CN105765382B - 用于预测具有心血管疾病或心血管事件的风险的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于通过测量样品中的sTREM‑1水平来诊断受试者中的心血管事件或心血管疾病的方法。

Description

用于预测具有心血管疾病或心血管事件的风险的方法和试 剂盒

技术领域

本发明涉及用于通过测量样品中的可溶性TREM-1的水平来预测受试者具有心血管事件的风险的方法和试剂盒。

背景技术

动脉粥样硬化通过动脉的缓慢进展的损伤形成和腔道变窄而产生脑血管疾病和冠状动脉疾病。在斑块破裂和血栓形成后，心血管疾病的这些最常见形式的心血管疾病表现为急性冠脉综合征(ACS)、心肌梗塞或中风。人和动物的研究已确定动脉粥样硬化由动脉壁内的慢性炎性过程驱动，所述慢性炎性过程主要响应内源修饰的结构、特别是刺激先天性免疫应答和适应性免疫应答两者的氧化脂蛋白而被引发。先天性应答由血管细胞和单核细胞/巨噬细胞两者的激活引起，随后针对由抗原呈递细胞呈递给效应子T淋巴细胞的大量潜在抗原产生适应性免疫应答(Ait-Oufella,H.等人，2011.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.31:969-979.)。遗传改良的小鼠模型教导我们，循环的单核细胞被趋化因子募集到血管壁，然后成为巨噬细胞和载脂泡沫细胞。内膜巨噬细胞通过细胞因子释放、炎症扩大，以及由于蛋白酶产生和凋亡累积导致的斑块失稳而促进斑块发展(Libby,P.等人，2011.Nature 473:317-325.)。单核细胞/巨噬细胞被称为PAMP(病原体相关分子模式)的若干介质刺激，所述介质与PRR(病原体识别受体)相互作用。若干PRR与动脉粥样硬化的病理生理学有关。例如，Toll样受体在人和动物粥样硬化病灶中表达。

心肌梗塞或脑梗塞例示了源于有害且破坏性的、永久的或过渡性的局部缺血的复杂临床综合征。这通常由冠状动脉闭塞/脑动脉闭塞引起，导致氧的供应与需求之间失衡。心肌梗塞与多相炎性应答有关。初始缺血诱导坏死、自由基氧物质形成、补体激活和由TNF-α释放引发的细胞因子级联。梗塞区域的再灌注相与促成缺血部位的白细胞募集的增加和加速的炎性反应有关。被募集的白细胞还参与炎性介质的原位和全身性释放，最终导致促成梗塞的病理生理结果的超激活炎性状态。

总之，大量证据显示先天性免疫、尤其是单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞在动脉粥样硬化的病理生理学和缺血后心脏组织重塑中起关键作用。心肌梗塞(MI)在数周期间诱导高水平的血液循环单核细胞。升高水平的循环单核细胞提供了可用于募集到生长的动脉病灶的扩大的炎性细胞库，潜在地促进斑块破裂。实际上，MI之后的白细胞增多预示再梗塞和死亡的风险增加(Swirski FK.和Nahrendorf M.2013.Science.339:161-166；Sabatine,M.S等人，2002.J.Am.Coll.Cardiol.40:1761-1768)。实际上，MI增加了动脉粥样硬化斑块中在一定距离内的炎症，由此加速慢性动脉粥样硬化，并且先天性免疫细胞是该现象的驱动力。

TREM-1(骨髓细胞上表达的触发受体-1)是由先天性免疫细胞(单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞)表达的免疫受体。TREM-1激活导致细胞因子和趋化因子产生(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1和MCP-3、MIP-1α……)以及快速的嗜中性粒细胞脱粒和氧化爆发(oxidative burst)(Derive,M.等人，2010.Self Nonself 1:225-230；Derive,M.等人，2012.J.Immunol.Baltim.Md 1950)。TREM-1的功能是通过与PRR(包括TLR)协同作用来调节/扩大炎症以触发足够的免疫应答，而不是激发/引发炎症。

C-反应蛋白质(CRP)被广泛地用于心血管事件诊断测试。然而，它在本领域内未被公认为非常特异性的预后指示剂。

现行诊断程序例如在鉴别处于某些结局的风险的个体方面还不是完全令人满意的。需要用于冠状动脉疾病的诊断和预测的方法和系统，如可非侵袭性地、敏感地和可靠地评估和预测特别是处于CAD和其后果的风险的人的不利心血管结局的那些。

因此，本发明的目的在于提供用于鉴别处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险的受试者的新颖方法。

发明内容

本发明的一个目标是用于鉴别处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因(all-cause)死亡的风险的受试者的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平。

本发明的另一目标是用于对处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因(all-cause)死亡的风险的受试者分级的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平。

本发明的另一目标是用于评估受试者中的心血管事件或心血管疾病的严重程度的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平。

在一个实施方案中，比较sTREM-1水平与参考值。

在一个实施方案中，高于参考值的sTREM-1水平指示具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或全因死亡的风险。

在一个实施方案中，样品是血样。

在一个实施方案中，该心血管事件是心肌梗塞。在另一实施方案中，该心血管事件是动脉粥样硬化。

本发明的另一目标是用于监测需要其的受试者中的心血管事件或心血管疾病的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平。

本发明的另一目标是用于监测向正遭受或已遭受心血管事件或心血管疾病的受试者施用的疗法的有效性的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平。在一个实施方案中，将sTREM-1的水平与受试者的个人化参考值进行比较。优选地，受试者的个人化参考值是在所述疗法开始之前或开始时从所述受试者获得的样品中测量的sTREM-1的水平。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

"心血管事件"在本文中可与术语"心脏事件"、"急性动脉血管事件"或"动脉血管事件"互换使用并且是指心脏性猝死，急性冠脉综合征，如但不限于斑块破裂、心肌梗塞、不稳定型心绞痛，以及非心脏性急性动脉血管事件，如腿的血凝块、动脉瘤或动脉瘤进展、中风，和其中动脉血管血流和氧合短暂或永久中断的其它动脉血管缺血事件。

