CN105764524A - 治疗hpv相关疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在初免?加强(prime?boost)免疫方案中粘膜组织给予治疗性HPV疫苗的方法，其产生抗原特异性CD8+T细胞介导的免疫反应以及组织驻留记忆T细胞(Trm)标志物在CD8+T细胞上的表达。在一些实施方案中，在初免?加强免疫方法中采用pNGVL4a?sig？7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA?HPV的本发明方法，其显示在受感染粘膜组织中的疫苗接种(包括在子宫颈阴道中的疫苗接种)，与肌内疫苗接种相比，在组织和局部淋巴结中引发有效的抗肿瘤效应和更有效的局部免疫反应。此外，靶向诱导Trm介导的免疫反应可用作特别是用于治疗性HPV疫苗的理想方法。

Description

治疗HPV相关疾病的方法
相关申请
本申请要求保护2013年8月6日提交的美国临时专利申请系列号61/862,768的优先权的权益；所述申请的内容通过引用结合到本文中。
政府权益声明
本发明是使用NIH授予的基金号CA098252和CA114425下的政府支持进行。政府对本发明具有一定权利。
发明背景
人乳头状瘤病毒(HPV)为子宫颈、外阴、阴道、阴茎、口腔、喉和肛门癌症以及诸如肛门生殖器湿疣或生殖器疣等非致癌疾病的主要病原物质。子宫颈癌为全世界范围内第三大常见的女性癌症。鉴定HPV作为子宫颈癌的病原因子，为开发治疗性HPV疫苗以抑制已确定的HPV感染朝HPV癌前期和癌性损害的进展创造了机会。两种HPV病毒性癌蛋白E6和E7，为诱导和维持细胞转化所必需的，并且始终在HPV相关的癌症中共表达。因此，它们代表用于开发治疗性HPV疫苗的理想靶标。
子宫颈癌为一种细胞改变，其起源于子宫颈的上皮中并且最初通过慢性和进行性进展的前期损害(子宫颈上皮内瘤形成(CIN))来显现，所述损害可分为低级别和高级别鳞状上皮内损害(分别为LSIL和HSIL)。50%的HSIL将最终发展成子宫颈癌。通过人乳头状瘤病毒(HPV)癌蛋白介导的细胞周期控制上的改变，为子宫颈癌中的主要分子作用机制。HPV感染非常普遍；对于可生育的妇女的终身风险为约80%。然而，大部分妇女清除所述感染(不论HPV类型)，而并未经历不利的健康影响。子宫颈损害中最频繁涉及的HPV类型为HPV 16和18，其一起导致70%的子宫颈癌病例。致癌性HPV感染为子宫颈上皮细胞的致癌性转化的必要(尽管并非充分的)因素。另外的辅助因素，例如导致病毒清除的有效免疫反应，决定HPV感染是否将导致子宫颈癌。
因此，仍然存在对用于HPV相关疾病包括子宫颈癌的更好治疗方案的需要。
发明概述
根据一个实施方案，本发明提供用于在受试者的粘膜组织中产生对抗人乳头状瘤病毒(HPV)相关疾病的免疫反应的方法，所述方法包括：a)给予所述受试者的肌肉或粘膜组织有效量的组合物，所述组合物包含由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70构成的第一疫苗构建体；和b)随后给予所述受试者的粘膜组织有效量的包含第二疫苗构建体的组合物，从而在受试者中引发对抗HPV感染的免疫反应。
根据另一个实施方案，本发明提供用于治疗受试者中的子宫颈癌的方法，所述方法包括：a)给予所述受试者的肌肉或阴道粘膜组织有效量的组合物，所述组合物包含由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70构成的第一疫苗构建体；和b)随后给予所述受试者的粘膜组织有效量的包含第二疫苗构建体的组合物，从而在受试者中引发对抗子宫颈癌的免疫反应。
附图简述
图1使用细胞内IFN-g细胞因子染色接着流式细胞术分析，阐述E7-特异性CD8+ T细胞免疫反应的特征。将C57BL/6小鼠(每组5只)肌内接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA (每只小鼠50 μg)初免(prime)，接着六天后腹腔内注射TA-HPV (每只小鼠1x107pfu)加强免疫(boost)、DNA初免接着DNA加强免疫、仅TA-HPV或不接受疫苗接种。在最终免疫一周后，通过流式细胞术分析脾细胞。所示数据来自代表性流式细胞术分析。右上角中的数字表示105个总脾细胞中CD8+ IFN-y+ E7-特异性T细胞的数量。
图2使用载E7肽H-2Db四聚体（E7 peptide-loaded H-2Db tetramer staining）染色描述脾中E7-特异性CD8+ T细胞的特征。经子宫颈阴道内(ICV)或肌内(IM)，将C57BL/6小鼠(每组5只)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50 μg)初免，接着六天后给予TA-HPV (每只小鼠1x107)加强免疫。在第二次免疫一周后，通过流式细胞术分析脾细胞。A.代表性流式细胞术分析。B.直方图。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图3为使用载E7肽H-2Db四聚体染色的外周血中的E7-特异性CD8+ T细胞的特征。经ICV或IM，将C57BL/6小鼠(每组5只)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50 μg)初免，接着六天后TA-HPV (每只小鼠1x107)加强免疫。在第二次免疫一周后，通过流式细胞术分析血液。A.代表性流式细胞术分析。B.直方图。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图4显示使用载E7肽H-2Db四聚体染色的子宫颈阴道中的E7-特异性CD8+ T细胞的特征。经ICV或IM，将C57BL/6小鼠(每组5只)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50 μg)初免，接着六天后TA-HPV (每只小鼠1x107)加强免疫。