KR102266302B1 - 심혈관 질환 또는 문제 위험 예측용 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시료 중 sTREM-1을 측정함으로써 대상체의 심혈관 문제 또는 질환을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

심혈관 질환 또는 문제 위험 예측용 방법 및 키트 {METHODS AND KITS FOR PREDICTING THE RISK OF HAVING A CARDIOVASCULAR DISEASE OR EVENT}

본 발명은 시료 중 가용성 TREM-1의 수준을 측정함으로써 심혈관 문제를 갖는 대상체의 위험을 예측하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.

동맥경화는 서서히 진행하는 병변 형성 및 동맥의 내강 협착을 통하여 뇌혈관 질환 및 관상 동맥 질환을 일으킨다. 플라크 파열 및 혈전에 의하여, 이들 가장 흔한 형태의 심혈관 질환은 급성 관상동맥 증후군 (ACS), 심근 경색 또는 뇌졸중으로 나타난다. 인간과 동물에 대한 연구는 동맥경화가 주로 내생적으로 변형된 구조, 특히 선천적 및 후천적 면역 반응을 자극하는 산화 지질단백질에 반응하여 개시되는 동맥벽 내의 만성 염증 과정에 의하여 유발된다는 것을 밝혔다. 선천적 반응은 혈관 세포 및 단핵구/대식세포 양자 모두의 활성화에 의하여 유발, 이어서 후천적 면역 반응이 항원 제시 세포에 의하여 효과자 T 림프구에 제시되는 일련의 잠재적 항원에 대하여 진행된다 (Ait-Oufella, H. et al. 2011. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31: 969-979). 유전자 변형된 마우스 모델은 순환 단핵구가 케모카인에 의하여 혈관 벽에 소환된 후 대식세포 및 지질 적하된 거품세포가 된다고 교시하였다. 내막의 대식세포는 사이토카인 방출을 통하여 플라크 발생을 촉진하고, 단백질 분해효소 생성 및 아폽토시스 축적을 통하여 염증 증폭 및 플라크 불안정화를 촉진한다 (Libby, P. et al. 2011. Nature 473: 317-325). 단핵구/대식세포는 PRRs (Pathogen Recognition Receptors, 병원체 인식 수용체)과 상호작용하는 이름하여 PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns, 병원체 관련 분자 패턴)라는 몇몇 매개자에 의하여 자극된다. 몇몇 PRRs은 동맥경화의 생리병리학과 연관되어 있다. 예컨대, 톨-유사 수용체는 인간과 동물의 동맥경화 병변에서 발현된다.

심근경색 또는 뇌경색은 유해하고 손상을 주는, 영구적 또는 일시적 허혈의 결과인 복잡한 임상적 증후군을 예시한다. 이것은 보통 관상/대뇌 동맥 폐색에 의하여 야기되고, 산소 공급과 수요 사이의 불균형이라는 결과를 낳는다. 심근경색은 다단계 염증 반응과 연관된다. 초기 허혈은 괴사, 자유 라디칼 산소종의 형성, 보체 활성화 및 TNF-α 방출에 의하여 개시되는 사이토카인 캐스케이드를 유도한다. 경색 영역의 재관류 단계는 허혈 부위에서 백혈구가 모이는 원인인 염증 반응의 증가 및 가속화와 연관되어 있다. 소환된 백혈구들은 또한 그 위치에서 (in situ) 및 전신에서의 염증 매개자들의 방출에 참여하여, 경색의 병태생리학적 결과의 원인이 되는, 미세한 염증 반응으로부터 과활성화된 염증 반응을 선도한다.

요약하면, 선천적 면역, 특히 단핵구/대식세포 및 호중구가 동맥경화 및 허혈-이후 심장 조직 리모델링의 병태생리학에 중대한 역할을 한다는 것을 보여주는 커다란 증거가 있다. 심근경색 (MI)은 수 주 동안 혈액 순환 단핵구들의 높은 수준을 유도한다. 순환 단핵구들의 상승된 수준은 성장중인 동맥 병변으로의 소환에 이용되는 염증세포들의 제공원을 확장 제공하여, 잠재적으로 플라크 파열을 촉진한다. 실제로, MI 이후 백혈구 증가증은 재-경색 및 사망 위험 증가를 예견한다 (Swirski FK. And Nahrendorf M. 2013. Science. 339: 161-166., Sabatine, M. Set al. 2002. J. Am. Coll. Cardiol. 40: 1761-1768). 사실, MI는 멀리서 동맥경화 플라크의 염증을 증가시키고, 따라서 만성 동맥경화를 가속화하며, 선천적 면역 세포들은 이러한 현상에 추진력이 된다.

TREM-1 (Triggering Receptors Expressed on Myeloid cells-1, 골수세포-1에 대하여 발현되는 촉발 수용체)은 선천적 면역세포 (단핵구/대식세포 및 호중구)에 의하여 발현되는 면역수용체이다. TREM-1 활성화는 신속한 호중구 탈과립화 및 산화적 버스트와 함게 사이토카인 및 케모카인 생성을 야기한다 (TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1 및 -3, MIP-1α...) (Derive, M. et al. 2010. Self Nonself 1: 225-230, Derive, M. et al. 2012. J. Immunol. Baltim. Md 1950). TREM-1 기능은 큰 면역 반응을 촉발하기 위하여 PRRs (TLRs 포함)과의 시너지 작용에 의한 염증 활성화/개시보다는 그를 조절/증폭하는 것이다.

C-반응성 단백질 (CRP)은 심혈관 질환 진단 시험에 광범위하게 사용된다. 그러나, 이는 이 기술 분야에서 매우 특이적인 예후 지표로 인식되지는 않는다.

현재의 진단 과정들은 예컨대 어떠한 결과에 대한 위험에 있어서 개인을 식별하기에 완전히 만족스러운 것은 아니었다. 부정적인 심혈관계 결과를 평가 및 예측하기 위한, 특히 CAD 및 그 결과에 위험군인 사람들을 위하여, 비침습적이고, 감도 있는, 신뢰성 있는 것들을 비롯한, 관상 동맥 질환의 진단 및 예측 방법 및 시스템이 필요하다. 본 발명은 따라서, 심혈관계 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험이 있는 대상체를 식별하는 신규한 방법을 제공하려는 목적이 있다.

요약

본 발명의 한 가지 목적은 심혈관 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험 또는 모든 원인의 사망 위험의 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 심혈관 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험 또는 모든 원인의 사망 위험의 대상체를 계층화하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 대상체의 심혈관 문제 또는 질환의 중증도를 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 상기 sTREM-1 수준은 기준치와 비교된다.

일 구현예에 있어서, 상기 기준치보다 높은 sTREM-1 수준은 심혈관 문제 또는 질환에 걸리거나 발병할 위험, 또는 모든 원인의 사망 위험의 표지이다.

일 구현예에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료이다.

일 구현예에 있어서, 상기 심혈관 문제는 심근 경색이다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 심혈관 문제는 동맥경화이다.

본 발명의 또 다른 목적은 그를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 문제 또는 질환을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 심혈관 문제 또는 질환을 앓고 있거나 앓았던 대상체에게 투여된 치료법의 유효성을 모니터링하는 방법으로서, 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 상기 sTREM-1의 수준은 상기 대상체의 개인화된 기준치와 비교된다. 좋기로는, 상기 대상체의 개인화된 기준치는 상기 치료법 개시 전 또는 개시시 상기 대상체로부터 얻어진 시료에서 측정되느 sTRAM-1의 수준이다.

정의

본 발명에서, 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다:

"심혈관 문제"는 본 발명에서 "심장 문제", "급성 동맥혈관 문제" 또는 "동맥혈관 문제"라는 용어와 상호교환적으로 사용되고, 심장 돌연사, 급성 관상동맥 증후군, 예컨대 플라크 파열, 심근경색, 불안정 협심증, 및 비심장성 급성 동맥혈관 문제, 예컨대 다리의 혈전, 동맥류 또는 동맥류 진행, 뇌졸중 및 동맥혈관의 혈액 흐름 및 산소화가 일시적으로 또는 영구적으로 차단되는 기타 동맥혈관 허혈성 문제를 말하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 정의되는 "심혈관 질환" 또는 "동맥혈관 질환"은 심장, 심장 판막, 혈액 및 체혈관에 영향을 미치는 다수의 질병들을 분류하는데 사용되는 일반적인 용어이고, 심장 또는 혈관에 영향을 미치는 임의의 질환, 예컨대 대사 증후군, 증후군 X, 동맥경화증, 죽상혈전증, 관상 동맥 질환, 안정성 및 불안정성 협심증, 뇌졸중, 동맥 및 그 가지의 질환 (예컨대 대동맥 협착, 혈전증 또는 동맥류), 말초 동맥 질환, 말초 혈관 질환, 뇌혈관질환 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 예컨대, 제한없이 임의의 일시적 또는 영구적 허혈성 동맥혈관 문제를 포함한다. 본 발명에서 사용되는바 동맥혈관 질환은, 일반적으로 비허혈성 질환보다는 가장 흔하게는 허혈성 또는 전(前)허혈성 질환을 말하는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는바, "죽상동맥경화" 및 "죽상경화혈전증"은 내피세포의 염증 활성화, 혈전 자극원으로서의 염증성 백혈구, 혈전증 도중의 염증 반응의 전응고제 및 증폭제원으로서의 평활근 세포 및 염증 및 혈전증의 매개자로서의 혈소판을 포함하는 다면적 혈관 병리들에 대한 복잡한 염증 반응과 관련된 전신 염증 질환 상태를 말한다. 동맥은 그 내벽에 "플라크"라는 물질의 축적으로 인하여 경화되고 좁아진다. 플라크가 발생하고 크기가 증가하면서, 동맥의 내부는 더 좁아지고 ("협착") 그를 통하여 더 적은 혈액이 흐를 수 있다. 협착 또는 플라크 파열은 영향받는 혈관의 부분 또는 전체 결착을 야기할 수 있다. 따라서, 상기 혈관에 의하여 영양을 공급받는 조직은 그들의 산소원을 잃게 되고 (허혈) 세포 사멸 (괴사)가 일어날 수 있다. "CAD" 또는 "관상동맥 질환"은 심장 근육에 혈액을 공급하는 동맥 (관상동맥)이 죽상경화, 석회화 및/또는 좁아지는 경우 일어나는 동맥혈관 질환이다. 결국, 심장 근육으로의 혈류가 감소하고, 혈액은 다량 요구되는 산소를 운반하기 때문에 심장 근육은 필요로 하는 양의 산소를 받을 수 없고 종종 괴사를 겪는다. CAD는 심장에 산소 풍부한 혈액을 공급하는 혈관에서 발생하는 급성 관상동맥 증후군 (ACS), 심근경색 (심장 마비), 협심증 (안정 및 불안정), 및 죽상경화증 및 죽상혈전증과 같은 질환 상태를 포함한다. "CVD" 또는 "뇌혈관 질환"은 안면 및 뇌에 산호 풍부한 혈액을 공급하는 혈관에서의 동맥혈관 질환, 예컨대 죽상경화증 및 죽상혈전증이다. 이러한 용어는 종종 경동맥의 "경화"를 설명하기 위하여 사용되는데, 경동맥은 뇌에 혈액을 공급한다. 이는 CAD 및/또는 PAD (말초동맥 질환)와 함께 일반적인 동반 질환이다. 또한, 이는 허혈성 질환 또는 혈류 결핍을 야기하는 질환이라고도 불린다. CVD는 뇌혈관 허혈, 급성 뇌경색, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 동맥류, 경도 인지 장애 (MCI) 및 일과성 허혈성 발작 (TIA)과 같은 질환 상태를 포함한다. 허혈성 CVD는 CAD 및 PAD와 밀접하게 관련된 것으로 여겨지는데; 비허혈성 CVD는 다수의 병태생리를 나타낼 수 있다. 매년 추산 70 만명의 급성 CVD 문제가 일어나며, 과거 급성 CVD 문제로 진단된 미국인들 중 추산 500 만명이 생존하고 있다. 본 발명에서 기술하는바, 전통적인 동맥혈관 질환 위험 인자들로 이루어지는 임상적 평가에 기초하여 CVD 위험이 낮거나 없다고 보이는 대상체들, 또는 TIA, MCI 또는 중증 두통과 같은 증상이 없는 대상체들이 여전히 급성 CVD 문제의 위험에 처할 수 있다. "PAD" 또는 "말초동맥 질환"은 심장 및 뇌 외부에서 발생하는 죽상경화증 및 죽상혈전증과 같은 질환 상태를 포함한다. 이것은 CAD와 함께 일반적인 동반 질환이다. PAD (또는 동맥혈관 질환)에 대한 전통적인 위험 인자들 평가에 기초하여 PAD 위험이 낮거나 없어 보이는 대상체들, 또는 PAD나 동맥혈관 질환에 대하여 무증상인 대상체들이, 그럼에도 불구하고, 심지어 파행증 없이도 동맥혈관 문제의 위험에 처할 수 있다. 파행은 말초 동맥의 좁아짐으로부터 근육으로의 혈류량 감소에 기인하여 발생하는 다리 근육에서의 통증 또는 불편으로 정의될 수 있는데, 허혈성 및 종종 동맥 폐색을 생성하고, 골격근 및 사지 괴사를 야기한다. 통증 또는 불편함은 종종 보행시 발생하고 휴식 상태에서는 없어진다 (간헐적 파행증). 파행증의 결과 종종 통증, 압박감, 경련, 피로 또는 약해짐을 경험하게 된다. PAD는 CAD에서 일반적인 혈역학적 변화를 야기할 뿐 아니라, 골격근의 대사 변화 또한 결과한다. PAD가 중증 만성 및 급성 말초동맥 폐색으로 진행되면, 외과적 수술과 사지 절단이 때로 유일한 치료 선택지가 된다. PAD는 증상들이 뚜렷해진 뒤에야 비로소, 또는 다른 동맥혈관 질환과 함께, 및 이러한 허혈성 문제로 인하여 비가역적 동맥혈관 손상이 이미 발생하여야만 대다수의 확진이 가능한, 과소평가 진단되는 질환으로 널리 여겨진다.

"측정하는" 또는 "측정" 또는 선택적으로 "검출하는" 또는 "검출"은 임상적 또는 대상체 유래 시료 내에서 주어진 어느 물질의 존재, 부존재, 양 또는 함량 (유효량일 수 있음)을 평가하는 것을 의미하는데, 예컨대 이러한 물질들의 정성적 또는 정량적 농도 수준을 유도하거나 다르게는 대상체의 비분석 임상 파라미터의 수치 평가 또는 분류화를 포함한다.

본 발명의 문맥상 "위험"은 동맥혈관 문제로의 전환에서와 같이 특정 시간 기간에 걸쳐 일어날 사건의 확률에 관한 것이고, 대상체의 "절대적" 위험 또는 "상대적" 위험을 의미할 수 있다. 절대적인 위험은 관련 시간 코호트에 대하여 측정 후 실제 관찰을 참고하거나, 또는 관련 시간 기간 동안 추적된 통계적으로 유효한 과거 코호트로부터 개발된 인덱스 값을 참고하여 측정될 수 있다. 상대적 위험은 저위험 코호트의 절대적 위험과 비교하거나, 또는 평균적인 집단 위험과 비교한 대상체의 절대적 위험 비율을 말하는데, 이는 임상적 위험 인자들이 어떻게 평가되었느냐에 의하여 달라질 수 있다. 주어진 시험 결과에 대하여 부정적 사건에 대한 긍정적 사건의 비인 승산비 (odds ratio) 역시 통상 사용된다 (승산은 식 p/(l-p)에 따르는데, 여기서 p는 사건의 확률이고 (1- p)는 사건이 일어나지 않을 확률이다).

본 발명의 문맥상 "시료"는 대상체로부터 분리된 생물학적 시료이고, 예시일 뿐 제한되지 않는 방식으로, 체액 및/또는 조직 추출물, 예컨대 대상체로부터 얻어진 균질화물 또는 가용화된 조직을 포함할 수 있다. 조직 추출물은 조직 생검 및 부검 재료로부터 통상 얻어진다. 본 발명에서 유용한 체액은 혈액, 소변, 타액 또는 기타 임의의 체분비물 또는 그 유도체를 포함한다. 본 발명에서 사용되는바, "혈액"은 전혈, 혈장, 혈청, 순환 내피 세포, 성분 또는 혈액의 임의의 유도체를 포함한다.

"임상적 파라미터 또는 표지"는 대상체 건강 상태 또는 기타 특징의 모든 비시료적 또는 비분석적 바이오마커를 포함하는데, 예컨대, 제한 없이, 나이 (연령), 민족 (인종), 성 (성별), 이완기 혈압 (DBP) 및 수축기 혈압 (SBP), 가족력 (FamHX), 키 (HT), 체중 (WT), 허리둘레 (Waist) 및 엉덩이둘레 (Hip), 체질량 인덱스 (BMI), 및 기타 예컨대 유형 I 또는 유형 II 당뇨 또는 임신성 당뇨 (DM 또는 GDM, 본 발명에서 통칭 당뇨로 부름), 및 휴지 심박수 등이다.

본 발명의 문맥상 "대상체"는 좋기로는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나 이들 예시에 한정되는 것은 아니다. 인간 외의 포유동물이 동맥혈관 질환 또는 동맥혈관 문제의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 사용되는 것이 유리할 수 있다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상체는 이전에 동맥혈관 질환 또는 동맥혈관 문제를 갖는 것으로 진단되거나 확인된, 그리고 임의로 이미 상기 동맥혈관 질환 또는 동맥혈관 문제에 대한 치료적 개입을 경험했거나 경험 중인 대상일 수 있다. 또는, 대상체는 이전에 동맥혈관 질환을 갖는 것으로 진단되지 않았던 대상일 수도 있다. 예컨대, 대상체는 하나 이상의 동맥혈관 질환에 대한 위험 인자를 나타내는 대상 또는 동맥혈관 위험 인자를 나타내지 않는 대상, 또는 동맥혈관 질환 또는 동맥혈관 문제에 대하여 무증상인 대상일 수 있다. 대상체는 또한, 동맥혈관 질환 또는 동맥혈관 문제의 발병 위험에 있거나 그를 앓고 있는 대상일 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 "가용성 TREM-1" (sTREM-1)은 TREM-1 (수탁번호 Q9NP99, SEQ ID NO: 1)의 세포외 도메인의 가용형에 대한 것이다. sTREM-1은 TREM-1의 세포외 도메인의 분해에 의하여 생긴다. sTREM-1은 TREM-1의 막 결합형의 단백질분해효소 분해에 의하여 생성되는 TREM-1의 가용형일 수 있다. Gingras의 연구 (Gingras et al, Mol Immunol 2002, Mar;38(11):817-24)는 가용성 수용체로 번역될 수 있는 교대 (alternative) mRNA TREM-1 스플라이스 변이체 (TREM-1sv)의 발현 동정을 시도하였다. 그러나 이러한 TREM-1의 가용형 (뉴클레오티드 서열 가설로부터 예측된 단백질 서열)은 결코 인간에서 발견되지 않는 것으로 입증되었다. 그 후, 2007년 및 2012년에, Gomez-Pina (Gomez-Pina et al, J Immunol. 2007 Sep 15;179(6):4065-73 및 Gomez-Pina et al, J Leukoc Biol. 2012 Jun;91(6):933-45)는 가용-TREM-1이 막에 고정된 형태의 TREM-1의 금속단백질분해효소에 의한 단백질분해 분리에 의하여 생성된다는 것을 입증하였다. 사실, TREM-1은 MMPs에 의하여 쉽게 제거되어 sTREM-1을 생성하는 Ig-유사 엑토도메인을 갖는 막관통 당단백질이다. TREM-1의 어떠한 교대적 스플라이싱형도 인간 백혈구에서는 검출되지 않았다.