如本文所定义的"心血管疾病"或"动脉血管疾病"是用于对影响身体的心脏、心脏瓣膜、血液和脉管系统的众多病况分类的一般术语，且涵盖影响心脏或血管的任何疾病，包括但不限于代谢综合征、X综合征、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛、中风、主动脉和其分支的疾病(如主动脉狭窄、血栓形成或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病，且包括但不限于任何短暂或永久缺血性动脉血管事件。如本文所用的动脉血管疾病意在最通常指代缺血性疾病或促缺血性(pro-ischemic)疾病，而非一般指代非缺血性疾病。如本文所用的"动脉粥样硬化"和"动脉粥样硬化血栓形成"是指与针对多面性血管病变的复杂炎性应答有关的全身性炎性疾病状态，其涉及内皮的炎性激活、作为血栓形成性刺激来源的炎性白细胞、作为促凝血剂来源和血栓形成期间的炎性应答扩大剂的平滑肌细胞以及作为炎症和血栓形成的介质的血小板。动脉由于称为"斑块"的物质在其内壁上累积而硬化并且变窄。随着斑块产生和大小增加，动脉的内部变得更窄("狭窄")且可流过它们的血液更少。狭窄或斑块破裂可引起受累的脉管系统的部分或完全闭塞。由脉管系统供应的组织因此被剥夺其氧合来源(缺血)并且可发生细胞死亡(坏死)。"CAD"或"冠状动脉疾病"是当向心肌供应血液的动脉(冠状动脉)变得动脉粥样硬化、钙化和/或狭窄时发生的动脉血管疾病。最后，至心肌的血流减少，且由于血液带有大量被需要的氧，因此心肌不能收到它所需要的氧量，且经常经历坏死。CAD涵盖例如以下的疾病状态：急性冠脉综合征(ACS)、心肌梗塞(心脏病发作)、心绞痛(稳定型和不稳定型)以及向心脏供应富氧血液的血管中发生的动脉粥样硬化和动脉粥样硬化血栓形成。"CVD"或"脑血管疾病"是向面部和脑供给富氧血液的血管中的动脉血管疾病，如动脉粥样硬化和动脉粥样硬化血栓形成。该术语经常被用于描述向脑供应血液的颈动脉的"硬化"。它是CAD和/或PAD(外周动脉疾病)的常见并发疾病。它还被称作缺血性疾病或引起血液缺乏的疾病。CVD涵盖例如以下的疾病状态：脑血管缺血、急性脑梗塞、中风、缺血性中风、出血性中风、动脉瘤、轻度认知损害(MCI)和短暂性缺血发作(TIA)。缺血性CVD被认为与CAD和PAD密切相关；非缺血性CVD可具有多重病理生理学机制。估计有500万美国人是过去被诊断的急性CVD事件的幸存者，估计每年发生70万起急性CVD事件。如本文所公开的，基于传统动脉血管疾病风险因素的临床评估而被视为处于CVD的低风险或无CVD风险或无例如TIA、MCI或剧烈头痛的症状的受试者仍然可能处于急性CVD事件的风险。"PAD"或"外周动脉疾病"涵盖在心脏和脑外部发生的疾病状态，如动脉粥样硬化和动脉粥样硬化血栓形成。它是CAD的常见并发疾病。甚至在不存在跛行的情况下，基于PAD(或动脉血管疾病)的传统风险因素的评估而被视处于PAD的低风险或无PAD风险或无PAD或动脉血管疾病症状的受试者仍然可能处于动脉血管事件的风险。跛行可被定义为腿部肌肉中由于变窄的外周动脉流向肌肉的血液量降低而发生的疼痛或不适，产生缺血并且经常产生动脉闭塞，引起骨骼肌和肢体坏死。疼痛或不适经常发生在步行时并且在静止条件下消除(间歇性跛行)。由于跛行而经常经历疼痛、紧张、绞痛、疲倦或虚弱。PAD不仅引起CAD中常见的血液动力学改变，而且还导致骨骼肌中的代谢变化。当PAD已进展到严重的慢性和急性外周动脉闭塞时，手术和截肢经常成为唯一的治疗选择。广泛认为PAD是一种容易漏诊的疾病，大多数被确认的诊断仅在症状表现后进行，或仅针对其它动脉血管疾病进行，且已经发生由于此类缺血性事件所致的不可逆的动脉血管损害。

"测量(Measuring)"或"测量(measurement)"或可选择地"检测(detecting)"或"检测(detection)"意指评估临床样品或来源于受试者的样品内的给定物质的存在、不存在、数量或量(其能够是有效量)(包括此类物质的定性或定量浓度水平的衍生物)，或在其他情况下评价受试者的非分析物临床参数的值或分类。

在本发明的上下文中，"风险"涉及事件在特定的时期内(如在向动脉血管事件的转化中)发生的概率，且可意指受试者的"绝对"风险或"相对"风险。可参考对相关时间群组测量后的实际观察或参考从已被随访相关时期的统计学上有效的历史群组产生的指标值来测量绝对风险。相对风险是指受试者的绝对风险相比于低风险群组的绝对风险或平均群体风险的比率，其可随评估临床风险因素的方式而变化。通常还使用比值比(给定测试结果的阳性事件与阴性事件的比例)(比值取决于式p/(l-p)，其中p是事件的概率且(1-p)是无事件的概率)。

在本发明的上下文中，"样品"是从受试者分离的生物样品且可包括例如且不限于从受试者获得的体液和/或组织提取物，如均质物或溶解组织。常规地从组织活体解剖和尸体解剖材料获得组织提取物。可用于本发明中的体液包括血液、尿液、唾液或任何其它身体分泌物或其衍生物。如本文所用，"血液"包括全血、血浆、血清、循环的上皮细胞、组分或血液的任何衍生物。

"临床参数或指标(indicia)"涵盖受试者健康状态或其它特征的所有非样品或非分析物生物标志物，例如但不限于年龄(age/Age)、种族(ethnicity/Race)、性别(gender/Sex)、舒张压(DBP)和收缩压(SBP)、家族史(FamHX)、身高(HT)、体重(WT)、腰(waist/Waist)围和臀(hip/Hip)围、体重指数(BMI)以及其它如I型或II型糖尿病或妊娠性糖尿病(DM或GDM，这里统称为糖尿病)和静息心率。

在本发明的上下文中，"受试者"优选为哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些示例。非人哺乳动物可有利地被用作代表动脉血管疾病或动脉血管事件的动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是先前已被诊断或鉴别为具有动脉血管疾病或动脉血管事件且任选地已经历或正经历对于动脉血管疾病或动脉血管事件的治疗介入的受试者。或者，受试者还可以是先前尚未被诊断为具有动脉血管疾病的受试者。例如，受试者可以是展现动脉血管疾病的一种或多种风险因素的受试者、或未展现动脉血管风险因素的受试者、或无动脉血管疾病或动脉血管事件症状的受试者。受试者还可以是正遭受动脉血管疾病或动脉血管事件或处于产生动脉血管疾病或动脉血管事件的风险的受试者。

如本文所用的"可溶性TREM-1"(sTREM-1)是指TREM-1(保藏号Q9NP99，SEQ ID NO:1)的胞外结构域的可溶性形式。sTREM-1通过TREM-1的胞外结构域的切割而被释放。sTREM-1可以是通过TREM-1的膜结合形式的蛋白水解切割生成的TREM-1的可溶性形式。Gingras的研究(Gingras等人，Mol Immunol 2002,Mar；38(11):817-24)试图鉴别可翻译为可溶性受体的替代性TREM-1mRNA剪接变体(TREM-1sv)的表达。但从未证实TREM-1的这一可溶性形式(它是由假定核苷酸序列预测的蛋白质序列)在人体中被发现。稍后于2007年和2012年，Gomez-Pina(Gomez-Pina等人，J Immunol.2007年9月15日；179(6):4065-73和Gomez-Pina等人，J Leukoc Biol.2012年6月；91(6):933-45)证实通过金属蛋白酶对TREM-1的膜锚定形式的蛋白水解切割生成了可溶性-TREM-1。实际上，TREM-1是具有容易通过MMP脱落而生成sTREM-1的Ig样胞外结构域的跨膜糖蛋白。在人白细胞中未检测到TREM-1的替代性剪接形式。

