JP2016527316A - Hpv関連疾患の処置方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、治療用HPVワクチンを初回刺激−追加刺激レジメンで粘膜組織に投与し、それにより抗原特異的CD8+T細胞媒介性免疫応答およびCD8+T細胞における組織常在記憶T細胞(Trm)マーカーの発現を生じさせる方法を提供する。一部の実施形態では、本発明の方法において、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを初回刺激−追加刺激レジメンで使用し、これにより、頸腟路におけるものを含めた、感染粘膜組織へのワクチン接種により、当該組織および所属リンパ節において筋肉内ワクチン接種と比較して強力な抗腫瘍効果およびより有効な局所免疫応答が惹起されることが示される。さらに、Trm媒介性免疫応答の誘導を標的とすることは、特に治療用HPVワクチンに関して理想的な方法体系としての機能を果たし得る。
Description
関連出願
この出願は、2013年8月6日に出願された米国仮特許出願第61/862,768号(この内容は、参考として本明細書に援用される)への優先権の利益を主張する。
この出願は、2013年8月6日に出願された米国仮特許出願第61/862,768号(この内容は、参考として本明細書に援用される)への優先権の利益を主張する。
政府の利益についての声明
この発明は、NIHに付与された助成金番号CA098252およびCA114425の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
この発明は、NIHに付与された助成金番号CA098252およびCA114425の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
ヒトパピローマウイルス(HPV)は、子宮頸がん、外陰がん、腟がん、陰茎がん、口腔がん、咽頭がんおよび肛門がん、ならびに肛門生殖器コンジローマまたは性器いぼなどの非腫瘍形成性疾患(non−oncogenic disease)の主要な病原体である。子宮頸がんは世界的に3番目に多い女性のがんである。HPVが子宮頸がんの病原因子として同定されたことにより、確立されたHPV感染がHPVによる前がん性病変およびがん性病変に進行するのを阻害するための治療用HPVワクチンを開発する機会が生じている。2種のHPVウイルス腫瘍性タンパク質、E6およびE7が細胞の形質転換の誘導および維持に必要であり、HPV関連がんにおいて一貫して同時発現する。したがって、E6およびE7は治療用HPVワクチンを開発するための理想的な標的を代表する。
子宮頸がんは、子宮頸部の上皮で生じる細胞変化であり、ゆっくりと次第に進展する前駆病変(子宮頸部上皮内新形成(CIN))によって最初に明らかになり、これは、低悪性度の扁平上皮内病変と高悪性度の扁平上皮内病変(それぞれLSILおよびHSIL)に分類することができる。HSILの50%が最終的に子宮頸がんに進行する。ヒトパピローマウイルス(HPV)腫瘍性タンパク質によって媒介される細胞周期制御の変化が子宮頸がんにおける主要な分子作用機構である。HPV感染は極めて一般的であり、生殖可能な女性の生涯リスクは約80%である。しかし、大多数の女性では、HPVの型に関係なく感染が排除され、有害な健康への影響は生じない。子宮頸部の病変に最も頻繁に関与するHPVの型はHPV16およびHPV18であり、これらにより、合わせて子宮頸がんの症例の70%が引き起こされる。腫瘍形成性HPV感染は、子宮頸部上皮細胞の腫瘍形成性形質転換の因子として十分ではなくとも、必要なものである。ウイルス排除を導く有効な免疫応答などの追加的な補因子により、HPV感染が子宮頸がんに至るかどうかが決定される。
したがって、子宮頸がんを含めたHPV関連疾患に対するより良好な処置レジメンが依然として必要とされている。
ある実施形態によると、本発明は、被験体の粘膜組織におけるヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、a)被験体の筋組織または粘膜組織にpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70からなる第1のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびb)その後、被験体の粘膜組織に第2のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与し、それにより、被験体におけるHPV感染に対する免疫応答を引き出すステップを含む方法を提供する。
別の実施形態によると、本発明は、被験体における子宮頸がんを処置するための方法であって、a)被験体の筋肉または腟の粘膜組織にpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70からなる第1のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびb)その後、被験体の粘膜組織に第2のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与し、それにより、被験体における子宮頸がんに対する免疫応答を惹起するステップを含む方法を提供する。