숫자에 선행하는 "약"은 상기 숫자 값의 가감 10%를 의미한다.

상세한 설명

TREM-1 (골수세포-1에 대하여 발현되는 촉발 수용체)는 선척적 면역 세포에 의하여 발현되는 면역수용체이다. 이론에 얽매일 것 없이, 본 발명의 발명자들은 Nod-유사 수용체 (NLRs) 참여 (Toll-유사 수용체 TLRs 포함)가 TREM-1 발현의 상향조절 및 그 막 제시를 유도한다고 말한다. 상기 NLRs 및 TLRs 활성화는 위험 관련 분자 패턴 (Danger Associated Molecular Patterns, DAMPs)을 연결함으로써 무균 염증 조건하에서 또는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs)을 연결함으로써 염증 조건하에서 일어날 수 있다. 이러한 NLRs 및 TLRs의 활성화는, 차례로, 많은 표적들 중에서 그 세포외 도메인의 절단에 의하여 가용형 TREM-1의 해리를 유도할 금속단백질분해효소의 상향조절을 유도한다 [Gomez-Pina et al. J Immunol. 2007, 179(6):4065-73].

일 구현예에 있어서, sTREM1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 갖고, 이는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 21 내지 205에 해당한다.

또 다른 구현예에 있어서, sTREM1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3을 갖고, 이는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 31 내지 205에 해당한다.

일 구현예에 있어서, sTREM 1은 SEQ ID NO: 2의 변이체 또는 SEQ　ID　NO:　3의 변이체이다.

일 구현예에 있어서, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ　ID　NO:　3의 변이체는 각각 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ　ID NO: 3의 25개 이상의 인접 아미노산, 좋기로는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, 170, 175, 180 또는 185개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이다.

또 다른 구현예에 있어서, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ　ID　NO: 3의 변이체는 각각 SEQ　ID　NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 2 또는 3의 C-말단 또는 N-말단에 추가 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로서, 추가 아미노산의 수는 1 내지 50, 좋기로는 1 내지 20, 더욱 좋기로는 1 내지 10개 아미노산으로서, 예컨대 C-말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 및/또는 N-말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산이다.

또 다른 구현예에 있어서, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ　ID　NO: 3의 변이체는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 SEQ ID NO: 2 또는 3과 통상 상이한 아미노산 서열이다. 일 구현예에 있어서, 상기 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산에 영향을 미칠 수 있다.

또 다른 구현예에 있어서, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ　ID　NO: 3의 변이체는 각각 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3과 75%, 80%, 90%, 95% 이상 또는 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는 25개 이상의 아미노산, 좋기로는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, 170, 175, 180 또는 185개 이상의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열이다.

"상동성" 또는 "동일한"이라는 용어는, 2 이상의 폴리펩타이드 서열간의 관계에서 사용시, 2 이상의 아미노산 잔기들의 열 사이에 매치되는 수에 의하여 결정되는, 폴리펩타이드들간 서열 관련 정도를 말한다. "상동성"은 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")으로 다루어지는 갭 정렬 (존재한다면)을 이용하여 작은 2 이상의 서열들 간 상동성 매치 백분율을 측정한다. 관련된 폴리펩타이드들의 상동성은 공지의 방법으로 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법은 문헌들 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)에 기재되는 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상동성을 결정하는 양호한 방법은 시험되는 서열들 간 가장 큰 매치를 만들도록 설계하는 것이다. 상동성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 설명된다. 두 서열들간 상동성을 결정하는 양호한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지, 예컨대 GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul et al., J. MoI. Biol. 215, 403-410 (1990))를 들 수 있다. BLASTX 프로그램은 국립생물공학정보센터 (NCBI) 및 기타 제공원 (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)에서 공개적으로 이용 가능하다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘 역시 상동성을 결정하기 위하여 사용될 수 있다.

일 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 변이체는 SEQ　ID　NO:　1은 아니다.

일 구현예에 있어서, sTREM 1는 SEQ ID NO: 2의 단편 또는 SEQ　ID　NO: 3의 단편이다.

일 구현예에 있어서, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ　ID　NO: 3의 단편은 각각 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ　ID NO: 3의 25개 이상의 인접 아미노산, 좋기로는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, 170, 175, 180 또는 185개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이다.

일 구현예에 있어서, sTREM1은 기질 금속단백질분해효소, 좋기로는 기질 금속단백질분해효소 9 (MMP9)으로 TREM1 서열 SEQ ID NO: 1을 분해함으로써 생성되는 세포외 단편에 해당한다.

본 발명의 한 가지 목적은 심혈관 문제 또는 심혈관 질환을 앓거나 발병할 위험이 있거나, 또는 모든 원인의 사망의 위험이 있는 대상체를 식별하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정함으로써 상기 대상체가 심혈관 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험에 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 대상체가 심혈관 문제 또는 심혈관 질환을 앓거나 발병할 위험이 있거나, 또는 모든 원인의 사망의 위험이 있는지 평가하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정함으로써 상기 대상체가 심혈관 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험에 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 대상체가 심혈관 문제 또는 심혈관 질환을 앓거나 발병할 위험이 있거나, 또는 모든 원인의 사망의 위험이 있는지 예측하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정함으로써 상기 대상체가 심혈관 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험에 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 대상체가 심혈관 문제 또는 심혈관 질환을 앓거나 발병할 위험이 있거나, 또는 모든 원인의 사망의 위험이 있는지 계층화하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정함으로써 상기 대상체가 심혈관 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험에 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 대상체의 심혈관 문제 또는 심혈관 질환의 중증도를 평가하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대상체의 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정함으로써 상기 대상체가 심혈관 문제 또는 질환을 앓거나 발병할 위험에 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따르면, 모든 원인의 사망은 심혈관 문제 또는 질환 후에 발생하는 사망, 예컨대 첫번째 심혈관 문제 또는 질환 후에 발생하는 사망을 말한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 심혈관 문제 또는 심혈관 질환과 관련되거나 그에 의하여 야기되는 사망 위험의 대상체를 식별하기 위한 것이다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 대상체가 심혈관 문제 또는 심혈관 질환과 관련되거나 그에 의하여 야기되는 사망 위험에 있는지를 평가하기 위한 것이다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 대상체가 심혈관 문제 또는 심혈관 질환과 관련되거나 그에 의하여 야기되는 사망 위험에 있는지를 예측하기 위한 것이다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 대상체가 심혈관 문제 또는 심혈관 질환과 관련되거나 그에 의하여 야기되는 사망 위험에 있는지를 계층화하기 위한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대상체는 실질적으로 건강한 대상체일 수 있는데, 이는 상기 대상체가 심혈관 질환을 갖고 있거나 앓고 있는 것으로 이전에 진단 또는 식별되지 않았다거나, 또는 심혈관 문제를 발병하지 않았다는 것을 의미한다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 대상체는 또한 심혈관 질환에 대하여 무증상인 대상체일 수 있다. 본 발명에서 사용되는바, "무증상" 대상체는 심혈관 질환 또는 문제의 전통적인 증상들, 예컨대 비제한적으로 CAD에 대하여 흉통 및 호흡 곤란, PAD에 대하여 파행, 및 CVD에 대하여 TIAS, MCI 및 심한 두통을 포함하는 전통적 증상들을 나타내지 않는 대상체를 말한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 대상체는 예컨대: 연령, 성별, LDL 농도, HDL 농도, 트리글리세라이드 농도, 혈압, 체질량 지수, CRP 농도, 관상 칼슘 점수, 허리둘레, 흡연 상태, 심혈관 질환의 병력, 심혈관 질환의 가족력, 심박수, 공복 인슐린 농도, 공복 글루코스 농도, 당뇨병, 고혈압 치료제의 사용 등 임상적 표지에 의하여 정의되는바, 심혈관 질환 또는 심혈관 문제를 앓거나 발병할 위험이 있는 대상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 대상체는, 예컨대 심근 괴사가 없는 만성 허혈성 장애 (예컨대 안정형 또는 노력 협심증), 심근 괴사 없는 급성 허혈성 장애 (예컨대, 불안정형 협심증), 심근 괴사가 있는 허혈성 장애 (예컨대, ST 분절 평가 심근경색 또는 비ST 분절 상승 심근경색)와 같은 심혈관 질환 또는 심혈관 문제로 이전에 진단되거나 식별된 대상일 수 있다.