在第二次免疫一周后，通过流式细胞术分析子宫颈阴道组织。A.子宫颈阴道中CD8+ T细胞的数量的直方图。B.子宫颈阴道中E7-特异性CD8+ T细胞的数量的直方图。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图5描述使用载E7肽H-2Db四聚体染色的髂淋巴结(ILN)中的E7-特异性CD8+ T细胞的特征。经ICV或IM，将C57BL/6小鼠(每组5只)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50 μg)初免，接着六天后TA-HPV (每只小鼠1x107)加强免疫。在第二次免疫一周后，通过流式细胞术分析ILN。直方图显示ILN中的E7-特异性CD8+ T细胞的数量。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图6显示子宫颈阴道组织中通过E7-特异性CD8+ T细胞的α4ß7和CCR9表达。经ICV或IM，将C57BL/6小鼠(每组5只)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50 μg)初免，接着六天后TA-HPV (每只小鼠1x107)加强免疫。在第二次免疫一周后，使用载E7肽四聚体染色通过流式细胞术分析子宫颈阴道组织。A.直方图显示α4ß7表达。α4ß7为与子宫颈阴道组织中的MAdCAM-1结合的T细胞的表面标志物。B.直方图显示CCR9表达。CCR9为结合CCL25的趋化因子受体。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图7为髂淋巴结中通过E7-特异性CD8+ T细胞的α4ß7和CCR9表达的特征。经ICV或IM，将C57BL/6小鼠(每组5只)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50 μg)初免，接着六天后TA-HPV (每只小鼠1x107)加强免疫。在第二次免疫一周后，使用载E7肽四聚体染色通过流式细胞术分析ILNs。A.直方图显示α4ß7表达。B.直方图显示CCR9表达。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图8描述通过子宫颈阴道组织和脾中的E7-特异性CD8+ T细胞的α4ß7、CCR9和CD103表达。通过ICV给予，将C57BL/6小鼠(每组5只)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50 μg)初免，接着六天后TA-HPV (每只小鼠1x107)加强免疫。在第二次免疫一周后，将来自子宫颈阴道组织和脾的组织浸润的淋巴细胞分离并使用CD8、载E7肽四聚体以及α4ß7、CCR9和CD103染色通过流式细胞术分析。对载E7肽四聚体阳性CD8+ T细胞设门以用于进一步分析α4ß7、CCR9和CD103表达。A.所示数据为代表性流式细胞术分析。B.直方图显示α4ß7、CCR9和CD103表达。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图9显示通过经由ICV或IM疫苗接种的pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70初免和TA-HPV加强免疫产生的体内治疗性抗肿瘤效应。在阴道的粘膜下层中用表达萤光素酶的TC-1细胞(每只小鼠2x104个)激发C57BL/6小鼠(每组5只)。一天之后，用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70免疫小鼠并在6天之后，用TA-HPV免疫小鼠。在注射TC-1萤光素酶表达细胞之后的第7天和第14天通过发光监测阴道中的信号。
图10通过不同疫苗接种途径产生的局部和系统免疫反应。将C57BL/6小鼠(每组5只)以7天间隔经肌内(IM)或子宫颈阴道内(ICV)接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 (每只小鼠50μg)两次，接着在第二次DNA疫苗接种7天之后肌内(IM)或子宫颈阴道内(ICV) TA-HPV加强免疫。在最终免疫7天之后，将小鼠处死以及将脾细胞和子宫颈阴道细胞分离并通过流式细胞术分析。A.代表性流式细胞术分析和B.直方图显示脾细胞中的E7-特异性CD8+ T细胞的数量。C.代表性流式细胞术和D.直方图显示子宫颈阴道细胞中的E7-特异性CD8+ T细胞的数量。值显示为平均数±SD，*p<:0.05，**p<:0.01，ns，非显著的。
图11为用于抗肿瘤疫苗接种的pNGVL4a-Sig/E7(detox)/HSP70质粒载体的示意图。
发明详述
本发明人先前已采用靶向E6和/或E7的DNA疫苗和牛痘苗用于HPV相关疾病，包括开发了治疗性HPV DNA疫苗pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70，其编码由与信号肽(sig)连接的HPV-16 E7抗原和热休克蛋白70 (HSP70)组成的嵌合蛋白(美国专利申请号10/555,669，并通过引用结合到本文中)。此外，pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗已用于患有高级别上皮内损害的患者中的临床试验，并已证实为安全的(Clin. Cancer Res.，15:361-7 (2009))。目前，在患有3级子宫颈上皮内瘤形成的患者中，在肌内DNA初免和牛痘苗加强免疫方案的情况下，正在将所述DNA疫苗，pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70与重组治疗性HPV疫苗，TA-HPV联合使用(NCT00788164) (Sci. Transl. Med. 6，221ra13 (2014))。TA-HPV为编码HPV-16/18 E6和E7蛋白的重组牛痘苗。TA-HPV已用于数个临床试验并已证实为安全的(Lancet，347:1523-7 (1996))。因此，pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV对用于初免-加强免疫方案为有利的。