“约”在数字前意指所述数字的值的+或-10％。

具体实施方式

TREM-1(骨髓细胞上表达的触发受体-1)是由先天性免疫细胞表达的免疫受体。不希望受限于理论，本发明人指出Nod样受体(NLR)接合(包括Toll样受体TLR)诱导上调TREM-1表达和其膜展示。所述NLR和TLR激活能够在无菌炎性条件下通过关联危险相关分子模式(DAMP)发生或在感染条件下通过关联病原体相关分子模式(PAMP)发生。NLR和TLR的这一激活诱导金属蛋白酶的上调，金属蛋白酶的上调进而在众多靶标中将通过切割TREM-1的胞外结构域而诱导其可溶性形式的释放[Gomez-Pina等人，J Immunol.2007,179(6):4065-73]。

在一个实施方案中，sTREM1具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，其对应于SEQ ID NO:1的氨基酸21到205。

在另一实施方案中，sTREM1具有氨基酸序列SEQ ID NO:3，其对应于SEQ ID NO:1的氨基酸31到205。

在一个实施方案中，sTREM 1是SEQ ID NO:2的变体或SEQ ID NO:3的变体。

在一个实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体是分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的至少25个邻接氨基酸、优选至少50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、165个、170个、175个、180或185个邻接氨基酸的氨基酸序列。

在另一实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体是分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的C-末端或N-末端中的额外氨基酸的氨基酸序列，其中额外氨基酸的数目的范围为1到50个、优选1到20个、更优选1到10个氨基酸，如例如，C-末端中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸和/或N-末端中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。

在另一实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体是与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的区别通常在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述取代、缺失、添加和/或插入可影响1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。

在另一实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体是分别与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、90％、95％或至少96％、97％、98％、99％或更高同一性的至少25个氨基酸、优选至少50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、165个、170个、175个、180个或185个氨基酸的氨基酸序列。

当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时，术语"同一性"或"相同的"是指多肽之间的序列相关程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数目所确定。“同一性”度量通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)、采用空位比对(如果有的话)确定的两条或更多条序列中较小的序列之间相同匹配的百分比。相关多肽的同一性可通过已知方法容易地进行计算。此类方法包括但不限于Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M.StocktonPress,New York,1991；和Carillo等人，SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)中描述的那些。用于确定同一性的优选方法被设计成在所测试序列之间产生最大匹配。在可公开获得的计算机程序中描述了用于确定同一性的方法。用于确定两条序列之间的同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包(其包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.\2,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)和其它来源(BLAST Manual,Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等人，见上)可公开地获得。众所周知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体不是SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，sTREM 1是SEQ ID NO:2的片段或SEQ ID NO:3的片段。

在一个实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的片段是分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的至少25个邻接氨基酸、优选至少50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、165个、170个、175个、180或185个邻接氨基酸的氨基酸序列。

在一个实施方案中，sTREM1对应于通过基质金属肽酶、优选基质金属肽酶9(MMP9)对TREM1序列SEQ ID NO:1的切割生成的细胞外片段。

本发明的一个目标涉及用于鉴别处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因死亡的风险的受试者的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平，由此确定所述受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。

本发明的另一目标是用于评估受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因死亡的风险的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平，由此确定所述受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。

本发明的另一目标是用于预测受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因死亡的风险的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平，由此确定所述受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。

本发明的另一目标是用于对处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因死亡的风险的受试者分级的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平，由此确定所述受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。

本发明的另一目标是用于评估受试者中的心血管事件或心血管疾病的严重程度的方法，该方法包括测量来自所述受试者的样品中的sTREM-1的水平，由此确定所述受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。

根据本发明，全因死亡是指在心血管事件或心血管疾病之后(如例如，在第一次心血管事件或心血管疾病之后)发生的死亡。

在一个实施方案中，本发明的方法用于鉴别处于与心血管事件或心血管疾病相关或由心血管事件或心血管疾病引起的死亡的风险的受试者。

在一个实施方案中，本发明的方法用于评估受试者是否处于与心血管事件或心血管疾病相关或由心血管事件或心血管疾病引起的死亡的风险。

在一个实施方案中，本发明的方法用于预测受试者是否处于与心血管事件或心血管疾病相关或由心血管事件或心血管疾病引起的死亡的风险。

在一个实施方案中，本发明的方法用于对处于与心血管事件或心血管疾病相关或由心血管事件或心血管疾病引起的死亡的风险的受试者分级。

在本发明的一个实施方案中，所述受试者可以是基本上健康的受试者，这意味着所述受试者先前尚未被诊断或鉴别为具有或罹患心血管疾病，或尚未发生心血管事件。

在另一实施方案中，所述受试者还可以是无心血管疾病的症状的受试者。如本文所用，"无症状"受试者是指未展现心血管疾病或心血管事件的惯常症状的受试者，惯常症状包括但不限于CAD的胸痛和呼吸短促、PAD的跛行以及CVD的TIAS、MCI和剧烈头痛。

在本发明的另一实施方案中，所述受试者可以是处于具有或发生心血管疾病或心血管事件的风险的受试者，如通过如例如以下临床指标所定义：年龄、性别、LDL浓度、HDL浓度、甘油三酯浓度、血压、体重指数、CRP浓度、冠状动脉钙评分、腰围、吸烟情况、心血管疾病既往史、心血管疾病家族史、心率、空腹胰岛素浓度、空腹葡萄糖浓度、糖尿病状态和高血压药物的使用。

在本发明的另一实施方案中，所述受试者可以是先前已被诊断或鉴别为心血管疾病或心血管事件的受试者，所述心血管疾病或心血管事件如例如无心肌坏死的慢性缺血性病症(例如稳定型或劳力型心绞痛)、无心肌坏死的急性缺血性病症(例如不稳定型心绞痛)、有心肌坏死的缺血性病症(例如ST段升高心肌梗塞或非ST段升高心肌梗塞)。

组织缺血经常以相关术语被定义且发生在氧的需要超过氧到组织的递送时。在组织(例如心肌组织)氧需求与供应之间存在失衡。这种缺氧条件可伴有因灌注减少所致的代谢物的不充分去除。心肌缺血可在临床上(例如胸痛)、在生物学上(例如髓过氧化物酶活性增加)、在代谢上、使用闪烁扫描术、通过分析局部室壁运动障碍或通过使用心电图(ST段的典型改变、ST段偏移向上或向下、T波的典型变化如T波倒置或陡形对称或高振幅的正T波)来诊断。无症状性缺血通常使用闪烁扫描术或24h心电图记录来诊断。

稳定型和劳力型心绞痛通常通过锻炼期间的胸痛来证明且在休息时缓慢恢复。它通常反映锻炼期间的组织缺血。

不稳定型心绞痛是稳定型心绞痛的频率和/或严重程度的最近增加、初发心绞痛或休息时心绞痛。

心肌坏死通常通过循环血液中的心肌酶(例如肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、CPK)的增加来诊断。