조직 허혈은 종종 상대적인 관점에서 정의되고, 산소에 대한 요구가 조직으로의 산소 전달량을 넘어서는 때에 발생한다. 조직의 (예컨대, 심근) 산소 요구 및 공급 사이에 불균형이 있다. 이러한 산소 부족 조건은 대사물질의 부적절한 제거에 의하여 동반되어 관류 저하를 결과할 수 있다. 심근 허혈은 임상적으로 (예컨대 흉통), 생물학적으로 (예컨대, 미엘로퍼옥시다아제 활성의 증가), 신티그래피를 이용하여 국소벽 운동 장애를 분석함으로써 또는 심전도를 이용함으로써 (ST 분절의 일반적인 변형, 상부 또는 하부 ST 분절 편차, T파의 일반적 변형, 예컨대 T파 반전 또는 가파른 대칭 또는 높은 포지티브 진폭의 T파) 대사적으로 진단될 수 있다. 무증상 허혈 (silent ischemia)은 일반적으로 신티그래피 또는 24 시간 심전도 기록을 이용하여 진단된다.

안정형 및 노력 협심증은 통상 운동 도중 흉통에 의하여 뚜렷해지고 휴식시 천천히 회복된다. 이것은 보통 운동 도중 조직 허혈을 반영한다.

불안정형 협심증은 최근 안정형 협심증의 빈도 및/또는 중증도가 급격히 증가하거나, 협심증의 제1 에피소드 또는 휴식기 협심증이다.

심근 괴사는 일반적으로 순환 혈액 중의 심근 효소 (예컨대, 트로포닌 I, 트로포닌 T, CPK) 증가에 의하여 진단된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 대상체는 심혈관 질환에 대한 처치 및/또는 치료의 결과로서 심혈관 위험 인자의 개선이 보이는 대상일 수 있다. 이러한 개선은 체질량 인덱스의 감소, 총콜레스테롤의 감소, LDL 수준의 감소, HDLC 수준의 증가, 수축기 및/또는 확장기 혈압의 감소, 또는 기타 상술한 위험 인자 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 대상체에서 어떠한 허혈성 증상에 대한 개시는 진단되지 않았다. 심근 허혈은 임상적으로 (예컨대 흉통), 생물학적으로 (예컨대, 미엘로퍼옥시다아제 활성의 증가), 신티그래피를 이용하여 국소벽 운동 장애를 분석함으로써 또는 심전도를 이용함으로써 (ST 분절의 일반적인 변형, 상부 또는 하부 ST 분절 편차, T파의 일반적 변형, 예컨대 T파 반전 또는 가파른 대칭 또는 높은 포지티브 진폭의 T파) 대사적으로 진단될 수 있다.

또 다른 구현예에 있어서, 대상체에서 허혈성 증상의 개시가 진단되었다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, sTREM-1 수준을 측정하기 위하여 사용되는 시료는 혈액 시료, 전혈 시료, 혈장 시료, 혈청 시료 또는 소변 시료이다.

본 발명에서 사용되는바 "수준"이라는 용어는 sTREM-1의 발현 수준을 말한다. 혹은, 이것은 sTREM-1의 전사 수준 또는 sTREM-1의 번역 수준을 말할 수 있다. 발현 수준은 세포내적으로 또는 세포외적으로 검출될 수 있다. sTREM-1 수준을 측정하는 방법은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 비제한적으로 RT-PCR, RT-qPCR, 노던 블롯, 혼성화 기술, 예컨대, 마이크로어레이의 사용 및 이들의 조합, 예컨대 비제한적으로 RT-PCR에 의하여 얻어진 증폭 산물의 혼성화, 시퀀싱, 예컨대, 차세대 DNA 시퀀싱 (NGS) 또는 RNA-seq ("홀 트랜스크립톰 샷건 시퀀싱" 이라고도 알려짐) 등등, 면역조직화학법, 멀티플렉스법 (Luminex), 웨스턴 블롯, 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 샌드위치 ELISA, 형광결합 면역흡착 분석법 (FLISA), 효소 면역측정법 (EIA), 방사면역측정법 (RIA), 유세포분석법 (FACS) 등등을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 sTREM-1 수준은 기준치와 비교된다.

일 구현예에 있어서, 상기 기준치는 인덱스 값일 수 있거나 또는 심혈관 질환 및/또는 심혈관 문제에 대한 하나 이상의 위험 예측 알고리즘 또는 컴퓨터 지표로부터 유래할 수 있다. 기준치는 집단 연구, 비제한적으로 예컨대 유사한 체질량 인덱스, 총콜레스테롤 수준, LDL/HDL 수준, 수축기 또는 확장기 혈압을 갖는 대상체들, 동일하거나 유사한 연령 범위의 대상체들, 동일하거나 유사한 민족군의 대상체들, 죽상경화증, 죽상혈전증, 또는 CAD, PAD, 또는 CVD 가족력을 갖는 대상체들을 포함하는 집단 연구로부터 유래하는 수 또는 값에 상대적일 수 있거나, 또는 동맥혈관 질환, 예컨대 죽상경화증, 죽상혈전증, CAD, PAD, 또는 CVD에 대한 치료를 경험하는 대상체의 개시 시료에 상대적일 수 있다.

이러한 기준치는 동맥혈관 질환에 대한 수학적 알고리즘 및 컴퓨터화된 지표들로부터 얻어지는 집단에 대한 통계적 분석 및/또는 위험 예측 데이터로부터 유래될 수 있고, 예컨대 무엇보다 프라밍햄 연구, NCEP/ATP III에서 보고되는 알고리즘을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 심혈관 위험 인자 기준값은 또한 통계적 및 구조적 분류에 관한 다른 방법들 및 알고리즘을 이용하여 구성되거나 사용될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 기준값은 개인화된 기준이고, 즉, 상기 기준값은 상기 대상체로부터 얻어진 시료를 이용하여 결정되었다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 기준치는 상술한 바와 같이 실질적으로 건강한 하나 이상의 대상체로부터 유래하는 대조군 시료 중의 sTREM-1 으로부터 유래한다. 이러한 실질적으로 건강한 대상체들은 심혈관 질환에 대한 전통적인 위험 인자들을 결여하는데: 예컨대, 이들 대상체들은 200 mg/dl 미만의 혈청 콜레스테롤 수준, 120 mm Hg 이하의 확장기 혈압, 80 mm Hg 이하의 수축기 혈압을 갖고, 현재 비흡연자, 당뇨 진단 병력이 없고, 상술한 기타 위험 인자들 중에서도 이전에 급성 관상동맥 증후군이나 고혈압 진단된 적이 없으며, 또는 이 기술 분야에 알려진 심혈관 질환의 다른 침습적 또는 비침습적 진단 시험에 의하여 확인될 수 있는데, 예컨대 심전도 (ECG), 경동맥 B 모드 초음파 (내막 중간 두께 측정용), 전자선 컴퓨터 단층촬영 (EBCT), 관상동맥 칼슘 점수, 멀티 슬라이스 고해상도 컴퓨터 단층촬영, 핵 자기 공명, 스트레스 운동 검사, 혈관 조영술, 내혈관 초음파 (IVUS), 기타 조영 기술 및/또는 방사성 동위 원소 이미징 기술, 또는 기타 시험 기술을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 구현예에 있어서, 이러한 대상체들은 심혈관 질환 또는 급성 심혈관 문제가 계속하여 없는지 확인하기 위한 시험 이후 (질환 또는 문제가 발생하지 않는 생존) 진단학적 관련 시간 기간 동안 모니터링 및/또는 주기적 재검사된다 ("종방향 연구"). 이러한 시간 기간은 상기 기준치를 결정하기 위한 시험 개시일로부터 1년, 2년, 2 내지 5년, 5년, 5 내지 10년, 10년 또는 10년 이상일 수 있다. 또한, 적절히 저장된 병력 대상체 시료들 중 sTREM-1 수준의 소급적 측정이 이들 기준치를 세우는데 사용될 수 있으므로, 필요한 시간을 단축시키고, 대상체가 그 사이 기간 중에 물 클레임의 의도된 지평을 통하여 적절하게 이행되었음을 추정한다.

또 다른 구현예에 있어서, 기준치는 또한 하나 이상의 상기 침습적 또는 비침습적 기술에 의하여 심혈관 질환 또는 심혈관 문제에 대하여 이전에 진단되었거나 확인되었던 하나 이상의 대상체로부터, 또는 심혈관 문제를 발병할 위험이 높은 대상체, 또는 죽상경화증 또는 죽상혈전 플라크 파열을 발병할 위험이 높은 대상체, 또는 심혈관 문제 또는 플라크 파열을 앓는 대상체로부터 유래하는 시료에서의 sTREM-1 수준으로부터 유래할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 기준치는 또한 심혈관 질환에 대한 처치 및/또는 치료법의 결과로서 심혈관 위험 인자에 개선을 보인 하나 이상의 대상체로부터 유래하는 시료의 sTREM-1 수준으로부터 유래할 수 있다. 이러한 개선은 체질량 인덱스 감소, 총콜레스테롤 감소, LDL 수준 감소, HDLC 수준 증가, 수축기 및/또는 이완기 혈압 감소, 또는 기타 상술한 위험 인자 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 기준치는 또한 심혈관 질환에 대한 처치 및/또는 치료법의 결과로서 어떠한 심혈관 위험 인자에서도 개선을 보이지 않은 하나 이상의 대상체로부터 유래하는 시료의 sTREM-1 수준으로부터 유래할 수 있다. 이러한 개선은 체질량 인덱스 감소, 총콜레스테롤 감소, LDL 수준 감소, HDLC 수준 증가, 수축기 및/또는 이완기 혈압 감소, 또는 기타 상술한 위험 인자 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 기준치는 인덱스 값 또는 기저 값이다. 인덱스 값 또는 기저 값은 심혈관 질환, 예컨대 죽상경화증, 죽상혈전증, CAD, PAD 또는 CVD를 갖지 않는 하나 이상의 대상체들, 또는 심혈관 질환에 대하여 무증상인 대상체들로부터 유래한다. 기저 값은 또한, (심혈관 처치 또는 치료법의 결과로서) 심혈관 위험 인자에 개선을 보인 대상체로부터 유래할 수 있다. 이러한 개선은, 비제한적으로, 체질량 인덱스 감소, 총콜레스테롤 감소, LDL 수준 감소, HDLC 수준 증가, 수축기 및/또는 이완기 혈압 감소, 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 심혈관 문제 또는 질환은 대사 증후군, 증후군 X, 죽상경화증, 죽상혈전증, 관상 동맥 질환, 안정 및 불안정성 협심증, 뇌졸중, (동맥 혈전증 또는 동맥류와 같은) 동맥 질환 및 그 분지, 말초동맥 질환, 말초 혈관 질환, 뇌혈관 질환, 및 일시적 또는 영구적 허혈성 심혈관 문제이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 심혈관 문제 또는 질환은 심근경색이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 심혈관 문제 또는 질환은 죽상경화증이다.