近来，已显示组织驻留记忆T细胞(Trm)在涉及感染和免疫的局部免疫反应中起重要作用。因此，现在本发明人考虑将能够利用Trm提供的强大的保护性免疫的本发明的部位特异性疫苗接种用作特别是用于粘膜肿瘤的理想方法。
本发明的方法指出，重要的是考虑一种独特策略，以通过本发明的治疗性HPV疫苗产生Trm，用于控制在粘膜组织中出现的HPV相关的疾病。
根据一些实施方案，本发明人检验了在初免-加强免疫方案中，阴道内给予治疗性HPV疫苗对于系统和局部地产生抗原特异性CD8+ T细胞介导的免疫反应和在CD8+ T细胞上表达Trm标志物的影响。使用了pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV，并发现阴道内给予在子宫颈阴道和局部淋巴结中引发更有效的局部免疫反应。重要的是，通过所述初免-加强免疫疫苗接种产生的E7-特异性CD8+ T细胞表达对粘膜组织特异的Trm的标志物。因此，本发明的方法显示，采用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA和TA-HPV的子宫颈阴道内疫苗接种方案产生有效的E7-特异性Trm免疫反应以及对抗TC-1肿瘤模型的抗肿瘤效应。本文所用的术语“子宫颈阴道的”与单词“阴道的”可交换使用，并且包括阴道和子宫颈的所有肌肉和粘膜组织。
根据一个实施方案，本发明提供用于在受试者的粘膜组织中产生对抗人乳头状瘤病毒(HPV)相关疾病的免疫反应的方法，所述方法包括：a)给予所述受试者的肌肉或粘膜组织有效量的组合物，所述组合物包含由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70构成的第一疫苗构建体；和b)给予所述粘膜组织有效量的包含第二疫苗构建体的组合物。
在其它实施方案中，本发明提供用于在对其有需要的受试者中治疗子宫颈癌、其前期损害和其它HPV相关损害的方法，所述方法包括：a)给予所述受试者的肌肉或子宫颈阴道粘膜组织有效量的组合物，所述组合物包含由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70构成的第一疫苗构建体；和b)给予所述子宫颈阴道粘膜组织有效量的包含第二疫苗构建体的组合物。
根据一些实施方案，所述第二疫苗构建体可以是pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70或TA-HPV。
根据一个实施方案，所述第二疫苗构建体为TA-HPV。
本领域普通技术人员将理解的是，本发明的方法可用于方案的许多变动，并且不应限于任何具体的实施例。所述疫苗接种方案可随治疗而变化。根据一个实施方案，在给予所述第一疫苗构建体之后的5-30天内给予所述第二疫苗构建体。在另一个实施方案中，在给予所述第一疫苗构建体之后的6天内给予所述第二疫苗构建体。
在一些实施方案中，在给予所述第一疫苗构建体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天之后给予所述第二疫苗构建体。在一些实施方案中，在给予所述第一疫苗构建体之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天内给予所述第二疫苗构建体。
本领域普通技术人员将理解的是，本发明方法涉及在受试者的受感染粘膜组织中给予所述疫苗。在一些实施方案中，所述粘膜组织选自口腔粘膜、鼻粘膜、子宫颈阴道粘膜和肛门粘膜。在一个实施方案中，所述粘膜组织为子宫颈阴道粘膜。
人乳头瘤病毒为一种DNA肿瘤病毒，其导致皮肤和粘膜表面处的上皮增生。存在多于100种不同类型的所述病毒，包括感染人生殖道的约30-40株。其中，存在与子宫颈、外阴、阴道、阴茎、口腔、喉和肛门癌症相关的致癌性或高风险型(16、18、31、33、35、39、45、51、52和58)，以及与肛门生殖器湿疣或生殖器疣相关的非致癌性或低风险型(6、11、40、42、43、44和54)。HPV 16为最致癌的，导致所有子宫颈癌的几乎一半，以及HPV 16和18一起导致约70%的子宫颈癌。HPV 6和11为生殖器疣相关的最常见的毒株，并且导致约90%的这些损害。
根据一个实施方案，通过本发明方法治疗的HPV相关的疾病为癌症，包括子宫颈、外阴、阴道、阴茎、口腔、喉和肛门癌症。在一些实施方案中，所述癌症为子宫颈癌。
在一些实施方案中，所述受试者已被诊断患有HPV相关的疾病。
根据一些实施方案，本发明方法包括在受HPV感染的皮肤和粘膜表面处疫苗接种。
在一些实施方案中，所述受试者未被诊断患有HPV相关的疾病。
可将本发明的疫苗接种方案应用于受试者至少一次。在一些实施方案中，将所述疫苗接种方法重复至少一次。在一些实施方案中，未重复所述疫苗接种方法。
根据一些实施方案，本发明方法包括在给予所述第一疫苗构建体之后给予有效量的至少一种生物学活性物质。所述生物学活性物质可以是咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)。
在一些实施方案中，给予组合物包括注射所述组合物。将组合物给予至粘膜组织可包括将所述组合物注射到粘膜组织的粘膜下层区中。
本文所用的术语“受试者”可意指疑似患子宫颈癌或疑似具有患子宫颈瘤形成的增加的风险的受试者，并且可包括显示子宫颈上皮内瘤形成(CIN)、和/或低级别鳞状上皮内损害(LSIL)和/或高级别鳞状上皮内损害(HSIL)、或任何其它异常Pap涂片或细胞学试验的受试者。
本文所用的术语“受试者”亦可意指疑似患HPV感染或HPV相关疾病的受试者，并且亦包括曾暴露给HPV或已证实受任何变异株的HPV感染的受试者。