在本发明的另一实施方案中，所述受试者可以是显示心血管风险因素由于针对心血管疾病的治疗和/或疗法而得以改善的受试者。此类改善包括体重指数的降低、总胆固醇的降低、LDL水平的降低、HDLC水平的增加、收缩压和/或舒张压的降低或其它上述风险因素或其组合。

在本发明的一个实施方案中，尚未在所述受试者中诊断出缺血性症状的发作。心肌缺血可在临床上(例如胸痛)、在生物学上(例如髓过氧化物酶活性增加)、在代谢上、使用闪烁扫描术、通过分析局部室壁运动障碍或通过使用心电图(ST段的典型改变、ST段偏移向上或向下、T波的典型变化如T波倒置或陡形对称或高振幅的正T波)来诊断。

在另一实施方案中，已在所述受试者中诊断出缺血性症状的发作。

在本发明的一个实施方案中，用于测量sTREM-1水平的样品是血样、全血样品、血浆样品、血清样品或尿液样品。

如本文所用的术语“水平”是指sTREM-1的表达水平。其或者可指sTREM-1的转录水平或sTREM-1的翻译。所述表达水平可在细胞内或细胞外检测。用于测量sTREM-1的水平的方法是本领域技术人员众所周知的且包括但不限于RT-PCR、RT-qPCR、Northern印迹、杂交技术(如例如，微阵列的使用)和其组合(包括但不限于通过RT-PCR获得的扩增子的杂交)、测序(如例如下一代DNA测序(NGS)或RNA-seq(还被称为“全转录物组鸟枪法测序”)等)、免疫组织化学、多重法(Luminex)、western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心ELISA、荧光结合免疫吸附测定(FLISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、流式细胞术(FACS)等。

在本发明的一个实施方案中，将sTREM-1水平与参考值进行比较。

在一个实施方案中，所述参考值可以是指数值或可以得自心血管疾病和/或心血管事件的一种或多种风险预测算法或计算指数。参考值可涉及得自包括但不限于以下的群体研究的数值或值：具有类似体重指数、总胆固醇水平、LDL/HDL水平、收缩压或舒张压的此类受试者、相同或类似年龄范围的受试者、相同或类似民族的受试者、具有动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成或CAD、PAD或CVD家族史的受试者，或涉及经历动脉血管疾病(如动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、CAD、PAD或CVD)的治疗的受试者的起始样品。

此类参考值可得自从动脉血管疾病的数学算法和计算指数获得的群体的统计分析和/或风险预测数据，尤其例如但不限于Framingham Study,NCEP/ATP III中所报道的算法。心血管风险因素参考值还可使用统计和结构分类的算法和其它方法构建和使用。

在一个实施方案中，参考值是个人化参考值，即使用从所述受试者获得的样品确定参考值。

在本发明的一个实施方案中，参考值得自源于如上文所定义的基本上健康的一个或多个受试者的对照样品中的sTREM-1。基本上健康的此类受试者没有心血管疾病的传统风险因素：例如，那些受试者具有小于200mg/dl的血清胆固醇水平、小于或等于120mm Hg的收缩压、小于或等于80mm Hg的舒张压、为非当前吸烟者、无诊断的糖尿病史、无先前诊断的急性冠脉综合征或高血压以及上述其它风险因素，或可通过本领域内已知的心血管疾病的另一侵袭性或非侵袭性诊断测试来验证，例如但不限于心电图(ECG)、颈动脉B-模式超声(用于测量内膜中层厚度)、电子束计算机断层摄影术(EBCT)、冠状动脉钙评分、多层高分辨率计算机断层摄影术、核磁共振、应力运动测试、血管造影术、血管内超声(IVUS)、其它衬度成像和/或放射性同位素成像技术或其它激发测试技术。

在另一实施方案中，在此类测试后监测和/或定期重复测试此类受试者的诊断相关时期("纵向研究")以验证心血管疾病或急性心血管事件的连续不存在(无疾病或事件存活)。该时期可以是从确定参考值的初始测试日期起1年、2年、2到5年、5年、5到10年、10年、或10年或更多年。此外，假定受试者已在介入时期期间通过产品权利要求的预期范围被适当地回访，则适当库存的历史受试者样品中的sTREM-1水平的追溯测量可用于确定这些参考值，由此缩短所需研究时间。

在另一实施方案中，参考值还可得自来源于一个或多个受试者的样品中的sTREM-1水平，所述受试者先前已通过以上的侵袭性或非侵袭性技术之一诊断或鉴别为心血管疾病或心血管事件，或处于发生心血管事件的高风险，或处于发生动脉粥样硬化或动脉粥样化血栓形成斑块破裂的高风险，或已遭受心血管事件或斑块破裂。

在本发明的另一实施方案中，参考值还可得自来源于一个或多个受试者的样品中的sTREM-1水平，所述受试者显示心血管风险因素由于针对心血管疾病的治疗和/或疗法而得以改善。此类改善包括体重指数的降低、总胆固醇的降低、LDL水平的降低、HDLC水平的增加、收缩压和/或舒张压的降低或其它上述风险因素或其组合。

在本发明的另一实施方案中，参考值还可得自来源于一个或多个受试者的样品中的sTREM-1水平，所述受试者未显示心血管风险因素由于针对心血管疾病的治疗和/或疗法而得以改善。此类改善包括体重指数的降低、总胆固醇的降低、LDL水平的降低、HDLC水平的增加、收缩压和/或舒张压的降低或其它上述风险因素或其组合。

在本发明的一个实施方案中，参考值是指数值或基线值。指数值或基线值得自不具有心血管疾病(如动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、CAD、PAD或CVD)的一个或多个受试者或无心血管疾病的症状的受试者。基线值还可得自已显示心血管风险因素的改善(由于心血管治疗或疗法所致)的受试者。此类改善包括但不限于体重指数的降低、总胆固醇的降低、LDL水平的降低、HDLC水平的增加、收缩压和/或舒张压的降低或其组合。

在本发明的一个实施方案中，该心血管事件或心血管疾病是代谢综合征、X综合征、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、冠状动脉疾病、稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛、中风、主动脉和其分支的疾病(如主动脉血栓形成或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病和任何短暂或永久缺血性动脉血管事件。

在本发明的一个实施方案中，该心血管事件或心血管疾病是心肌梗塞。

在本发明的另一实施方案中，该心血管事件或心血管疾病是动脉粥样硬化。

在一个实施方案中，当在血样中测量的sTREM-1的水平等于或大于265pg/ml、270pg/ml、275pg/ml、280pg/ml、285pg/ml、290pg/ml、295pg/ml、300pg/ml、305pg/ml、310pg/ml、315pg/ml、320pg/ml、325pg/ml、330pg/ml、335pg/ml、340pg/ml、345pg/ml、350pg/ml、360pg/ml、370pg/ml、380pg/ml、390pg/ml或400pg/ml时，将受试者鉴别为处于与心血管事件或心血管疾病相关或由心血管事件或心血管疾病引起的死亡的风险。