일 구현예에 있어서, 혈액 시료 중 측정된 sTREM-1 수준이 265 pg/ml, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 360, 370, 380, 390, 또는 400 pg/ml 이상이면, 그 대상체는 심혈관 문제 또는 심혈관 질환과 관련하여 또는 그로부터 야기하여 사망할 위험에 있는 것으로 식별된다.

일 구현예에 있어서, 심혈관 질환 또는 심혈관 문제를 발병할 위험이 증가된 또는 그러한 위험을 갖는 것으로 식별된 대상체들은 심혈관 질환의 진행 속도를 낮추기 위한, 또는 심혈관 질환 또는 심혈관 문제 발병 위험을 감소시키거나 방지하기 위한 치료법을 받도록 선택된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 상술된바 방법은 그를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 질환 또는 문제를 모니터링하기 위한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에 상술된바 방법은 그를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 질환 진행을 평가하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 상술된바 방법은 심혈관 질환 치료에 대한 유효성을 모니터링하기 위한 것이다. 치료의 효능은 sTREM-1 수준의 변화에 의하여 반영될 것이다. 치료가 원하는 효과를 갖는다면, sTREM-1 수준은 그 치료 전 얻어진 것에 비하여 낮을 것이다. 반면, 치료가 원하는 효과를 갖지 못한다면, sTREM-1 수준은 높게 남아있을 것이다. 일 구현예에 있어서, 치료 개시 전 또는 개시시 얻어진 sTREM-1 수준은 기준치이다. 그러므로, 실시자는 sTREM-1 수준 감소가 기저 수준으로 또는 건강한 대상체들로부터 얻어지는 수준으로 될 수 있도록 치료 (투여량, 치료법)를 조정할 수 있을 것이다.

심혈관 질환 치료의 예시로는, 아스피린, 클로피도그렐, 프라수그렐, 당단백질 IIb/IIIa 억제제, 저분자량 헤파린, 미분획 헤파린, 폰다파리눅스, 비발리루딘, 스타틴, 베타-블로킹제, ACE-I 또는 ARB 등등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 심혈관 질환에 대한 치료는 TREM-1 기능, 활성 또는 발현의 조절에 기초한다. TREM-1 기능, 활성 또는 발현 조절의 예시는 TREM-1 및/또는 sTREM-1 또는 TREM-1 및/또는 sTREM-1 리간드에 대한 항체, 상기 TREM-1의 기능, 활성 또는 발현을 억제하는 소분자, 상기 TREM-1의 기능, 활성 또는 발현을 억제하는 펩타이드, TREM-1에 대한 siRNAs, TREM-1에 대한 shRNAs, TREM-1에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, TREM-1에 대한 리보자임 또는 TREM-1에 대한 압타머를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 심혈관 질환 치료는 sTREM-1 리간드, 예컨대 LR12 (SEQ ID NO: 4)를 표적하는 펩타이드를 이용하는 치료이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에서 상술한바 방법은 심혈관 질환 또는 문제에 대한 위험을 갖거나 그에 처한 것으로 진된된 대상체에 대한 치료 방법을 선택하기 위한 것이다.

따라서, sTREM-1 수준은 상기 치료법 이전에 얻어지는 시료에서 (기준치를 구성하는 수준) 및 상기 치료법 중 얻어지는 하나 이상의 또 다른 시료에서 측정된다. sTREM-1 수준의 감소는 이제 그 대상체에 대한 상기 치료법의 긍정적인 효과에 대한 지표가 된다. 역으로, 비슷한 수준 또는 sTREM-1 수준의 증가는 상기 치료법의 비효과에 대한 지표가 된다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 시료는 치료법 이전 및 치료 도중 매달 환자로부터 얻어지는데, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 또는 그 이상의 기간 동안, 또는 1년, 2년, 3년 이상 또는 그 이상의 기간 동안 얻어진다.

또 다른 구현예에 있어서, sTREM-1 수준은 치료법의 개시시 얻어지는 시료 (이 수준은 기준치를 구성) 및 상기 치료법 도중 얻어지는 하나 이상의 또 다른 시료에서 측정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 시료는 시료는 치료법 이전 및 치료 도중 매달 환자로부터 얻어지는데, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 또는 그 이상의 기간 동안, 또는 1년, 2년, 3년 이상 또는 그 이상의 기간 동안 얻어진다. 일 구현예에 있어서, 상기 치료법의 개시는 처치의 첫 투여일에 해당한다.

본 발명의 또 다른 목적은, sTREM-1 수준을 측정하기 위한 수단을 포함하는, 대상체가 심혈관 질환 및/또는 심혈관 문제를 갖거나 발병할 위험을 갖거나 그에 처해 있는지 식별하기 위한 키트이다.

일 구현예에 있어서, sTREM-1 수준을 측정하기 위한 상기 수단은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체와 같은 항체이다.

sTREM-1의 검출을 가능케 하는 항체의 예시로는 인간 TREM-1의 Met1-Arg200 아미노산에 대하여 생기는 폴리클로날 항체, R&D Systems의 Ref AF1278; 및 인간 TREM-1의 Ala21-Asn205에 대하여 생기는 모노클로날 항체, R&D Systems의 Ref MAB1278를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 sTREM-1 검출을 가능케하는 비제한적 항체의 예시는 하기 특허 또는 특허 출원: US2013/150559, US 2013/211050, US 2013/309239, WO2013/120553 및 US8,106,165에 개시되는 sTREM-1 및/또는 TREM-1 항체들을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 상기 sTREM-1 수준을 측정하기 위한 수단은 효소-결합 면역흡착법 (ELISA)이다.

ELISA 법의 예시는 R&D Systems의 TREM-1 Quantikine ELISA 키트; R&D Systems의 Human TREM-1 DuoSet, Ref DY1278B 및 DY1278BE, iQProducts의 sTREM-1 ELISA, Ref sTREM-1 ELISA를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명은 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험에 있는, 또는 모든 원인의 사망의 위험에 있는 대상체를 식별하는 시험관 내 (in vitro) 방법, 또는 대상체가 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험에 있는지, 또는 모든 원인의 사망의 위험에 있는지를 평가하는 시험관 내 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:

i) 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

ii) 상기 단계 i)에서 측정된 수준을 기준치와 비교하는 단계로서, 차이가 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험 또는 모든 원인의 사망 위험에 대한 표지인 것인 단계

를 포함한다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 심혈관 문제 또는 질환의 위험을 예측하는 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

i) 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

ii) 상기 단계 i)에서 측정된 수준을 기준치와 비교하는 단계로서, 차이가 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험에 대한 표지인 것인 단계

를 포함한다.

따라서, 본 발명은 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험에 있거나 모든 원인의 사망 위험에 있는 대상체를 계층화하는 시험관 내 방법, 또는 대상체에서 심혈관 문제 또는 심혈관 질환의 중증도를 평가하는 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

i) 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

ii) 상기 단계 i)에서 측정된 수준을 기준치와 비교하는 단계로서, 차이가 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험, 좋기로는 중증 위험에 대한 표지인 것인 단계

를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 기준치와 비교했을 때 시험 시료 중 sTREM-1 수준이 더 높은 것은 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험에 대한 표지이다. 일 구현예에 있어서, 기준치와 비교한 시험 시료 중의 sTREM-1 수준이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상인 것은 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 위험에 대한 표지이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 기준치와 비교했을 때 시험 시료 중 sTREM-1 수준이 더 높은 것은 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 중증 위험에 대한 표지이다. 일 구현예에 있어서, 기준치와 비교한 시험 시료 중의 sTREM-1 수준이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상인 것은 심혈관 문제 또는 질환을 갖거나 발병할 중증 위험에 대한 표지이다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 심혈관 질환에 대한 치료의 유효성을 모니터링하는 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

i) 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

ii) 상기 단계 i)에서 측정된 수준을 기준치와 비교하는 단계로서, 차이가 상기 치료의 원하는 효과에 대한 표지인 것인 단계

를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 모니터링 방법은:

i) 치료법 전에 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

ii) 치료법 중에, 좋기로는 치료법 도중 그 달에 (very month), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 또는 그 이상의 기간 동안, 또는 1년, 2년, 3년 이상 또는 그 이상의 기간 동안 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

iii) 상기 단계 ii)에서 측정된 수준을 상기 단계 i)에서 측정된 sTREM-1 수준와 비교하는 단계로서, sTREM-1 수준의 감소가 상기 대상체에 대한 상기 치료법의 긍정적인 효과에 대한 표지인 것인 단계

를 포함한다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 모니터링 방법은:

i) 치료법의 개시시에, 좋기로는 그 치료의 첫번째 투여일에 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

ii) 치료법 중에, 좋기로는 치료법 도중 그 달에 (very month), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 또는 그 이상의 기간 동안, 또는 1년, 2년, 3년 이상 또는 그 이상의 기간 동안 상기 대상체로부터 얻어지는 시료에서 sTREM-1의 수준을 측정하는 단계,

iii) 상기 단계 ii)에서 측정된 수준을 상기 단계 i)에서 측정된 sTREM-1 수준와 비교하는 단계로서, sTREM-1 수준의 감소가 상기 대상체에 대한 상기 치료법의 긍정적인 효과에 대한 표지인 것인 단계

를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 상기 시험 시료 중 sTREM-1의 수준이 상기 치료법 이전 또는 그 개시시에 측정된 sTREM-1 수준에 비하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상의 % 이하인 것은 상기 대상체에 대한 상기 치료법의 긍정적인 효과에 대한 표지이다.