本文所用的术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(order Rodentia)的哺乳动物例如小鼠和仓鼠，以及兔形目(order Logomorpha)的哺乳动物例如兔。所述受试者可来自食肉目(order Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。或者，所述受试者可来自偶蹄目（order Artiodactyla），包括牛属动物(奶牛)和猪(猪)，或者是奇蹄目(order Perssodactyla)的，包括马属动物(马)。或者，所述受试者可以是灵长目的、Ceboid或Simoid (猴)，或者是类人目(order Anthropoids)的(人或猿)。所述受试者可以是人。
根据本发明的一个或多个实施方案，将理解的是，可能进行的癌症诊断的类型(使用本文提供的方法)不一定受限。对于本文的目的，所述癌症可以是任何癌症。本文所用的术语“癌症”意指通过异常或不受控制的细胞分裂导致的任何恶性生长或肿瘤，其可通过淋巴系统或血流扩散到身体的其它部分。
本文所用的术语“治疗”及其词干（words stemming），包括诊断性和预防性治疗，以及改善所述受试者病况或者所述受试者病况的至少一种症状的治疗，或者预防所述受试者的病况或病况的症状恶化的治疗。
本文所用的术语“治疗”和“预防”及其词干，并不一定意味着100%或完全治愈或预防。更确切地说，具有有不同程度的被本领域普通技术人员认为具有潜在益处或疗效的治疗或预防。在这方面，本发明方法可在受试者或受试者群体中提供任何量任何水平的癌症治疗或预防。此外，本发明提供的治疗或预防可包括治疗或预防待治疗或预防的例如癌症等疾病的一种或多种病况或症状。同样，对于本文的目的，“预防”可包括延迟所述疾病或者其症状或病况的发作。
在一个实施方案中，本发明的方法可包含与载体联合的pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV。所述载体优选为药学上可接受的载体。就药物组合物而言，所述载体可以是任何惯例使用的载体，并且仅受化学-物理考虑（例如溶解性以及不存在与所述活性化合物的反应性）和给予途径限制。本文所述的药学上可接受的载体，例如溶媒、辅剂、赋形剂和稀释剂，为本领域技术人员众所周知的并且为公众容易得到的。所述药学上可接受的载体可以是对所述活性物质而言为化学上惰性的载体以及在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。
载体的选择将部分地由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的化学性质决定，和由用于给予pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的具体方法决定。因此，存在本发明的药物组合物的多种合适的制剂。用于胃肠外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、子宫颈阴道内和腹膜内给予的下列制剂为示例性的并且不以任何方式限制。可使用多于一种途径给予pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV，并且在某些实例中，一种特殊途径可比另一种途径提供更即时且更有效的反应。
注射用制剂是符合本发明的。对用于注射用组合物的有效药物载体的要求为本领域普通技术人员众所周知的(参见，例如药剂学和药学实践 (Pharmaceutics and Pharmacy Practice)，J.B. Lippincott公司，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编辑，第238-250页 (1982)，和注射用药物 ASHP 手册 (ASHP Handbook on Injectable Drugs)，Trissel，第14版，(2007))。
对于本发明的目的，给予的pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的量或剂量，应足以在合理的时间范围内在受试者中产生例如治疗性或预防性反应。所述剂量将通过所述pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的功效及人的病况以及待治疗的人的体重决定。
主治医师可考虑多种因素来决定用以治疗每一个患者的pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的剂量，例如待给予的年龄、体重、综合健康、饮食、性别，给予途径以及待治疗病况的严重性。举例而言并不意图限制本发明，pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的剂量可以是给予待治疗的受试者的约1-10 mg的pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和约1 x 105-约2 x107pfu的TA-HPV。在一些实施方案中，所述剂量范围为约3 mg的pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和约1.6 x 107pfu的TA-HPV。
“活性物质”和“生物学活性物质”在本文中可交换使用，是指诱导所需的药理和/或生理效应的化学或生物化合物，其中所述效应可以是预防性或治疗性的。所述术语亦包括本文所具体提及的那些活性物质的药学上可接受的药理学上活性的衍生物，其包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药物、活性代谢物、类似物等。当使用术语“活性物质”、“药理学活性物质”和“药物”时，那么要理解的是本发明包括所述活性物质本身以及药学上可接受的药理学上活性的盐、酯、酰胺、前体药物、代谢物、类似物等。所述活性物质可以是生物实体，例如病毒或细胞，不论是天然存在的或经操作的，例如经转化的。