在一个实施方案中，选择被鉴别为具有心血管疾病或心血管事件或处于发生心血管疾病或心血管事件的增加风险的受试者接受治疗方案以减缓心血管疾病的进展，或减少或预防发生心血管疾病或心血管事件的风险。

根据本发明，如上文所述的方法用于监测需要其的受试者中的心血管疾病或心血管事件。

在本发明的一个实施方案中，如上文所述的方法用于评估需要其的受试者中的心血管疾病的进展。

在本发明的另一实施方案中，如上文所述的方法用于监测对于心血管疾病的治疗的有效性。所述治疗的功效将通过sTREM-1水平的变化来反映。如果治疗具有期望效果，则sTREM-1水平将低于在治疗之前获得的sTREM-1水平。另一方面，如果治疗没有期望效果，则sTREM-1水平将保持为高。在一个实施方案中，在所述治疗开始之前或开始时获得的sTREM-1水平是参考值。

因此，从业医师将能够调适所述治疗(剂量、方案)以将sTREM-1水平降低到其基线水平或从健康受试者获得的水平。

针对心血管疾病的治疗的示例包括但不限于阿司匹林、氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、低分子量肝素、未分级的肝素、磺达肝素(fondaparinux)、比伐卢定(bivalirudin)、他汀(statin)、β-阻滞剂、ACE-I或ARB等。

在一个实施方案中，针对心血管疾病的治疗基于TREM-1功能、活性或表达的调节。TREM-1的功能、活性或表达的调节剂的示例包括但不限于针对TREM-1和/或sTREM-1或TREM-1和/或sTREM-1配体的抗体；抑制TREM-1的功能、活性或表达的小分子；抑制TREM-1的功能、活性或表达的肽；针对TREM-1的siRNA；针对TREM-1的shRNA；针对TREM-1的反义寡核苷酸；针对TREM-1的核酶或TREM-1的适体。

在一个实施方案中，针对心血管疾病的治疗是用靶向sTREM-1配体的肽如例如LR12(SEQ ID NO:4)进行的治疗。

在本发明的另一实施方案中，如上文所述的方法用于选择用于被诊断有心血管疾病或心血管事件或处于心血管疾病或心血管事件的风险的受试者的治疗方案。

因此，测量在所述疗法之前获得的样品中的sTREM-1水平(该水平构成参考值)和在所述疗法期间获得的至少一个另一样品中的sTREM-1水平。sTREM-1水平的降低则指示所述疗法对所述受试者的正面效应。相反，类似水平或增加水平的sTREM-1指示所述疗法的非有效性。在本发明的一个实施方案中，在所述疗法之前且在疗法期间的每个月、在至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长期间或在至少1年、2年、3年或更长期间从所述患者获得样品。

在另一实施方案中，可测量在疗法开始时获得的样品中的sTREM-1水平(该水平构成参考值)和在所述疗法期间获得的至少一个另一样品中的sTREM-1水平。在本发明的一个实施方案中，在所述疗法开始时且在疗法期间的每个月、在至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长期间或在至少1年、2年、3年或更长期间从所述患者获得样品。在一个实施方案中，所述疗法的开始对应于首次施用所述治疗的那天。

本发明的另一目标是用于鉴别受试者是否具有心血管疾病和/或心血管事件或处于具有或发生心血管疾病和/或心血管事件的风险的试剂盒，其包含用于测量sTREM-1水平的手段。

在一个实施方案中，该用于测量sTREM-1水平的手段是抗体，如多克隆抗体或单克隆抗体。

允许检测sTREM-1的抗体的示例包括但不限于针对人TREM-1的Met1-Arg200氨基酸而产生的多克隆抗体，参考来自R&D Systems的AF1278；和针对人TREM-1的Ala21-Asn205而产生的单克隆抗体，参考来自R&D Systems的MAB1278。允许检测sTREM-1的抗体的其它非限制性示例包括描述于以下专利或专利申请中的sTREM-1和/或TREM-1抗体：US2013/150559、US 2013/211050、US 2013/309239、WO2013/120553和US8,106,165。

在一个实施方案中，该用于测量sTREM-1水平的手段是酶联免疫吸附测定(ELISA)。

ELISA测定的示例包括但不限于来自R&D Systems的TREM-1Quantikine ELISA试剂盒；人TREM-1DuoSet，参考来自R&DSystems的DY1278B和DY1278BE，sTREM-1ELISA，参考来自iQProducts的sTREM-1ELISA。

因此，本发明涉及用于鉴别处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因死亡的风险的受试者、或用于评估受试者是否处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因死亡的风险的体外方法，该方法包括以下步骤：

i)测量从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

ii)比较步骤i)测量的水平与参考值，其中差异指示具有或发生心血管事件或心血管疾病或全因死亡的风险。

因此，本发明涉及用于预测受试者中的心血管事件或心血管疾病的风险的体外方法，该方法包括以下步骤：

i)测量从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

ii)比较步骤i)测量的水平与参考值，其中差异指示具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。

因此，本发明涉及用于对处于具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险或处于全因死亡风险的受试者分级、或用于评估受试者中的心血管事件或心血管疾病的严重程度的体外方法，该方法包括以下步骤：

i)测量从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

ii)比较步骤i)测量的水平与参考值，其中差异指示具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险、优选严重风险。

在本发明的一个实施方案中，当与参考值比较时，测试样品中的sTREM-1的更高水平指示具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。在一个实施方案中，测试样品中的sTREM-1的水平相比于参考值高于或等于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高指示具有或发生心血管事件或心血管疾病的风险。

在本发明的一个实施方案中，当与参考值比较时，测试样品中的sTREM-1的更高水平指示具有或发生心血管事件或心血管疾病的严重风险。在一个实施方案中，测试样品中的sTREM-1的水平相比于参考值高于或等于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高指示具有或发生心血管事件或心血管疾病的严重风险。

因此，本发明涉及用于监测受试者中的针对心血管疾病的治疗的有效性的体外方法，该方法包括以下步骤：

i)测量从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

ii)比较步骤i)测量的水平与参考值，其中差异指示所述治疗的期望作用效应。

在一个实施方案中，本发明的监测方法包括：

i)测量在疗法之前从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

ii)测量在疗法期间、优选在疗法期间的每个月、在至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长期间或在至少1年、2年、3年或更长期间从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

iii)比较步骤ii)测量的水平与步骤i)测量的sTREM-1水平，其中sTREM-1水平的降低指示所述疗法对所述受试者的正面效应。

在另一实施方案中，本发明的监测方法包括：

i)测量在疗法开始时、优选在首次施用所述治疗的那天从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

ii)测量在疗法期间、优选在疗法期间的每个月、在至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长期间或在至少1年、2年、3年或更长期间从该受试者获得的样品中的sTREM-1的水平，

iii)比较步骤ii)测量的水平与步骤i)测量的sTREM-1水平，其中sTREM-1水平的降低指示所述疗法对所述受试者的正面效应。

在一个实施方案中，测试样品中的sTREM-1的水平相比于在所述疗法开始之前或开始时测量的sTREM-1水平低于或等于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高指示所述疗法对所述受试者的正面效应。