本発明者らはこれまで、HPV−16 E7抗原および熱ショックタンパク質70(HSP70)と連結したシグナルペプチド(sig)からなるキメラタンパク質をコードする、治療用HPV DNAワクチン、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70の開発(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第10/555,669号)を含め、HPV関連疾患における使用のためにE6および/またはE7を標的とするDNAワクチンおよびワクシニアワクチンを使用してきた。さらに、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンを、高悪性度の上皮内病変を有する患者に対する臨床試験において使用し、これが安全であることが証明されている(Clin. Cancer Res.、15巻:361〜7頁(2009年))。現在、DNAワクチンであるpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70は、グレード3の子宮頸部上皮内新形成(NCT00788164)を有する患者における筋肉内へのDNAでの初回刺激およびワクシニアでの追加刺激レジメンに関して、組換え治療用HPVワクチンであるTA−HPVと組み合わせて使用されている(Sci. Transl. Med. 6巻、221ra13(2014年))。TA−HPVは、HPV−16/18のE6タンパク質およびE7タンパク質をコードする組換えワクシニアワクチンである。TA−HPVはいくつかの臨床試験において使用されており、安全であることが証明されている(Lancet、347巻:1523〜7頁(1996年))。そのように、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVは、初回刺激−追加刺激レジメンに使用するのに都合がよい。
最近、組織常在記憶T細胞(Trm)が感染症および免疫化に関与する局所免疫応答において重要な役割を果たすことが示された。そのように、Trmによりもたらされるロバストな防御免疫の活用を可能にする本発明の部位特異的ワクチン接種が特に粘膜腫瘍に対する理想的な方法体系として役立つものと本発明者らは現在考える。
本発明の方法によって、粘膜組織において生じるHPV関連疾患を制御するために本発明者らの治療用HPVワクチンによってTrmを生じさせるための独特の戦略を検討することが重要であることが示される。
一部の実施形態によると、本発明者らは、治療用HPVワクチンを初回刺激−追加刺激レジメンで腟内投与することの、全身および局所的な抗原特異的CD8+T細胞媒介性免疫応答の発生、ならびにCD8+T細胞におけるTrmマーカーの発現に対する効果を調査した。pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを使用し、腟内投与により、頸腟路および所属リンパ節においてより有効な局所免疫応答が惹起されることが見いだされた。重要なことに、初回刺激−追加刺激ワクチン接種により生成したE7特異的CD8+T細胞は粘膜組織に特異的なTrmのマーカーを発現した。したがって、本発明の方法により、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAおよびTA−HPVを使用する頸腟部内ワクチン接種レジメンにより、TC−1腫瘍モデルに対する強力なE7特異的Trm免疫応答および抗腫瘍効果が生じることが示された。本明細書で使用される場合、「頸腟部の」という用語は「腟の」という単語と互換的に使用され、腟および子宮頸部の全ての筋組織および粘膜組織を包含する。
ある実施形態によると、本発明は、被験体の粘膜組織におけるヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、
a)被験体の筋組織または粘膜組織にpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70からなる第1のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびb)粘膜組織に第2のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
a)被験体の筋組織または粘膜組織にpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70からなる第1のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびb)粘膜組織に第2のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体において子宮頸がん、その前駆病変および他のHPV関連病変を処置するための方法であって、a)被験体の筋肉または頸腟部の粘膜組織にpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70からなる第1のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびb)前記頸腟部の粘膜組織に第2のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態によると、第2のワクチン構築物は、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70またはTA−HPVであり得る。
ある実施形態によると、第2のワクチン構築物は、TA−HPVである。
本発明の方法は、多くのバリエーションのレジメンにおいて使用することができ、いかなる特定の例によっても限定されるべきではないことが当業者には理解されよう。ワクチン接種レジメンは処置によって変動し得る。ある実施形態によると、第2のワクチン構築物は、第1のワクチン構築物の投与後5〜30日以内に投与される。別の実施形態では、第2のワクチン構築物は、第1のワクチン構築物の投与後6日以内に投与される。