일 구현예에 있어서, 상기 기준치는 약 80 pg/mL, 100 pg/mL, 또는 그 이상, 또는 약 150, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700 pg/mL 또는 대략 그 이상이다.

일 구현예에 있어서, 기준치를 얻기 위하여 사용된 기준 집단에서 측정된 sTREM-1 수준은 백분위수로 구분되며, 상기 기준 집단의 모든 대상체들에 의하여 얻어진 sTREM-1 수준 값은 오름차순의 그 수치 값에 따라 범위화된다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백분위수는 대상체들의 백분위수, 즉, 각각의 백분위수는 동일한 수의 대상체들을 포함한다. 그러므로, 제1 백분위수는 가장 낮은 sTREM-1 수준을 갖는 대상체들에 해당하는 반면, 마지막 백분위수는 가장 높은 sTREM-1 수준을 갖는 대상체들에 해당한다.

일 구현예에 있어서, 상기 기준치는 상기 기준 집단의 제1 백분위수의 가장 높은 sTREM-1 수준에 대응한다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 기준치는 상기 기준 집단의 제2, 제3 ... 또는 끝에서 두번째 백분위수의 가장 높은 sTREM-1 수준에 대응한다.

일 구현예에 있어서, 3개의 백분위수가 도출되는 경우, 각각의 백분위수는 삼분위수 (tertile)이라고 명명된다. 이 구현예에 따르면, 상기 기준치는 제1 또는 제2 삼분위수의 가장 높은 sTREM-1 수준에 대응한다.

또 다른 구현예에 있어서, 4개의 백분위수가 도출되는 경우, 각각의 백분위수는 사분위수 (quartile)이라고 명명된다. 이 구현예에 따르면, 상기 기준치는 제1, 제2 또는 제3 사분위수의 가장 높은 sTREM-1 수준에 대응한다.

본 발명에 따르면, sTREM-1의 수준은 이 기술 분야에 공지된 어떠한 방법에 의하여도 측정될 수 있다.

통상, 상기 방법은 상기 시료를 시료 중의 sTREM-1과 선택적으로 상호작용할 수 있는 결합 파트너와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇 가지 측면에 있어서, 상기 결합 파트너는 항체, 예컨대 모노클로날 항체 또는 압타머이다.

전술한 분석법들은 일반적으로 파트너 (즉, 항체 또는 압타머)의 고체 지지체로의 결합을 수반한다. 본 발명의 실시상 사용될 수 있는 고체 지지체는 니트로셀룰로오스 (예컨대, 막 또는 마이크로타이터 웰 형태로); 폴리비닐클로라이드 (예컨대, 시트 또는 마이크로타이터 웰); 폴리스티렌 라텍스 (예컨대, 비드 또는 마이크로타이터 플레이트); 폴리비닐리딘 플루오라이드; 디아조화 종이; 나일론 막; 활성화 비드, 자기 반응 비드 등등과 같은 기질들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. sTREM-1의 수준은 표준 면역진단 기법들, 예컨대 면역분석법, 예컨대 경쟁, 직접 반응 또는 샌드위치형 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 분석법은 응집 시험; 효소 표지 및 매개 면역분석법, 예컨대 ELISA; 비오틴/애비딘형 분석; 방사선면역측정법; 면역전기영동; 면역침전법을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 제공되는 정보들이 다른 생화학적 또는 진단 시험의 개발에 적용될 수 있고, ELISA 시험의 개발에 한정되는 것은 아니지만, 특정 단백질들을 식별하는 예시적인 생화학적 시험은 표준화된 시험 포맷, 예컨대 ELISA 시험을 채용한다 (예컨대, ELISA 시험의 설명에 대하여 문헌 [Molecular Immunology: A Textbook, edited by Atassi et al. Marcel Dekker Inc., New York and Basel 1984] 참조). 다양한 혈장 성분들에 대한 시판 분석 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 키트가 이용 가능하다는 것이 이해된다. 그러므로, ELISA 방법이 사용될 수 있고, 여기서 마이크로타이터 플레이트의 웰들은 sTREM-1을 인식하는 한 세트의 항체들로 코팅된다. sTREM-1을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 시료를 그 후 상기 코팅된 웰로 첨가한다. 항체-항원 복합체 형성이 가능하기에 충분한 반응 시간 후, 상기 플레이트(들)은 수세되어 미결합 모이어티들을 제거하고 검출가능하게 표지된 2차 결합 분자가 첨가될 수 있다. 상기 2차 결합 분자를 임의의 포획된 시료 마커 단백질과 반응하도록 두고, 플레이트를 수세하고 상기 2차 결합 분자의 존재는 이 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 검출된다.

sTREM-1 수준 측정 (면역분석계 방법을 이용하거나 이용하지 않는)은 또한, 화합물들의 분리를 포함할 수 있는데: 화합물의 분자량에 기초한 원심분리; 질량 및 전하에 기초한 전기영동; 소수성에 기초한 HPLC; 크기에 기초한 크기 배제 크로마토그래피; 사용되는 특정 고체상에 대한 화합물의 친화도에 기초한 고체상 친화 크로마토그래피 등이다. 일단 분리되면, 상기 화합물들은 그 화합물에 대하여 공지된 "분리 프로파일", 예컨대 머무름 시간에 기초하여 식별되고 표준 기법들을 이용하여 측정될 수 있다.

혹은, 상기 분리된 화합물들은, 예컨대 질량 분광기에 의하여 검출 및 측정될 수 있다.

통상, 시료 중의 sTREM-1 수준은 sTREM-1에 대하여 특이적인 모노클로날 항체를 이용한, 이중-항체 "샌드위치" 기법에 기초하여 면역분석법에 의하여 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 심혈관 문제 또는 질환을 진단하기 위한 바이오마커로서 sTREM-1의 용도이다.

본 발명의 또 다른 목적은 심혈관 질환을 모니터링하기 위한 바이오마커로서 sTREM-1의 용도이다.

도 1은 FAST-MI-2005 코호트에서 심근경색 후 가용성 TREM-1의 혈장 농도 및 심혈관 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 FAST-MI-2005 코호트에서 조정된 모델의 sTREM-1 수준의 ROC 곡선하 면적 (AUC)를 나타내는 그래프이다.
도 3은 FAST-MI-2010 코호트에서 심근경색 후 가용성 TREM-1의 혈장 농도 및 사망을 나타내는 그래프이다.
도 4는 심장 허혈 문제 후 및 죽상경화증 마우스들에서 혈장 sTREM-1 수준을 나타내는 히스토그램의 조합이다.
(A) 성체 수컷 Balb/c 마우스 (20-23 g)를 심근 허혈에 처하게 하고 무작위로 그룹화하여 (그룹당 n= 10) 복강으로 반복적 LR12 (5 일간 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 100 μg) 또는 스크램블드-LR12 (5 일간 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 100μg)를 투여받게 하였다. 혈장 sTREM-1 수준을 측정하기 위하여 심장 허혈 문제 이후 24 시간, 72 시간 및 168 시간에 혈액 시료를 수득하였다. 생리학적 기저수준은 건강한 동물들에서의 투여량으로부터 계산된다. 그룹당, 시간포인트당 N=10.
(B) 죽상경화증 마우스를 무작위로 복강 주입으로 LR12 (4 주간 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 100 μg) 또는 스크램블드-LR12 (4 주간 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 100 μg) 투여받게 하였다. sTREM-1 혈장 농도를 평가하기 위하여 치료 말에 (4 주) 혈액 시료를 수득하였다. 생리학적 기저수준은 건강한 동물들에서의 투여량으로부터 계산된다. 그룹당 N=10.

실시예

본 발명은 이하 실시예들에 의하여 보다 구체화된다.

방법

연구 집단 1

급성 ST-상승 및 비-ST-상승 심근경색에 대한 프랑스 레지스트리 (FAST-MI) 의 집단 및 방법은 기존 간행물 (Cambou, J.-P et al. 2007. Arch. Mal. Coeur Vaiss. 100: 524-534, Simon, T., et al. 2009. N. Engl. J. Med. 360: 363-375)에 상세히 기술되었다. 간단히, 크레아틴 키나아제, 크레아틴 키나아제-MB 또는 트로포닌 상승에 대한 통상의 상한 한계보다 2배 이상 심근 괴사의 혈청 마커 상승이 있다면, 및 급성 MI 및/또는 병리적 Q 파 (>0.04 초) 및/또는 >0.1 mV의 지속적인 ST 상승 또는 하강을 포함하는 2 이상의 인접 리드에 대한 심전도상 변화에 상응하는 둘 중 하나의 증상이 있다면, >18세의 모든 대상체가 레지스트리에 포함되었다. 증상 개시로부터 심층적인 케어 유닛 입원까지의 시간은 <48 h여야 했다. 대상체들은 일반적인 관행에 따라 관리되었고; 치료는 레지스트리의 참여에 의하여 영향받지 않았다. 당시 급성 MI를 앓던 대상체들을 치료했던 프랑스 내 374 개 센터들 중, 223 개 (60%)의 센터가 상기 레지스트리에 참여하였고, 3670 명의 환자들을 모집하였다. 이들 중, 100 개의 센터가 혈청 은행에 기여한 1061 명의 환자를 모집하였다.