在一个实施方案中，参考值是约或至少80pg/mL、100pg/mL、或约或至少约150pg/mL、200pg/mL、210pg/mL、220pg/mL、230pg/mL、240pg/mL、250pg/mL、260pg/mL、270pg/mL、280pg/mL、290pg/mL、300pg/mL、310pg/mL、320pg/mL、330pg/mL、340pg/mL、350pg/mL、360pg/mL、370pg/mL、380pg/mL、390pg/mL、400pg/mL、410pg/mL、420pg/mL、430pg/mL、440pg/mL、450pg/mL、460pg/mL、470pg/mL、480pg/mL、490pg/mL、500pg/mL、520pg/mL、540pg/mL、560pg/mL、580pg/mL、600pg/mL、620pg/mL、640pg/mL、660pg/mL、680pg/mL、700pg/mL或更高。

在一个实施方案中，用于获得参考值的参考群体中测量的sTREM-1水平以百分位数被分类，其中通过参考群体的所有受试者获得的sTREM-1水平值根据其数值以上升顺序被排列。在本发明的一个实施方案中，百分位数是受试者百分位数，即各百分位数包含相同数目的受试者。因此，第一百分位数对应于具有最低sTREM-1水平的受试者，而最后一个百分位数对应于具有最高sTREM-1水平的受试者。

在一个实施方案中，参考值对应于参考群体的第一百分位数的最高sTREM-1水平。

在另一实施方案中，参考值对应于参考群体的第二百分位数、第三百分位数……或倒数第二百分位数的最高sTREM-1水平。

在一个实施方案中，当绘出三个百分位数时，各百分位数被称为三分位数。根据这一实施方案，参考值对应于第一三分位数或第二三分位数的最高sTREM-1水平。

在另一实施方案中，当绘出四个百分位数时，各百分位数被称为四分位数。根据这一实施方案，参考值对应于第一四分位数、第二四分位数或第三四分位数的最高sTREM-1水平。

根据本发明，sTREM-1的水平可通过本领域内任何已知的方法测量。

通常，所述方法可包括使样品与能够与样品中的sTREM-1选择性地相互作用的结合配偶体接触。在一些方面，结合配偶体是抗体，如例如单克隆抗体或适体。

上述测定通常涉及配偶体(即抗体或适体)与固体载体的结合。可用于实施本发明的固体载体包括但不限于基底，如硝化纤维素(例如，以膜或微量滴定孔的形式)；聚氯乙烯(例如，片或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化纸(diazotized paper)；尼龙膜；活化珠、磁反应性珠(magnetically responsive bead)等。

sTREM-1的水平可通过使用标准的免疫诊断技术来测量，标准的免疫诊断技术包括免疫测定，如竞争法、直接反应或夹心型测定。此类测定包括但不限于凝集测试；酶标记和介导的免疫测定，如ELISA；生物素/抗生物素蛋白型测定；放射免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀。

用于鉴别特定蛋白质的示例性生物化学测试采用标准化的测试格式，如ELISA测试，虽然本文提供的信息可适用于开发其它生物化学或诊断测试且不限于开发ELISA测试(关于ELISA测试的说明，参见例如Molecular Immunology:A Textbook，Atassi等人编辑，Marcel Dekker公司，New York and Basel 1984)。应理解，可利用用于各种血浆组分的酶联免疫吸附测定(ELISA)商购测定试剂盒。因此可使用ELISA方法，其中用识别sTREM-1的一组抗体涂覆微量滴定板的孔。然后将含有或怀疑含有sTREM-1的样品添加到被涂覆的孔中。在孵育足够的时间以使得形成抗体-抗原复合物后，可洗涤所述板以去除未结合的部分并添加可检测地标记的二级结合分子。使二级结合分子与任何捕获的样品标志物蛋白质反应，洗涤板并使用本领域众所周知的方法检测二级结合分子的存在。

测量sTREM-1的水平(使用或未使用基于免疫测定的方法)也可以包括化合物的分离：基于化合物的分子量的离心；基于质量和电荷的电泳；基于疏水性的HPLC；基于大小的尺寸排阻色谱；和基于化合物对所用的特定固相的亲和力的固相亲和力。一旦分离，所述化合物可基于该化合物已知的“分离特性”(例如保留时间)进行鉴别并使用标准技术进行测量。

或者，分离的化合物可通过例如质谱进行检测和测量。

通常，可通过基于双抗体"夹心"技术的免疫测定、利用对sTREM-1具有特异性的单克隆抗体测量样品中的sTREM-1水平。

本发明的另一目标是sTREM-1作为用于诊断心血管事件或心血管疾病的生物标志物的用途。

本发明的另一目标是sTREM-1作为用于监测心血管疾病的生物标志物的用途。

附图说明

图1是代表FAST-MI-2005群组中在心肌梗塞后的可溶性TREM-1的血浆浓度和心血管结局的图。

图2是代表FAST-MI-2005群组中的经调节模型中的sTREM-1水平ROC曲线下面积(AUC)的图。

图3是代表FAST-MI-2010群组中在心肌梗塞后的可溶性TREM-1的血浆浓度和死亡的图。

图4是代表心脏缺血事件后和动脉粥样硬化小鼠中的血浆sTREM-1水平的直方图的组合。

(A)使成年雄性Balb/c小鼠(20-23g)经受心肌缺血并随机分组(n＝10只/组)以经腹膜内注射接受重复性LR12(100μg溶于0.2mL 0.9％NaCl中，每天一次，持续5天)或乱序-LR12(100μg溶于0.2mL 0.9％NaCl中，每天一次，持续5天)。在心脏缺血事件之后24小时、72小时和168小时获得血样以测量血浆sTREM-1水平。从健康动物中的剂量计算生理学基线。每组和每个时间点的N＝10只。

(B)将动脉粥样硬化小鼠随机分组以经腹膜内注射接受LR12(100μg溶于0.2mL0.9％NaCl中，每天一次，持续4周)或乱序-LR12(100μg溶于0.2mL 0.9％NaCl中，每天一次，持续4周)。在治疗结束(4周)时获得血样以评估sTREM-1血浆浓度。从健康动物中的剂量计算生理学基线。N＝10只/组。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。

方法

研究群体1

法国急性ST-升高和非-ST-升高心肌梗塞注册(French registry of Acute ST-elevation and non-ST-elevation Myocardial Infarction)(FAST-MI)的群体和方法已被详细地描述于先前的出版物(Cambou,J.-P等人，2007.Arch.Mal.Coeur Vaiss.100:524-534,Simon,T.等人，2009.N.Engl.J.Med.360:363-375.)中。简单地说，如果年龄>18岁的所有受试者具有为肌酸激酶、肌酸激酶-MB或升高的肌钙蛋白的正常上限两倍的心肌坏死血清标志物的升高，以及与急性MI一致的症状和/或至少两个邻接导联上有病理Q波(>0.04sec)和/或持续性ST升高或下降>0.1mV的心电图变化，则将他们纳入注册中。从症状发作到重症监护室入住的时间必须<48h。根据惯例管理受试者；参与注册不影响治疗。在法国当时治疗患有急性MI的受试者的374个中心中，223个(60％)参与注册且募集3670位患者。在这些当中，100个中心募集1061位捐献血清库的患者。