一部の実施形態では、第2のワクチン構築物は、第1のワクチン構築物の投与の1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後、9日後、10日後、11日後、12日後、13日後、14日後、15日後、16日後、17日後、18日後、19日後、20日後、21日後、22日後、23日後、24日後、25日後、26日後、27日後、28日後、29日後、または30日後に投与される。一部の実施形態では、第2のワクチン構築物は、第1のワクチン構築物の投与後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、または30日未満に投与される。
本発明の方法は、ワクチンを被験体の感染粘膜組織に投与することを対象とすることが当業者には理解されよう。一部の実施形態では、粘膜組織は、口腔粘膜、鼻粘膜、頸腟部粘膜および肛門粘膜からなる群より選択される。ある実施形態では、粘膜組織は、頸腟部粘膜である。
ヒトパピローマウイルスは、皮膚表面および粘膜表面における上皮の増殖を引き起こすDNA腫瘍ウイルスである。このウイルスには、ヒト生殖管に感染するおよそ30〜40種の株を含めた、100種を超える異なる型が存在する。これらには、子宮頸がん、外陰がん、腟がん、陰茎がん、口腔がん、咽頭がんおよび肛門がんに関連する腫瘍形成性または高リスク型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、および58)と、肛門生殖器コンジローマまたは性器いぼに関連する非腫瘍形成性または低リスク型(6、11、40、42、43、44、および54)が存在する。HPV16が最も腫瘍形成性が高く、全ての子宮頸がんのほぼ半分を占め、HPV16とHPV18を合わせると子宮頸がんのおよそ70%を占める。HPV6およびHPV11は性器いぼに関連する最も一般的な株であり、これらの病変のおよそ90%に関与する。
ある実施形態によると、本発明の方法により処置されるHPV関連疾患は、子宮頸がん、外陰がん、腟がん、陰茎がん、口腔がん、咽頭がんおよび肛門がんを含めたがんである。一部の実施形態では、がんは子宮頸がんである。
一部の実施形態では、被験体は、HPV関連疾患であると診断されている。
一部の実施形態によると、本発明の方法は、HPVに感染している皮膚表面および粘膜表面にワクチン接種することを含む。
一部の実施形態では、被験体は、HPV関連疾患であると診断されていない。
本発明のワクチン接種レジメンは、被験体に少なくとも1回適用することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種方法は、少なくとももう1回繰り返される。一部の実施形態では、ワクチン接種方法は、繰り返されない。
一部の実施形態によると、本発明の方法は、第1のワクチン構築物を投与した後に、少なくとも1種の生物学的に活性な作用因子の有効量を投与するステップを含む。生物学的に活性な作用因子は、イミキモド(1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−4−アミン)であってよい。
一部の実施形態では、組成物を投与するステップは、組成物を注射することを含む。組成物を粘膜組織に投与するステップは、組成物を粘膜組織の粘膜下領域に注射することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、子宮頸がんを有する疑いがあるまたは子宮頸部新形成を有するリスクが上昇している疑いがある被験体を意味し得、子宮頸部上皮内新形成(CIN)、ならびに/または低グレードの扁平上皮内病変(LSIL)および/もしくは高グレードの扁平上皮内病変(HSIL)、または任意の他のPap塗抹標本または細胞学的検査の異常を示す患者を含み得る。
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、HPV感染またはHPV関連疾患を有する疑いがある被験体も意味し得、HPVに曝露しているか、または任意のバリアント株のHPVへの感染の証拠を有する被験体も包含する。
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、これだけに限定されないが、マウスおよびハムスターなどのRodentia目の哺乳動物、ならびにウサギなどのLogomorpha目の哺乳動物を含めた任意の哺乳動物を指す。被験体は、Feline(ネコ)およびCanine(イヌ)を含めたCarnivora目のものであってよい。あるいは、被験体は、Bovine(ウシ)およびSwine(ブタ)を含めたArtiodactyla目のもの、またはEquine(ウマ)を含めたPerssodactyla目のものであってよい。あるいは、被験体は、Primate目、Ceboid目、もしくはSimoid目(サル)のもの、またはAnthropoid目(ヒトおよび類人猿)のものであってよい。被験体はヒトであってよい。
本発明の1つまたは複数の実施形態によると、本明細書において提供される方法を使用して成されるがん診断の種類は、必ずしも限定されるものではないことが理解されよう。本発明の目的に関して、がんは任意のがんであってよい。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、リンパ系または血流を通じて身体の他の部分に拡散し得る、異常なおよび制御されていない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖または腫瘍を意味する。