이들의 기저수준 특징은 레지스트리의 총 집단과 비교되었다. 대상체 중 99% 이상이 코카서스인이었다. 추적은 대상체들의 의사, 대상체 자신 또는 그들의 가족, 및 그들 고향의 레지스트리 사무소와의 접촉을 통하여 자료 수집되었다. 1년의 추적은 >99% 완료되었다. 연구는 생 앙투안 대학 병원의 생물의학연구에서의 인간 대상체 보호에 대한 위원회에 의하여 검토되었고, 데이터 파일은 Commission Nationale Informatique et Libertes에 선언되었다.

연구 집단 2

두번째 확증 연구, 이름하여 FAST-MI-2010가 이용되었다. 이 코호트는 종전 간행물 (Hanssen M et al. Heart. 2012 May;98(9):699-705)에 상세히 기술되었다. 간단히, 심근 괴사 (트로포닌 또는 크레아틴 키나아제 MB)의 혈청 마커 증가가 있고, 하기 증상들: 심근 허혈, 새로운 비정상적 Q 파, 심근 허혈에 상응하는 ST-T 변화 (ST 분절 상승 또는 하강, T 파 역전) 중 하나 이상을 갖는다면 모든 >18세의 대상체들이 레지스트리에 포함되었다. 증상 개시로부터 심층적인 케어 유닛 돌입까지의 시간은 <48 h여야 했다. 대상체들은 일반적인 관행에 따라 관리되었고; 치료는 레지스트리의 참여에 의하여 영향받지 않았다. 2010년 10월 1일에 포함을 개시하여, 213 개 (당시 AMI를 치료하는 센터들 중 76%)의 센터가 상기 레지스트리에 참여하였고, 4169 명의 환자들을 모집하였다. FAST-MI 2010은 2005년의 레지스트리와 유사한 목적을 갖는 새로운 연구를 수행하기 위하여 시작되었다. 1년 추적이 >99% 완료되었다.

혈액 시료화 및 측정

이 연구를 위하여 사용된 혈액 시료는 심층 케어 유닛 (증상 개시로부터 <48 h)으로의 입원 시점에 회수되었다. 혈액 시료들은 -80℃에서 보관되었다. 모든 시료들은 번호로만 식별되었고 무작위 순으로 분석되었다. sTREM-1의 혈청 농도는 검출한계 46.9 pg/mL를 이용하여 ELISA (TREM-1 Duo-Set, RnDsystems)로 결정되었다. 첫번째 코호트에서 (FAST-MI-2005), 은행에 기여한 1061 명의 대상체들 중에서, TREM-1 수준에 대한 결과는 1015 명의 대상체들에 대하여 얻어졌다 (측정 손실). 두번째 코호트 FAST-MI-2010에서, sTREM-1 수준에 대한 결과는 1293 명의 대상체들에 대하여 얻어졌다.

sTREM-1의 마우스 혈청 수준은 검출 한계 31.3 pg/mL를 이용하여 ELISA (Mouse TREM-1 Quantikine ELISA Kit, RnDsystems)에 의하여 결정되었다.

통계 분석

결과는 2년 추적 기간 중 모든 원인의 사망 또는 비치명적인 MI로서 정의되었다. 1차적인 엔드포인트, 포함시 에피소드 인덱스로서 정의된 모든 원인의 사망 및 비치명적 MI의 조성은 그 구성원들이 환자들의 약물처치 및 혈액 측정을 모르는 위원회에 의하여 판정되었다. 연속 변수는 평균 ± SD로 기술되고, 범주 변주는 빈도 및 백분율로 기술된다. sTREM-1 및 C-반응성 단백질의 혈장 수준은 연속 변수로서 사용되기 전에, 포지티브 비대칭 (positive skewness)을 제거하기 위하여 로그 변환되었다. 입원 중 기저수준 인구통계적 및 임상적 특징들, 치료 인자 및 치료 관리는 개별 변수들에 대하여 χ2 또는 피셔 추출 시험을 이용한 sTREM-1 수준의 삼분위수 중에서 사전에 특정된 것으로서 비교되었고, 연속 변수들에 대하여는 Wilcoxon 사인드-랭크 시험 또는 Kruskal-Wallis 시험에 의하였다. sTREM-1 수준의 삼분위수들은 전체 시료들에 대한 데이터에 기초하여 구축되었다.

sTREM-1 삼분위수에 따른 생존 곡선은 Kaplan-Meier 추정자를 이용하여 산정된다.

2년 추적 기간 중의 상기 1차 엔드포인트를 이용하여 변수들의 독립적 예후 수치를 평가하기 위하여 다변량 Cox 비례 위험 모델을 사용하였다. 상기 다변량 모델은 성별, 연령, 이전 또는 현재의 흡연, 체질량 인덱스, 관상동맥 질환의 가족력, 고혈압 병력, 앞선 급성 MI, 심부전, 신부전, 만성 폐쇄성 폐 질환, 당뇨, 입원시 심박, Killip 분류, 좌심실 박출률, 병원 관리 (예컨대, 재관류 치료, 스타틴, 베타-블록화제, 클로피도그렐, 이뇨제, 강심제, 헤파린), 및 로그 C-반응성 단백질 수준으로 구성된다. 그 결과는 신뢰 구간 (CIs) 95%인 Cox 모델에 대한 위험 비율로 표현된다. sTREM-1 수준과 관련된 추적 중 심혈관 결과에 대한 민감도 대 거짓 포지티브 빈도 (1-특이도)는 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선에 의하여 분석되었다. sTREM-1 수준에 대한 Youden 인덱스는 하기 식을 이용하여 산출되었고: 민감도 + 특이도 - 1; 최적 컷-오프 포인트에 해당하는 Youden 인덱스의 최대값을 이용하였다 (Youden WJ. Cancer. 1950;3:32-35).

모든 통계적 시험은 양측 (two-sided)이었고, SAS 소프트웨어 버전 9.3.을 이용하여 수행되었다.

펩타이드

LR12는 TREM-1 리간드를 특이적으로 표적하는 것으로 알려진 12 개 아미노산 펩타이드이다 (LQEEDTGEYGCV, SEQ ID NO: 4). 이것은 생체 내 (in vivo) 분석을 위하여 C 말단 아미데이션된 펩타이드로서 화학적 합성되었다 (Pepscan Presto BV, Lelystad, The Netherland). 정확한 펩타이드를 >95% 수율로 얻었고, 분취 (preparation) 정제 후 질량 분광분석 및 분석 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 확인된바 균질하였다. 이들 펩타이드는 내독소 무함유였다. 유사하게 대응하는 스크램블드 펩타이드를 합성하였고 대조군 펩타이드로서 사용하였다 (LR12-스크램블드, LR12과 동일한 아미노산으로 구성되지만 TREM-1 억제 특성을 나타내지 않는 것으로 알려진 무작위 서열로 이루어짐).

동물

모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 지역 위원회의 승인이 있었고 동물 실험에 대한 국제 가이드 라인에 따라 수행되었다. 마우스 및 래트는 Charles River (Strasbourg, France)에서 얻었다.

심근경색의 마우스 모델

모든 과정은 6-8 주령 범위의 수컷 마우스 C57BL/C에 대하여 수행되었다. 마우스들은 복강 내 자일라진 (60 mg/kg) 주입에 의하여 마취되고 앙와위로 고정되었다. 기관은 삽관 및 환기되었다 (호흡량은 200 μl/25 g이었고 호흡 속도는 120 호흡/분이었다). 좌측 개흉술 후, 좌측 관상동맥이 확인되었고 왼쪽 귓바퀴 끝으로부터 1.0 mm 떨어진 곳에서 8-0 외과 봉합사로 이어붙였다. LAD 폐색은 허혈 부위 (좌심실)에서 적색에서 흰색으로 심근의 색이 변화함에 의하여 확인되었다. 흉부를 닫고 피부를 6-0 실크로 봉합하였다. 동물을 우리로 돌려보냈고, 온전히 회복할 때까지 감독되었다. 마우스들은 무작위로 펩타이드를 투여받거나 받지 않았으며 (5 일간 매일 복강 주입, 5 mg/kg) 24 시간, 72 시간, 168 시간 후 (그룹당 n=6) 마취후 혈액 채취를 위한 펜토바르비탈 소듐 과량 투여로 희생되었다.

마우스의 죽상경화증

12 및 24-주령 수컷 ApoE-/- 마우스들에게 지방 (지질 15%, 콜레스테롤 1.25%, 콜레이트 미포함) 또는 챠우 식이를 공급하고 매일 복강 내 주입으로 펩타이드 (100 μg/일) 처리하였다. 처리 4 주 후, 혈액 채취를 위하여 마우스들을 희생시켰다.