他们的基线特征与注册的总群体相当。超过99％的受试者是高加索人。通过与受试者的医师、受试者本身或他们的家庭以及他们出生地的注册处联系来收集随访。1年随访完成>99％。该研究由圣安东尼大学医院的生物医学研究中的人受试者保护委员会(Committee for the Protection of Human Subjects in Biomedical Research ofSaint Antoine University Hospital)审查且数据文件被呈报给国家信息和自由委员会(Commission Nationale Informatique et Libertés)。

研究群体2

这里使用命名为FAST-MI-2010的第二确认研究。该群组已被详细地描述于先前的出版物(Hanssen M等人，Heart.2012年5月；98(9):699-705)中。简单地说，如果年龄>18岁的所有受试者具有心肌坏死血清标志物(肌钙蛋白或肌酸激酶MB)的升高，以及以下中的至少一种：与心肌缺血一致的症状、产生新的异常Q波、与心肌缺血一致的ST-T变化(ST段升高或下降、T波倒置)，则将他们纳入注册中。从症状发作到重症监护室入住的时间必须<48h。根据惯例管理受试者；参与注册不影响治疗。213个中心(占当时治疗AMI患者的中心的76％)参与注册且募集4169位患者，于2010年10月1日开始纳入。设立FAST-MI 2010以进行新的调查，目的与2005注册类似。1年随访完成>99％。

取血样和测量

在入住到重症监护室时(从症状发作<48h)回收用于该研究的血样。血样储存在-80℃。仅通过数目鉴别所有样品且以随机顺序分析。通过ELISA(TREM-1Duo-Set,RnDsystems)使用46.9pg/mL的检测极限确定sTREM-1的血清浓度。在第一群组(FAST-MI-2005)中，在捐献血库的1061位受试者中，获得1015位受试者(缺失测量)的sTREM-1水平的结果。在第二群组FAST-MI-2010中，获得1293位受试者的sTREM-1水平的结果。

通过ELISA(小鼠TREM-1Quantikine ELISA试剂盒，RnDsystems)使用31.3pg/mL的检测极限确定小鼠sTREM-1血清水平。

统计学分析

结局事件被定义为2年随访时期期间的全因死亡或非致死性MI。主要终点(被定义为纳入时的发作指数(episode index)的全因死亡和非致死性MI的一种复合情形)由其成员不了解患者的用药和血液测量结果的委员会裁定。连续变量被描述为平均值±SD且分类变量被描述为频率和百分比。在被用作连续变量前，对sTREM-1和C-反应蛋白质的血浆水平进行对数变换以去除正偏态。如预先所规定的，使用用于离散变量的χ2或费希尔精确检验(Fisher's exact test)并且通过用于连续变量的威氏符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)或克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)在sTREM-1水平的三分位数内比较住院期间的基线人口统计学和临床特征、治疗因素以及治疗管理。基于整个样品的数据构建sTREM-1水平的三分位数。

使用卡普兰-梅尔估计量(Kaplan–Meier estimator)估计根据sTREM-1三分位数的存活曲线。

我们使用多变量Cox比例危险模型来评估在2年随访时期期间具有主要终点的变量的独立预后值。多变量模型包括性别、年龄、先前或现时吸烟、体重指数、冠状动脉疾病家族史、高血压史、陈旧性急性MI、心力衰竭、肾衰竭、慢性阻塞性肺病、糖尿病、入住时的心率、Killip分级、左心室射血分数、医院管理(包括再灌注疗法、他汀、β-阻滞剂、氯吡格雷、利尿剂、毛地黄、肝素)和log C-反应蛋白质水平。结果表示为具有95％置信区间(CI)的Cox模型的危险比。通过接受者操作特征(receiver-operated characteristic)(ROC)曲线分析在与sTREM-1水平s有关的随访期间心血管结局的敏感度对假阳性频率(1-特异度)。使用下式计算sTREM-1水平的约登指数(Youden index)：敏感度+特异度–1；约登指数的最大值对应于最佳截止点(Youden WJ.Cancer.1950；3:32-35)。

所有统计测试均为双侧的且使用SAS软件9.3版进行。

肽

LR12是已知特异性靶向TREM-1配体的12氨基酸肽(LQEEDTGEYGCV,SEQ ID NO:4)。它被化学合成(Pepscan Presto BV,Lelystad,The Netherland)为用于体内测定的Cter酰胺化肽。以>95％产率获得正确肽且其在制备型纯化后为均质的，如通过质谱法和分析型反相高效液相色谱法所确认。这些肽不含内毒素。相应的乱序肽被类似地合成且充当对照肽(乱序-LR12，由与LR12相同但呈随机化序列的氨基酸构成，已知其未展示TREM-1抑制性质)。

动物

所有程序均得到实验室动物护理和使用地方委员会(local committee for careand use for laboratory animal)批准且根据关于动物实验的国际准则进行。从CharlesRiver(Strasbourg,France)获得小鼠和大鼠。

心肌梗塞的小鼠模型

对年龄范围在6-8周的雄性C57BL/C小鼠进行所有程序。通过腹膜内注射赛拉嗪(xylazine)(60mg/kg)将小鼠麻醉且以仰卧位固定。将气管插管并通气(潮气量是200μl/25g且呼吸速率是120次呼吸/min)。在左侧胸廓切开术后，鉴别左冠状动脉并在离左心耳顶端1.0mm远端处用8-0聚丙烯纺织纤维外科缝线结扎。通过缺血区域(左心室)中的心肌颜色从红色变为白色来确认LAD闭塞。关闭胸部并用6-0丝缝合皮肤。使动物返回其笼中，在笼中监视它们直到它们完全恢复。

将小鼠随机分组以接受或不接受肽(每天腹膜内注射，持续5天，5mg/kg)且在24h、72h、168h(n＝6只/组)后通过用过剂量的戊巴比妥钠(pentobarbital sodium)麻醉加以处死用于取血样。

小鼠中的动脉粥样硬化

使12周和24周龄雄性ApoE-/-小鼠以脂肪(15％脂质、1.25％胆固醇，无胆酸盐)或饲料(chow diet)为食且通过每天腹膜内注射肽(100μg/天)加以治疗。在4周治疗后，将小鼠处死用于取血样。

结果1

我们的目的是评估在急性心肌梗塞后48小时内登记法国急性ST升高或非-ST-升高心肌梗塞注册(FAST-MI,NCT00673036)的患者中的可溶性TREM-1水平与心血管结局之间的关系。sTREM-1的血清水平与1年和2年的全因死亡和复发性MI的风险有关，高水平的sTREM-1指示更坏的结局。在登记的1015位患者中，183位患者(18％)在2年随访时期期间死亡或具有MI。