本明細書で使用される場合、「処置する」という用語ならびにそれから派生する単語は、診断的処置および予防的処置、ならびに被験体の状態もしくは被験体の状態の少なくとも1つの症状を改善するためまたは被験体の状態もしくは状態の症状が悪化するのを予防するための処置を包含する。
「処置する」および「予防する」という用語ならびにそれから派生する単語は、本明細書で使用される場合、必ずしも100%または完全な処置または予防を意味するものではない。むしろ、潜在的な利益または治療効果があると当業者に認識される処置または予防の程度は様々である。この点において、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの、被験体または被験体の集団におけるがんの処置または予防を提供し得る。さらに、本発明の方法により提供される処置または予防は、処置または予防される疾患、例えばがんの1つまたは複数の状態または症状の処置または予防を含み得る。また、本発明の目的に関しては、「予防」とは、疾患、またはその症状もしくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。
ある実施形態では、本発明の方法は、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを担体と併せて含み得る。担体は薬学的に許容される担体であることが好ましい。医薬組成物に関して、担体は、慣習的に使用される担体のいずれであってもよく、溶解度および活性化合物(複数可)との反応性がないことなどの、物理化学上の検討事項によって、ならびに投与経路によってのみ限定される。本明細書に記載の薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容される担体は、活性な作用因子(複数可)に対して化学的に不活性なもの、および使用の条件下で有害な副作用も毒性もないものであってよい。
担体の選択は、一部において、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVの化学的性質によって、ならびにpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを投与するために使用する特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。以下の非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、頸腟部内投与および腹腔内投与用の製剤は例示的なものであり、決して限定的なものではない。pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを投与するために2つ以上の経路を使用することができ、特定の例では、特定の経路により、別の経路よりも速やかかつ有効な応答がもたらされ得る。
注射製剤は本発明によるものである。注射用組成物に対する有効な医薬担体に関する要件は当業者に周知である(例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice、J.B. Lippincott Company、Philadelphia、PA、BankerおよびChalmers編、238〜250頁(1982年)、およびASHP Handbook on Injectable Drugs、Trissel、第14版、(2007年)を参照されたい)。
本発明の目的に関して、投与するpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVの量または用量は、例えば治療的または予防的応答を、被験体において妥当な時間枠にわたってもたらすために十分なものであるべきである。用量は、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVの有効性およびヒトの状態、ならびに処置されるヒトの体重によって決定される。
主治医は、個々の患者それぞれを処置するために用いるpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVの投薬量を、年齢、体重、全体的な健康、食事、性別、投与されるもの、投与経路、および処置される状態の重症度などの種々の因子を考慮して決定することができる。例として、また本発明を限定するものではなく、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVの用量は、処置される被験体に対して、約1〜10mgのpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンと約1×105〜約2×107pfuのTA−HPVであり得る。一部の実施形態では、投薬量範囲は約3mgのpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンと約1.6×107pfuのTA−HPVである。
「活性な作用因子」および「生物学的に活性な作用因子」は、本明細書では互換的に使用され、所望の薬理効果および/または生理効果を誘導する化学的または生物学的な化合物を指し、その効果は予防的なものであっても治療的なものであってもよい。この用語は、本明細書で具体的に記載されている活性な作用因子の、これだけに限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、類似体などを含めた、薬学的に許容される、薬理学的に活性な誘導体も包含する。「活性な作用因子」、「薬理学的に活性な作用因子」および「薬物」という用語が使用されている場合には、本発明が、活性な作用因子それ自体、ならびに薬学的に許容される、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などを包含することが理解されるべきである。活性な作用因子は、天然に存在するものであるか、形質転換されたものなどの操作されたものであるかにかかわらず、ウイルスまたは細胞などの生物学的実体であってよい。