所述生物活性物质可随所述组合物的预期目的而大有不同。术语活性的为本领域公认的，是指在受试者中局部或系统地起作用的生物学上、生理学上或药理学上活性的物质的任何部分。生物学活性物质(可被称为“药物”)的实例描述于众所周知的文献参考，例如Merck索引(Merck Index)、内科医生案头参考(Physicians’ Desk Reference)和治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，并且其包括但不限于药剂；维生素；矿物补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或疾患的物质；影响身体的结构或功能的物质；或者前体药物，其在置于生理环境之后变得有生物活性或更有活性。
上面类别的有用的生物学活性物质的具体实例包括：抗肿瘤药，例如雄激素抑制剂、烷化剂、氮芥烷化剂、亚硝基脲烷化剂、抗代谢物、嘌呤类似物抗代谢物、嘧啶类似物抗代谢物、激素抗肿瘤药、天然抗肿瘤药、抗生素天然抗肿瘤药、卡铂和顺铂；亚硝基脲烷化抗肿瘤剂，例如卡莫司汀(BCNU)；抗代谢物抗肿瘤剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶类似物抗肿瘤剂，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨；激素抗肿瘤药，例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗肿瘤药，例如阿地白介素、白介素-2、多西他赛、依托泊苷、干扰素；紫杉醇、其它紫杉烷衍生物和维甲酸(ATRA)；抗生素天然抗肿瘤药，例如博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星和丝裂霉素；长春花生物碱天然抗肿瘤药，例如长春碱和长春新碱。
其它生物学活性物质可包括肽、蛋白质和其它大分子，例如白介素1-18，包括突变体和类似物；干扰素α、γ，以及可用于软骨再生的大分子、激素释放激素(LHRH)及类似物、促性腺激素释放激素转化生长因子(TGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；肿瘤坏死因子-α (TNFα)；神经生长因子(NGF)；生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织激活的成骨因子、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)；肝细胞生长因子(HGF)；胰岛素生长因子(IGF)；侵害抑制因子-2 (IIF-2)；骨形态发生蛋白1-7 (BMP 1-7)；促生长素抑制素；胸腺素-α-γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；和补体因子，以及所述因子的生物学活性类似物、片段和衍生物，例如生长因子。
根据一个实施方案，所述生物学活性物质为咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)。
根据一个或多个实施方案，所述pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA和TA-HPV疫苗通过注射、i.m.、i.p.、i.v.、皮下、子宫颈阴道内、基因枪等给予。
实施例
用于实施例 1-6 的材料和方法
小鼠。6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠购自国家癌症研究所(Frederick，MD)。所有动物规程均根据获准的方案并且依照对于适当使用和护理实验室动物的推荐进行。
细胞。表达HPV16 E6-E7蛋白的TC-1细胞和表达萤火虫萤光素酶基因的TC-1细胞(TC-1 luc)在本实验室中开发，并且已预先描述(Vaccine，25:7824-31，(2007))。
抗体和四聚体。荧光染料缀合的抗小鼠单克隆抗体(Ab) CD8a-APC、CD103-APC、α4ß7-APC购自eBiosciences；CD8A-FITC、7AAD购自BO Pharmingen；CCR9-FITC购自BioLegend；允许染色结合E-7肽的细胞的H2Db E-7四聚体，由国家变态反应和感染疾病研究所四聚体核心研究室提供。氯化铵溶液(ACK)购自Quality Biological Inc。
淋巴细胞制备。从小鼠的尾部血管获得血液并与PBS混合。将小鼠处安乐死并通过解剖取出器官。通过在37℃下酶法分散在RPMI 1640消化缓冲液中达1小时同时振荡来获得子宫颈阴道(子宫颈和阴道组织)细胞悬液。使子宫颈阴道细胞通过70-μM细胞滤网(Becton Dickinson)。将髂淋巴结和脾细胞悬液机械破裂并通过70-μM细胞滤网过滤。将血、子宫颈阴道、脾和淋巴结细胞悬液用RPMI/FBS 2%清洗并通过用氯化铵溶液处理去除红细胞。
免疫程序。在第0天(pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗，50 μg)和第7天(TA-HPV 1x107 PFU)用一系列的约1-50 μg/小鼠的pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和1x106-1x107 PFU/小鼠TA-HPV通过子宫颈阴道内或肌内途径免疫小鼠。在两种途径中注射的总体积均为50 μ1。在免疫直接将小鼠麻醉。
细胞表面染色和流式细胞术分析。所有染色均在4℃下在流动管(flow tube)中用300 μ1终体积的FACS缓冲液(PBS+2% FBS)进行1小时。为了避免通过表面Fc受体的非特异性抗体结合，将所有细胞与CD16/32小鼠BD Fc Block ™ (BD pharmingen)预孵育。在具有CELLQuest软件的Becton-Dickinson FACScan上进行分析(Becton Dickinson Immunocytometry System，Mountain View，CA)。