在随访期间死亡或具有MI的患者比无结局事件的那些年长(75±12岁对64±13岁)，女性的比例更高(42％对27％)。他们还具有更高比率的高血压、糖尿病、既往心力衰竭、既往MI、既往中风或短暂性缺血事件、慢性肾衰竭和慢性阻塞性肺病。

他们相比于在随访期间无结局事件的患者不太可能依赖于他汀疗法(68％对81％)、β-阻滞剂(50％对76％)、氯吡格雷、肝素，而是更可能依赖于利尿剂或地高辛。具有事件的患者根据GRACE(全球急性冠状动脉事件注册(Global Registry of AcuteCoronary Events))风险评分处于医院死亡的更高风险且更少患者在住院期间经历了冠状动脉血管成形术PCI(43％对73％)或血栓溶解(9％对17％)。

根据其结局的患者的特征列于表1中。

通过威氏符号秩检验或克鲁斯凯-沃利斯检验(用于连续变量)和精确皮尔森(Pearson)x2或费希尔检验(对于分类变量)给出，平均值±sd。

ACE：血管紧张素转化酶抑制剂或ARB：血管紧张素受体阻滞剂，PCI：经皮冠状动脉血管成形术，CABG：冠状动脉旁路手术。

表1

根据sTREM-1三分位数的患者的特征列于表2中。

通过威氏符号秩检验或克鲁斯凯-沃利斯检验(用于连续变量)和精确皮尔森(Pearson)x2或费希尔检验(对于分类变量)给出，平均值±sd。

ACE：血管紧张素转化酶抑制剂或ARB：血管紧张素受体阻滞剂，PCI：经皮冠状动脉血管成形术，CABG：冠状动脉旁路手术。

表2

测量sTREM-1的水平(pg/ml)(表3)。

整个群体的sTREM-1的中值水平是273pg/mL(范围50–7069；第一三分位数<212.4pg/mL，n＝339；第三三分位数>354pg/mL，n＝339)。

表3

结局事件随基线sTREM-1水平而变化的概率呈现于图1中。

1年时，死亡和MI的事件率对于第一三分位数是6％、对于第二三分位数是9％和对于第三三分位数是24％。

2年时，死亡和MI的事件率对于第一三分位数是9％、对于第二三分位数是14％和对于第三三分位数是31％。

在2年随访期间与1单位pg/mL的log(sTREM-1)的增加有关的死亡和复发性MI的经调节的HR是1.70(95％CI 1.33-2.17；p<0.0001)。

我们还测试了随sTREM-1的三分位数的趋势以在sTREM-1水平的更宽范围内检查关联性。相比于被选择作为参考的三分位数1，三分位数2和三分位数3的经调节的HR分别是1.38(95％CI 0.83-2.28)和2.08(95％CI 1.28-3.39)(总体p＝0.006)。科克伦-阿米蒂奇趋势检验(Cochran-Armitage trend test)是显著的(p<0.0001)。

精确预测2年随访后的心血管结局的经调节模型中的sTREM-1水平的ROC曲线下面积(AUC)是0.847(图2)。

考虑到更高的敏感度值与更低的(1-特异度)值的组合，使用约登指数的sTREM-1水平的最佳截止值是343pg/mL(敏感度＝0.61且特异度＝0.70)。

结果2

利用第二群组FAST-MI-2010确认第一群组FAST-MI-2005的结果。设立FAST-MI2010以进行新的调查，准则和目的与2005注册类似。在该群组中，sTREM-1水平与急性心肌梗塞后1年时的全因死亡的风险有关。

根据sTREM-1三分位数的患者的特征列于表4和表5中。sTREM-1的范围是112pg/mL到7038pg/mL，第一三分位数<264.552pg/mL n＝430，第三三分位数>444.287pg/mL n＝432)。

全因死亡随基线sTREM-1水平而变化的概率呈现于图3中。在1年随访期间与1单位pg/mL的log(sTREM-1)的增加有关的死亡的经调节的HR是3.784(95％CI 2.440-5.869；p<0.0001)。

相比于被选择作为参考的三分位数1，三分位数2和三分位数3的经调节的HR分别是2.996(95％CI 0.631-14.220)和9.375(95％CI 2.147–40.936)(总体p＝0.0005)。科克伦-阿米蒂奇趋势检验是显著的(p<0.0001)。

表4

通过威氏符号秩检验或克鲁斯凯-沃利斯检验(用于连续变量)和精确皮尔森x²或费希尔检验(对于分类变量)给出，平均值±sd。

ACE：血管紧张素转化酶抑制剂或ARB：血管紧张素受体阻滞剂，PCI：经皮冠状动脉血管成形术，CABG：冠状动脉旁路手术。

表5

结果3

我们的第二目的是评估治疗是否可影响sTREM-1的血浆水平。通过靶向TREM-1配体的LR12肽或对照肽乱序-LR12治疗动脉粥样硬化小鼠(接受脂肪饮食的24周龄ApoE-/-小鼠)。我们证明sTREM-1水平在治疗4周后升高(311.8pg/mL)且LR12治疗与sTREM-1血浆浓度的降低(189.8pg/mL)关联(图4B)。

我们还在梗塞小鼠中证明，在缺血性事件后24小时和72小时通过LR12治疗降低了sTREM-1水平(图4A)。

由于LR12施用与心肌缺血事件后以及在动脉粥样硬化期间的更好结局关联(数据未显示)，因此这些结果表明sTREM-1的剂量可与治疗组合用于评价所述疾病的进展。

Claims (13)

1.用于测量来自受试者的样品中的可溶性髓系细胞表达的触发受体1(sTREM-1)水平的试剂在制备用于预测受试者中复发性心肌梗塞的风险或在心肌梗塞之后发生全因死亡的风险的试剂或试剂盒中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述sTREM-1水平被与参考值比较。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述参考值得自源于健康的一个或多个受试者的对照样品中的sTREM-1水平。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其中高于所述参考值的sTREM-1水平指示复发性心肌梗塞的风险或在心肌梗塞之后发生全因死亡的风险。

5.用于测量来自受试者的样品中的可溶性髓系细胞表达的触发受体1(sTREM-1)水平的试剂在制备用于监测向正遭受或已遭受心肌梗塞的受试者施用的疗法的有效性的试剂或试剂盒中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述sTREM-1水平被与所述受试者的个人化参考值比较。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述受试者的所述个人化参考值是在所述疗法开始之前或开始时从所述受试者获得的样品中测量的sTREM-1的水平。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的用途，其中所述疗法基于TREM-1功能、活性或表达的调节。

9.根据权利要求8所述的用途，其中TREM-1功能、活性或表达的调节剂是靶向sTREM-1配体的肽。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述靶向sTREM-1配体的肽是具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽。

11.根据权利要求1-3、5-7和9-10中任一项所述的用途，其中所述样品是血样。

12.根据权利要求4所述的用途，其中所述样品是血样。

13.根据权利要求8所述的用途，其中所述样品是血样。