결과 1

본 발명의 목적은 급성 심근경색 후 48 시간 내에 가용성 TREM-1 수준과 급성 ST 상승 또는 비-ST-상승 심근 경색에 대한 프랑스 레지스트리 (FAST-MI, NCT00673036)에 등록된 환자들에서의 심혈관 결과 사이의 관련성을 평가하기 위한 것이었다. sTREM-1의 혈청 수준은 1 년 및 2 년시에 모든 원인의 사망과 MI 재발 위험과 관련되어 있었는데, sTREM-1의 고수준은 보다 나쁜 결과에 대한 표지였다. 등록된 1015 명의 환자들 중, 183 명의 환자들 (18%)이 2 년의 추적 기간 중에 죽거나 MI에 걸렸다. 문제가 발생하지 않은 환자들보다 상기 추적 중 사망하였거나 MI에 걸린 환자들은 노년이었고 (75 ± 12 세 vs. 64 ± 13 세), 여성 비율이 높았다 (42 vs. 27%). 그들은 또한 고혈압, 당뇨, 심부전 병력, MI 병력, 뇌졸중 또는 일시적 허혈 문제 병력, 만성 신부전 및 만성 폐쇄성 폐 질환의 비율이 높았다. 추적 중 문제를 발생시키지 않은 환자들과 비교하여 이들은 스타틴 치료를 덜 받았고 (68 vs. 81%), 베타-블로킹제 (50 vs. 76%), 클로피도그렐, 헤파린 치료를 덜 받았으나, 이뇨제나 디곡신 치료는 더 받았다. 문제가 발생한 환자들은 GRACE (Global Registry of Acute Coronary Events) 위험 점수에 따른 벼원에서의 사망 위험이 더 높았고, 입원 중에 관상동맥 혈관 성형술 PCI (43 vs. 73%) 또는 혈전용해술 (9 vs. 17%)를 받은 환자는 더 적었다.

그 결과에 따른 환자들의 특성을 표 1에 나열하였다.

sTREM-1 삼분위수에 따른 환자들의 특성을 표 2에 나열하였다.

sTREM-1 (pg/ml) 수준이 측정되었다 (표 3).

전체 집단에 대한 sTREM-1 수준의 중앙값은 273 pg/mL였다 (범위 50-7069; 제1 삼분위수 <212.4 pg/mL, n=339 ; 제3 삼분위수 >354 pg/mL, n=339).

sTREM-1 기저수준의 함수로서 문제 발생 확률을 도 1에 나타내었다.

1 년차에, 사망 및 MI 문제 비율은 제1 삼분위수에 대하여는 6%, 제2 삼분위수에 대하여는 9%, 제3 삼분위수에 대하여는 24%였다.

2 년차에, 사망 및 MI 문제 비율은 제1 삼분위수에 대하여는 9%, 제2 삼분위수에 대하여는 14%, 제3 삼분위수에 대하여는 31%였다.

로그 (sTREM-1) 1 유닛 pg/mL 증가와 관련된, 2 년 추적 중 사망 및 MI 재발의 조정된 HR은 1.70였다 (95% CI 1.33- 2.17 ; p<0.0001).

본 발명자들은 또한, 보다 넓은 범위의 sTREM-1에 걸쳐 그 관련성을 조사하기 위하여 sTREM-1의 삼분위수들에 걸친 경향을 시험하였다. 기준으로 선택된 삼분위수 1과 비교하여, 조정된 HR은 각각 삼분위수 2 및 삼분위수 3에 대하여 1.38 (95% CI 0.83-2.28) 및 2.08 (95% CI 1.28-3.39)였다 (총 p=0.006). Cochran-Armitage 경향 검증은 유의하였다 (p< 0.0001).

2년 추적 후 심혈관 결과를 정확히 예측했던 조정된 모델에서의 sTREM-1 수준의 ROC 곡선하면적 (AUC)은 0.847였다 (도 2).

낮은 수치의 (1-특이도)와 조합된 높은 수치의 민감도를 고려할 때, Youden 인덱스를 이용한 sTREM-1 수준에 대한 최선의 컷-오프는 343　pg/mL였다 (민감도=0.61 및 특이도=0.70).

결과 2

첫번째 코호트 FAST-MI-2005에 대한 결과는 두번째 코호트 FAST-MI-2010으로 확인되었다. FAST-MI 2010은 2005년 레지스트리와 유사한 기준과 목표로 신규한 조사를 시행하기 위하여 시작되었다. 이 코호트에서, sTREM-1 수준이, 급성 심근경색 후 1 년 시기의 모든 원인의 사망 위험과 연관되었다.

sTREM-1 삼분위수에 따른 환자들의 특징인 표 4 및 표 5에 나열되었다. sTREM-1의 범위는 112 내지 7038, 제1 삼분위수 < 264.552 pg/mL n=430, 제3 삼분위수 >444.287 pg/mL n=432)이다.

기저수준 sTREM-1의 함수로서 모든 원인의 사망의 확률이 도 3에 제시된다. 로그 (sTREM-1) 1 유닛 pg/mL 증가와 관련된, 1 년 추적 중 사망의 조정된 HR은 3.784 (95% CI 2.440-5.869 ; p<0.0001).

기준으로 선택된 삼분위수 1과 비교하여, 조정된 HR은 각각 삼분위수 2 및 삼분위수 3에 대하여 2.996 (95% CI 0.631-14.220) and 9.375 (95% CI 2.147-40.936)였다 (총 p=0.0005). Cochran-Armitage 경향 검증은 유의하였다 (p< 0.0001).

결과 3

본 발명의 두번째 목적은 치료가 혈장 sTREM-1 수준에 영향을 미칠 수 있는지를 평가하기 위한 것이었다. 죽상경화증 마우스 (24 주령 ApoE-/- 마우스, 지방 식이됨)를 TREM-1 리간드를 표적화하는 LR12 펩타이드로 처리하거나, 또는 대조군 펩타이드 LR12-스크램블드로 처리하였다. 처리 4 주 후 sTREM-1 수준이 증가하였고 (311.8 pg/mL) LR12 처리가 혈장 sTREM-1 농도 감소와 연관된다는 것을 알았다 (189.8 pg/mL) (도 4B).

또한, 경색증 마우스에서, 허혈 문제 발생 24 시간 및 72 시간 후 LR12 처리에 의하여 sTREM-1 수준이 감소되었음을 알았다 (도 4A).

LR12 투여가 심장 허혈 발생 후 뿐 아니라 죽상경화증 중에 더 나은 결과와 관련되어 있기 때문에 (데이터 미기재), 이러한 결과들은 sTREM-1 투여가 상기 질환의 진행을 평가하기 위한 치료와 함께 조합하여 사용될 수 있다는 것을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) APHP (Assistance Publique - Hopitaux de Paris) UNIVERSITE DE LORRAINE INOTREM Derive, Marc <120> METHODS AND KITS FOR PREDICTING THE RISK OF HAVING A CARDIOVASCULAR DISEASE OR EVENT <130> CV - 300/PCT <160> 4 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> TREM-1 <400> 1 Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser 1 5 10 15 Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys 20 25 30 Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe 35 40 45 Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val 65 70 75 80 Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu 85 90 95 Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln 100 105 110 Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg 115 120 125 Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn 130 135 140 Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr Thr Lys 145 150 155 160 Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro 165 170 175 Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu 180 185 190 Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile 195 200 205 Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu 210 215 220 Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro 225 230 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sTREM-1 <400> 2 Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys Glu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Ala Ser Ser Gln 20 25 30 Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro Lys Thr Leu Ala 35 40 45 Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val Gln Val Gly Arg 50 55 60 Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu Arg Val Arg Met 65 70 75 80 Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ile Tyr 85 90 95 Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg Ile Arg Leu Val 100 105 110 Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn Glu Asn Ser Thr 115 120 125 Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr Thr Lys Ala Leu Cys Pro 130 135 140 Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro Pro Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu Thr Asn Val Thr 165 170 175 Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn 180 185 <210> 3 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sTREM-1 <400> 3 Leu Lys Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu 1 5 10 15 Lys Phe Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu 20 25 30 Met Pro Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His 35 40 45 Pro Val Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly 50 55 60 Leu Leu Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Gln Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe 85 90 95 Asp Arg Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly 100 105 110 Ser Asn Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr 115 120 125 Thr Lys Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln 130 135 140 Ala Pro Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile 145 150 155 160 Asn Leu Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn 165 170 175 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LR12 <400> 4 Leu Gln Glu Glu Asp Thr Gly Glu Tyr Gly Cys Val 1 5 10

Claims (12)

1. 심혈관 문제가 발병할 위험이 있거나, 심혈관 문제 후 발생하는 사망 위험이 있는 대상체를 식별하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체로부터의 시료 중의 sTREM-1 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 sTREM-1 수준은 기준치와 비교되는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 기준치보다 높은 sTREM-1 수준은 심혈관 문제가 발병할 위험 또는 심혈관 문제 후 발생하는 사망 위험에 대한 표지인 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료인 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 심혈관 문제는 심근경색인 것인 방법.
6. 심혈관 문제를 앓고 있거나 앓았던 대상체에게 투여되는 치료법의 유효성을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체로부터의 시료 중의 sTREM-1 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 심혈관 문제는 급성 관상동맥 증후군 및 비-심장성 급성 동맥혈관 문제 중에서 선택되는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 sTREM-1 수준은 상기 대상체의 개인화된 기준치와 비교되고,
   상기 대상체의 상기 개인화된 기준치는 상기 치료법 이전 또는 개시시에 상기 대상체로부터 얻어지는 시료 중에서 측정된 sTREM-1 수준인 것인 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 상기 치료법은 TREM-1 기능, 활성 또는 발현의 조절에 기초하는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, TREM-1 기능, 활성 또는 발현의 조절자는 TREM-1 리간드를 표적하는 펩타이드인 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 TREM-1 리간드를 표적하는 펩타이드는 SEQ ID NO: 4로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것인 방법.
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