体内肿瘤防护和成像技术。将约2x104个TC-1 luc细胞注射到小鼠生殖道的粘膜下层区中。在肿瘤激发后的第2天(pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗)和第7天(TAHPV)接种小鼠。每周一次通过Xenogen成像系统中的生物发光监测生殖器肿瘤生长。简单说来，将D-萤光素用PBS溶解至7.8 mg/mL、过滤灭菌并储存于-80℃。通过i.p.注射(200 μl/小鼠，75mg/kg)给予小鼠D-萤光素并用异氟烷麻醉。使用Living Image采集和分析软件(Xenogen)在低温制冷IVIS系统上进行对萤光素酶的体内生物发光成像。之后将小鼠放到遮光摄像盒内的加温平台上，连续暴露给1%-2%异氟烷。在D-萤光素给予10分钟之后获取图像并成像2分钟。将来自生物发光细胞的光水平通过IVIS摄像系统探测，整合并数字化。使用Living Image 2.50软件(Xenogen)在子宫颈阴道周围标出来自所示图像的目标区域并将其按总光子计数定量。
统计分析。所有数据均表示为平均数±标准差(S.D.)并且代表至少两个独立实验。各数据点之间的比较使用Student's t-检验进行。使用非参数Mann-Whitney检验比较两个不同组。认为所有<0.05的p值是显著的。
实施例 1
与同源DNA-DNA初免-加强免疫方案相比，使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗初免接着TA-HPV加强免疫的疫苗接种引发更强的E7-特异性CD8+ T细胞反应。
首先试图使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA和TA-HPV疫苗的不同组合来确定产生抗原特异性CD8+ T细胞的最佳初免-加强免疫疫苗接种方案。使用以pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗接着TA-HPV的异源初免-加强免疫、以pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗的同源初免-加强免疫、仅TA-HPV接种C57BL/6小鼠(每组五只)或不进行疫苗接种。如在图1中所示，与同源初免-加强免疫疫苗接种或仅TA-HPV相比，所述异源初免-加强免疫方案产生总脾细胞中最大数量的分泌IFN-g的E7-特异性CD8+ T细胞。此数据表明，DNA初免接着基于牛痘苗的加强免疫，为产生激活的E7-特异性CD8+ T细胞的有效的初免-加强免疫方案。
实施例 2
与通过肌内注射的疫苗接种相比，通过子宫颈阴道内递送的使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA初免接着TA-HPV加强免疫的疫苗接种在子宫颈阴道中产生更大数量的E7-特异性CD8+ T细胞。
检验了由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗初免、TA-HPV加强免疫组成的疫苗接种方案的不同给予途径对产生抗原特异性CD8+ T细胞的影响。使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗接着六天后使用TA-HPV子宫颈阴道内(ICV)或肌内(IM)接种C57BL/6小鼠。TA-HPV疫苗接种一周后，使用载E7肽H-2Db四聚体染色通过流式细胞术分析对小鼠检测不同位置中的E7-特异性CD8+ T细胞。如在图2中所示，与那些未实验(naive)小鼠相比，使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗接着TA-HPV的 ICV和IM疫苗接种产生小鼠脾细胞中明显更高百分比的E7-特异性CD8+ T细胞。然而，通过IM和IVAG途径的疫苗接种之间似乎并无显著差异。图3显示与ICV接种的小鼠相比，使用IM pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV接种的小鼠产生外周血中显著更多的E7-特异性CD8+ T细胞。此外，与未实验小鼠相比，ICV接种的小鼠产生显著更多的E7-特异性CD8+ t细胞。相比之下，与IM接种的小鼠和未实验小鼠相比，使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的ICV疫苗接种在鼠子宫颈阴道中诱导最高百分比的E7-特异性CD8+ T细胞(图4)。总之，此数据表明，与通过肌内注射的疫苗接种相比，通过子宫颈阴道内递送的疫苗接种代表在子宫颈阴道中产生高数量的E7-特异性CD8+ T细胞的明显更有效的方法。
实施例 3
与肌内疫苗接种相比，使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗初免接着TA-HPV加强免疫的子宫颈阴道内疫苗接种在局部淋巴结中产生明显更高数量的E7-特异性CD8+ T细胞。
接着，研究了疫苗给予途径对局部淋巴结中的抗原特异性CD8+ T细胞的影响。使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗接着六天后使用TA-HPV ICV或IM接种C57BL/6小鼠。最终疫苗接种一周后，分离髂淋巴结(ILN)并使用载E7肽H-2Db四聚体染色通过流式细胞术分析检测E7-特异性CD8+ T细胞。如在图5中所示，本发明人发现，与IM接种的小鼠和未实验小鼠相比，使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的ICV接种的小鼠具有ILN中最高百分比的E7-特异性CD8+ T细胞。这些结果表明，与IM疫苗接种相比，ICV疫苗接种代表诱导有效的局部E7-特异性细胞介导的免疫反应的更有效方式。
实施例 4
使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗初免接着TA-HPV加强免疫的子宫颈阴道内疫苗接种诱导a4ß7和CCR9在E7-特异性CD8+ T细胞上的表达。