生物学的に活性な作用因子は、組成物の意図された目的によって広範に変動し得る。活性なという用語は当技術分野で認知されており、被験体において局所的にまたは全身的に作用する、生物学的に活性な、生理学的に活性な、または薬理学的に活性な物質である任意の部分を指す。「薬物」と称することができる生物学的に活性な作用因子の例は、Merck Index、Physicians’ Desk Reference、およびPharmacological Basis of Therapeuticsなどの周知の参考文献に記載されており、それらとしては、これらに限定されないが、医薬;ビタミン;ミネラルサプリメント;疾患もしくは疾病の処置、予防、診断、治癒もしくは緩和のために使用される物質;身体の構造もしくは機能に影響を及ぼす物質;または生理的環境に置かれた後に生物学的に活性になる、もしくはより活性になるプロドラッグが挙げられる。
上記のカテゴリーの有用な生物学的に活性な作用因子の特定の例としては、アンドロゲン阻害剤、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤、ニトロソウレアアルキル化剤、代謝拮抗剤、プリン類似体代謝拮抗剤、ピリミジン類似体代謝拮抗剤、ホルモン性抗新生物薬、天然抗新生物薬、抗菌性天然抗新生物薬、カルボプラチンおよびシスプラチンなどの抗新生物薬;カルムスチン(BCNU)などのニトロソウレアアルキル化抗新生物剤;メトトレキサートなどの代謝拮抗抗新生物剤;フルオロウラシル(5−FU)およびゲムシタビンなどのピリミジン類似体抗新生物剤;ゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェンなどのホルモン性抗新生物薬;アルデスロイキン、インターロイキン2、ドセタキセル、エトポシド、インターフェロン;パクリタキセル、他のタキサン誘導体、およびトレチノイン(ATRA)などの天然抗新生物薬;ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびマイトマイシンなどの抗菌性天然抗新生物薬;ビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド天然抗新生物薬が挙げられる。
他の生物学的に活性な作用因子としては、変異体および類似体を含めた、ペプチド、タンパク質、および他の大きな分子、例えばインターロイキン1〜18など;軟骨再生に対して有用であり得るインターフェロンα、γ、ホルモン放出ホルモン(LHRH)および類似体、ゴナドトロピン放出ホルモン形質転換増殖因子(TGF);線維芽細胞増殖因子(FGF);腫瘍壊死因子−α(TNFα);神経増殖因子(NGF);成長ホルモン放出因子(GHRF)、上皮増殖因子(EGF)、結合組織活性化骨形成因子(connective tissue activated osteogenic factor)、線維芽細胞増殖因子相同因子(FGFHF);肝細胞増殖因子(HGF);インスリン増殖因子(IGF);浸潤阻害因子(invasion inhibiting factor)−2(IIF−2);骨形成タンパク質 1〜7(BMP1〜7);ソマトスタチン;チモシン−α−γ−グロブリン;スーパーオキシドジスムターゼ(SOD);および補体因子、ならびにそのような因子、例えば、増殖因子の生物学的に活性な類似体、断片、および誘導体を挙げることができる。
ある実施形態によると、生物学的に活性な作用因子は、イミキモド(1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−4−アミン)である。
1つまたは複数の実施形態によると、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAおよびTA−HPVワクチンは注射、i.m.、i.p.、i.v.、皮下、頸腟部内、遺伝子銃などによってもたらされる。
実施例1〜6の材料および方法
マウス。6週齢〜8週齢の雌C57BL/6マウスをNational Cancer Institute(Frederick、MD)から購入した。動物に関する手順は全て認可されたプロトコールに従い、また、実験動物の適切な使用および世話に関する推奨に従って実施した。
マウス。6週齢〜8週齢の雌C57BL/6マウスをNational Cancer Institute(Frederick、MD)から購入した。動物に関する手順は全て認可されたプロトコールに従い、また、実験動物の適切な使用および世話に関する推奨に従って実施した。
細胞。HPV16 E6−E7タンパク質を発現するTC−1細胞およびホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するTC−1細胞(TC−1 luc)は本発明者らの研究室で開発し、以前に記載したものである(Vaccine、25巻:7824〜31頁、(2007年))。
抗体および四量体。蛍光色素と結合体化した抗マウスモノクローナル抗体(Ab)CD8a−APC、CD103−APC、α4β7−APCはeBiosciencesから購入し、CD8A−FITC、7AADはBO Pharmingenから購入し、CCR9−FITCはBioLegendから購入し、E−7ペプチドに結合する細胞の染色を可能にするH2Db E−7四量体はNational Institute of Allergy and Infectious Diseases tetramer core facilityから提供された。塩化アンモニウム溶液(ACK)はQuality Biological Incから購入した。
