上硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇体积比为10:1的混合溶液洗脱分离，得到羧基玉米赤霉醇，即为玉米赤霉醇半抗原。
2、免疫原的制备
取玉米赤霉醇半抗原27.3mg，加1mL DMF溶解澄清，加N-羟基丁二酰亚胺(NHS)17.2mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)28.1mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)100mg，加0.1mol/L pH 9.5的CB缓冲液9mL溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，用0.02mol/L PBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到玉米赤霉醇半抗原-BSA偶联物，即为免疫原。
3、玉米赤霉醇单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。
(5)单克隆抗体的特性鉴定
抗体效价：采用间接ELISA方法测定抗体效价，结果显示，玉米赤霉醇单克隆抗体的效价≥64000。
抗体特异性：采用间接竞争ELISA方法测定抗体特异性，结果见下表。
药物 交叉反应率/％
玉米赤霉醇 100
β-玉米赤霉醇 28.2
玉米赤霉烯醇 11.6
玉米赤霉酮 43.9
玉米赤霉烯酮 6.4
黄曲霉毒素B1 ＜0.1
赭曲霉毒素A ＜0.1
呕吐毒素 ＜0.1
T-2毒素 ＜0.1
伏马毒素 ＜0.1
实施例2玉米赤霉醇免疫亲和柱的制备
1、固相载体活化
称取溴化氰活化琼脂糖凝胶4B 1g，加入1mmol/L HCl溶液10mL，浸泡30min，使之溶胀；然后以3000～8000r/min离心2～10min分离固相载体，再用0.1mol/L pH 9.0的CB缓冲液洗涤溶胀的固相载体3～5次，每次加入缓冲液10mL，最后以5000r/min离心10min分离固相载体。
2、抗体偶联
向活化好的固相载体中加入玉米赤霉醇单克隆抗体30mg，再加入0.1mol/L pH9.0的CB缓冲液10mL，37℃条件下150r/min震荡反应1h；反应结束后，离心分离偶联物，用0.1mol/L pH 8.3的NaHCO3缓冲液洗涤偶联物3～5次，每次加入缓冲液10mL。
3、抗体封闭
向步骤2的偶联物中加入0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液10mL，4℃过夜或者37℃、150r/min反应2h封闭未结合位点；反应结束后，用0.1mol/L pH4.0的含0.5mol/L NaCl的醋酸钠溶液与0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液交替洗涤3～5次，最后用0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液10mL复溶。
4、装柱
按每支1mL抗体-固相载体偶联物进行装柱，加20％的乙醇保存液，4～8℃保存。
实施例3玉米赤霉醇免疫亲和柱的使用
1、样品制备
准确称取10.0g(精确至0.01g)均质的样品，加入2.0g氯化钠；与40.0mL甲醇-水溶液(80:20，V/V)混合，摇床振荡提取15min，4000r/min离心5min；准确移取10mL上清液，加入40mL PBS溶液稀释，混匀，用玻璃微纤维滤纸过滤至滤液澄清，备用。
2、免疫亲和柱净化
准确移取10mL上述滤液，注入注射器中，调节针筒压力使其以2s/滴的速度缓慢通过免疫亲和柱；用20mL水冲洗柱子(对于颜色较深的样液，先用10mL 0.1％吐温20-PBS清洗，再用10mL 10％甲醇-水冲洗，最后用10mL水冲洗)，流速1s/滴，弃去流出液，直至2～3mL空气通过柱体，保证柱子内没有残余液体；准确加入3.0mL甲醇-乙酸溶液(49:1，V/V)洗脱，流速自然重力，直至2～3mL空气通过柱体，保证柱子内没有残余液体；收集全部洗脱液，进行相关测定。
3、回收率测定
取空白猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉、鸡蛋、牛奶样本，分别添加玉米赤霉醇至浓度为10μg/kg，按上述方法制备样品并通过免疫亲和柱净化后，按照GB/T 23218-2008《动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定液相色谱-串联质谱法》方法进行检测，得到玉米赤霉醇的回收率见下表。
Figure BDA0003304813770000051
Figure BDA0003304813770000061
由上表可见，用本发明的玉米赤霉醇免疫亲和柱提取猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉、鸡蛋、牛奶等动物源性食品中的玉米赤霉醇，回收率均大于85％，满足分析方法的回收率要求。

Claims (5)

1.一种玉米赤霉醇免疫亲和柱，包括偶联有玉米赤霉醇单克隆抗体的固相载体、装载其的塑料管及保存液，其特征在于，所述玉米赤霉醇单克隆抗体是以玉米赤霉醇半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述玉米赤霉醇半抗原是以玉米赤霉酮为起始原料，在L-羟脯氨酸盐的催化下，与三甲基氰硅烷反应得到氰醇化合物，再对氰基进行水解反应得到的，其分子结构式为：
Figure FDA0003304813760000011
2.如权利要求1所述的玉米赤霉醇免疫亲和柱，其特征在于，所述固相载体为溴化氰活化琼脂糖凝胶4B。
3.如权利要求1所述的玉米赤霉醇免疫亲和柱，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
4.权利要求1所述的玉米赤霉醇免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)固相载体活化：将溴化氰活化琼脂糖凝胶4B用1mmol/L HCl溶液浸泡30min，3000～8000r/min离心2～10min分离固相载体，再用0.1mol/L pH 9.0的CB缓冲液洗涤固相载体3～5次，5000r/min离心10min分离固相载体；
2)抗体偶联：向步骤1)活化的固相载体中加入玉米赤霉醇单克隆抗体，再加入0.1mol/L pH 9.0的CB缓冲液，37℃条件下150r/min震荡反应1h；反应结束后，离心分离偶联物，用0.1mol/L pH 8.3的NaHCO3缓冲液洗涤偶联物3～5次；
3)抗体封闭：向步骤2)的偶联物中加入0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液，4℃过夜或者37℃、150r/min反应2h封闭未结合位点；反应结束后，用0.1mol/L pH4.0的含0.5mol/L NaCl的醋酸钠溶液与0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液交替洗涤3～5次，最后用0.1mol/L pH 8.0的含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl溶液复溶；
4)装柱：按每支1mL抗体-固相载体偶联物进行装柱，加保存液，4～8℃保存。
5.权利要求1所述的玉米赤霉醇免疫亲和柱的用途，其特征在于，所述用途为提取动物源性食品中的玉米赤霉醇残留。
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