为了确定通过所述初免-加强免疫方案诱导的E7-特异性CD8+ T细胞是否为组织驻留记忆T细胞(Trm)，本发明人对其评价了组织特异性分子α4ß7和CCR9的表达。α4ß7为通过与粘膜地址素细胞粘附分子-1 (MAdCAM-1)的相互作用来起作用的粘膜相关的寻靶整联蛋白。其配体为CCL25的趋化因子受体CCR9亦涉及淋巴细胞在粘膜组织中的寻靶和停留，其通常在呼吸、胃肠和泌尿生殖组织的上皮中表达。如在图6中所示，在子宫颈阴道中的所有E7四聚体阳性细胞中，使用ICV pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV处理的小鼠具有最高百分比的表达a4ß7或CCR9的E7-特异性CD8+ T细胞。此外，ICV接种的小鼠在局部ILN中具有最高百分比的表达a4ß7或CCR9的 E7-特异性CD8+ T细胞 (图7)。这些数据表明，ICV疫苗接种为产生表达α4ß7或CCR9的抗原特异性CD8+ T细胞的有效方法。
实施例 5
使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA初免疫苗接着TA-HPV加强免疫的阴道内疫苗接种诱导α4ß7、CCR9和CD103在E7-特异性CD8+ T细胞上共表达。
为了确定所述ICV初免-加强免疫疫苗接种方案对粘膜组织驻留记忆T细胞(Trm)的局部和系统影响，检验了α4ß7、CCR9和CD103在已接种小鼠的脾和子宫颈阴道中的E7-特异性CD8+ T细胞上的表达。使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗接着TA-HPV ICV接种小鼠并通过流式细胞术分析其脾细胞和子宫颈阴道组织。如在图8中所示，与脾相比，在子宫颈阴道中a4ß7和CCR9二者在E7-特异性CD8+ T细胞上的表达明显更高。此数据表明，使用本发明的DNA-牛痘苗初免-加强免疫方案的ICV疫苗接种增加子宫颈阴道中E7-特异性CD8+ T细胞的存在，所述细胞具有与粘膜Trm一致的表面表型。
实施例 6
与肌内疫苗接种相比，使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA初免接着TA-HPV加强免疫的子宫颈阴道内疫苗接种产生明显改善的治疗性抗肿瘤效应。
此外，使用表达萤光素酶的TC-1肿瘤模型评价了经由不同途径给予本发明的初免-加强免疫方案的疗效。萤光素酶活性的水平代表小鼠中的肿瘤负荷。使用表达E7和萤光素酶的TC-1肿瘤细胞皮下激发C57BL/6小鼠。一天之后，用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗免疫小鼠并在6天之后，用TA-HPV免疫小鼠。在肿瘤激发之后的第7天和第14天通过发光成像对小鼠监测肿瘤生长。如在图9中所示，与接受IM疫苗接种或未接受疫苗接种的小鼠相比，在第14天接受使用pNGVL4a-sig/ E7(detox)/HSP70 DNA疫苗和TA-HPV的ICV疫苗接种的小鼠经历明显更强的抗肿瘤效应，如通过减少的发光所测量。ICV接种的小鼠在第14天时没有可检测到的发光，表明其根除了TC-1肿瘤细胞。这些数据表明，与通过IM注射的疫苗接种相比，通过ICV的疫苗接种在产生有效的治疗性抗肿瘤效应上更有效。
实施例7
肌内pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA初免接着子宫颈阴道内TA-HPV加强免疫，在脾和子宫颈阴道二者中诱导最高数量的E7-特异性CD8+ T细胞。
最后，评价了通过初免-加强免疫递送途径的不同组合诱导的系统(脾)和局部(子宫颈阴道) HPV E7特异性CD8+ T细胞介导的免疫反应。将C57BL/6小鼠(每组5只)以疫苗接种之间7天间隔肌内或子宫颈阴道内接种pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA (每只小鼠50μg)两次，接着在第二次DNA疫苗接种7天之后肌内或子宫颈阴道内TA-HPV加强免疫。在最终疫苗接种7天后，采集脾细胞和子宫颈阴道细胞并通过流式细胞术分析。图 10显示，IM DNA初免两次接着ICV TA-HPV加强免疫在子宫颈阴道和脾二者中引发最高的E7-特异性CD8+ T细胞产生。此外，ICV TA-HPV加强免疫(不论DNA初免的部位)得到更佳的E7-特异性CD8+ T细胞局部产生(图 10D)。尽管IM DNA初免接着IM TA-HPV加强免疫对于系统产生CD8+ T细胞为有效的，但此组合对于在子宫颈阴道中产生局部HPV E7-特异性CD8+ T细胞无效。总之，这些结果表明，IM DNA初免接着ICV TA-HPV加强免疫为在子宫颈阴道和脾二者中产生HPV E7特异性CD8+ T细胞的最合乎需要的组合。
在本研究中，本发明人所确定的是，与同源DNA-DNA初免-加强免疫方案相比，异源DNA-牛痘苗初免-加强免疫疫苗接种方案对于诱导E7-特异性CD8+ T细胞免疫反应为最佳的。本发明方法显示，与IM给予相比，使用TA-HPV牛痘苗的ICV给予途径，在脾、外周血、子宫颈阴道和局部淋巴结中产生更多的E7-特异性CD8+ T细胞。此外，本发明人出人意料地发现，通过使用治疗性牛痘苗的ICV疫苗接种诱导的这些E7-特异性CD8+ T细胞表达粘膜相关的寻靶整联蛋白α4ß7和CCR9，表明其与粘膜Trm的一致性。最后，证实的是，与IM接种的小鼠相比，使用pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA疫苗接着ICV TA-HPV接种的小鼠引发显著更有效的对抗TC-1肿瘤的治疗性抗肿瘤效应。总之，这些数据表明，对于控制HPV相关的疾病，本发明的经由子宫颈阴道内途径给予治疗性HPV疫苗在产生细胞介导的免疫反应上可为最有效的。
本发明的方法显示，经由子宫颈阴道内(intrcervicoavaginal)途径给予治疗性HPV疫苗产生具有粘膜Trm表型的抗原特异性CD8+ T细胞以及有效的抗肿瘤效应，其出人意料地更优于通过肌内疫苗接种产生的抗肿瘤效应。此外，本结果支持对采用IM pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 DNA初免接着ICV TA-HPV加强免疫的临床试验中的给予途径的即时临床翻译(clinical translation)。总之，所述结果表明，可通过改变疫苗接种途径来改善当前的治疗性HPV疫苗接种方案，以诱导Trm介导的免疫反应。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用结合到本文中，引用程度如同单独和具体地指出各参考文献通过引用结合并以其整体描述于本文中。
除非本文中另有指示或者文段明确反对，否则在描述本发明的文段中(特别是在下列权利要求的文段中)使用术语“一”、“一个”和“所述”以及类似的所指物，要理解为涵盖单数和复数二者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”要理解为开放式术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文另有指示，否则仅意图将本文中值的范围的陈述用作单独提及落入所述范围内的各独立值的速记法，并将各独立值并入说明书中，如同将其单独描述于本文中。除非本文另有指示或者文段另有明确反对，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有要求，否则本文提供的任何及所有实例或者示例性语句(如“例如”)的使用，仅意图其更好地阐述本发明且不造成对本发明范围的限制。不应将说明书中的任何言语理解为表示任何不要求保护的元素对于本发明的实施而言为必需的。
本文中描述了本发明的示例性实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模型。在阅读上述描述之后，所述实施方案的变动对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。本发明人预期技术娴熟的技术人员在适当时使用所述变动，以及本发明人意图以不同于本文具体所述的方式实施本发明。因此，本发明包括所公开主题的所有修改和等同物。此外，除非本文中另有指示或者文段另有明确反对，否则本发明包括上述元素在其全部可能变动中的所有组合。

Claims (25)

1. 一种用于在受试者的粘膜组织中产生对抗人乳头状瘤病毒(HPV)相关疾病的免疫反应的方法，所述方法包括：
a)给予所述受试者的肌肉或粘膜组织有效量的组合物，所述组合物包含由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70构成的第一疫苗构建体；和
b)给予所述粘膜组织有效量的包含第二疫苗构建体的组合物。
2. 权利要求1的方法，其中所述第二疫苗构建体为pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70或TA-HPV。
3. 权利要求2的方法，其中所述第二疫苗构建体为TA-HPV。
4. 前述权利要求中任一项的方法，其中在给予所述第一疫苗构建体之后5-30天之内给予所述第二疫苗构建体。
5. 权利要求4的方法，其中在给予所述第一疫苗构建体之后的6天之内给予所述第二疫苗构建体。
6. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述组织为粘膜组织，选自口腔粘膜、鼻粘膜、子宫颈阴道粘膜和肛门粘膜。
7. 权利要求6的方法，其中所述粘膜组织为子宫颈阴道粘膜。
8. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述HPV相关的疾病为癌症或者癌症的前期损害。
9. 权利要求8的方法，其中所述HPV相关的疾病为癌症，以及所述癌症为子宫颈癌。
10. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者已被诊断为患有HPV相关的疾病。
11. 权利要求10的方法，其中所述受试者已被诊断为患有子宫颈癌或癌症的前期损害。
12. 权利要求1-9中任一项的方法，其中所述受试者未被诊断患有HPV相关的疾病。
13. 前述权利要求中任一项的方法，其中给予组合物包括注射所述组合物。
14. 前述权利要求中任一项的方法，其中给予组合物到粘膜组织包括将所述组合物注射到所述粘膜组织的粘膜下层区中。
15. 一种用于在有需要的受试者中治疗子宫颈癌或癌症的前期损害的方法，所述方法包括：
a)给予所述受试者的子宫颈阴道肌肉或粘膜组织有效量的组合物，所述组合物包含由pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70构成的第一疫苗构建体；和
b)给予所述子宫颈阴道肌肉或粘膜组织有效量的包含第二疫苗构建体的组合物。
16. 权利要求15的方法，其中所述第二疫苗构建体为pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70或TA-HPV。
17. 权利要求16的方法，其中所述第二疫苗构建体为TA-HPV。
18. 权利要求15-17中任一项的方法，其中在给予所述第一疫苗构建体之后的5-30天之内给予所述第二疫苗构建体。
19. 权利要求18的方法，其中在给予所述第一疫苗构建体之后的6天之内给予所述第二疫苗构建体。
20. 权利要求15-19中任一项的方法，其中将所述方法重复至少一次。
21. 权利要求15-19中任一项的方法，其中不重复所述方法。
22. 权利要求15-21中任一项的方法，其中给予组合物包括注射所述组合物。
23. 权利要求15-22中任一项的方法，其中给予组合物到粘膜组织包括将所述组合物注射到所述粘膜组织的粘膜下层区中。
24. 前述权利要求中任一项的方法，其包括在给予所述第一疫苗构建体之后给予有效量的至少一种生物学活性物质。
25. 权利要求24的方法，其中所述生物学活性物质为咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)。
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