リンパ球の調製。マウスの尾部血管から血液を得、PBSと混合した。マウスを安楽死させ、切開により器官を取り出した。RPMI 1640消化緩衝液中、37℃で1時間、振とうしながら酵素的に分散させることによって頸腟部(子宮頸部および腟の組織)細胞浮遊液を得た。頸腟部細胞を、70μMの細胞ストレーナー(Becton Dickinson)を通過させた。腸骨リンパ節および脾臓細胞浮遊液を機械的に破壊し、70μMの細胞ストレーナーを通して濾過した。血液細胞浮遊液、頸腟部細胞浮遊液、脾臓細胞浮遊液およびリンパ節細胞浮遊液をRPMI/FBS2%中で洗浄し、塩化アンモニウム溶液を用いた処理によって赤血球を除いた。
免疫化手順。マウスを、0日目(pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン、50μg)および7日目(TA−HPV、1×107PFU)に、マウス当たり約1〜50μgの範囲のpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよび1×106〜1×107PFU/マウスTA−HPVを用いて頸腟部内経路または筋肉内経路によって免疫化した。注射の総体積はどちらの経路でも50μlであった。マウスは免疫化前に麻酔した。
細胞表面染色およびフローサイトメトリー分析。全ての染色を、流管中、最終体積300μlのFACS緩衝液(PBS+2%FBS)中4℃で1時間実施した。表面Fc受容体による非特異的な抗体結合を回避するために、全ての細胞をCD16/32マウスBD Fc Block(商標)(BD pharmingen)と一緒にプレインキュベートした。Becton−Dickinson FACScan with CELLQuest softare(Becton Dickinson Immunocytometry System、Mountain View、CA)で解析を実施した。
in vivoにおける腫瘍保護および画像化技術。約2×104個のTC−1 luc細胞をマウスの生殖管の粘膜下領域に注射した。マウスに、腫瘍による攻撃後2日目(pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン)および7日目(TAHPV)にワクチン接種を行った。生殖器の腫瘍の成長を週に1回、Xenogen画像化システムにおいて生物発光によってモニターした。簡単に述べると、D−ルシフェリンをPBS中に7.8mg/mLまで溶解させ、濾過滅菌し、−80℃で保管した。マウスにD−ルシフェリンをi.p.注射によって与え(マウス当たり200μl、75mg/kg)、イソフルランで麻酔した。極低温に冷却したIVIS systemでLiving Image acquisitionおよびanalysisソフトウェア(Xenogen)を使用してルシフェラーゼについてのin vivoにおける生物発光画像化を行った。次いで、マウスを、光を通さないカメラボックスの内側の温めた台に載せ、1%〜2%イソフルランに継続的に曝露させた。D−ルシフェリン投与の10分後に画像を取得し、2分にわたって画像化した。生物発光細胞からの光のレベルをIVIS camera systemによって検出し、統合し、デジタル化した。表示された画像からの目的の領域を頸腟路周辺に指定し、Living Image 2.50ソフトウェア(Xenogen)を使用して総光子数として定量化した。
統計解析。データは全て平均±標準偏差(S.D.)として表されており、少なくとも2つの別々の実験の代表的なものである。個々のデータ点間の比較はスチューデントのt検定を使用して行った。2つの異なる群を比較するためにはノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用した。全てp値<0.05を有意であるとみなした。
(実施例1)
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いたワクチン接種により、同種DNA−DNA初回刺激−追加刺激レジメンと比較してより強力なE7特異的CD8+T細胞応答が惹起される。
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いたワクチン接種により、同種DNA−DNA初回刺激−追加刺激レジメンと比較してより強力なE7特異的CD8+T細胞応答が惹起される。
最初の狙いはpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAおよびTA−HPVワクチンの種々の組合せを使用して抗原特異的CD8+T細胞を生成させるために最適な初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンを決定することであった。C57BL/6マウス(群当たり5匹)に対して、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン、続いてTA−HPVを用いる異種初回刺激−追加刺激を用いてワクチン接種を行ったか、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンを用いる同種初回刺激−追加刺激を用いてワクチン接種を行ったか、TA−HPVを単独で用いてワクチン接種を行ったか、またはワクチン接種を行わなかった。図1に示されている通り、異種初回刺激−追加刺激レジメンでは、同種初回刺激−追加刺激ワクチン接種またはTA−HPV単独と比較して、総脾細胞の中で生成したIFN−g分泌E7特異的CD8+T細胞の数が最大であった。このデータにより、DNAでの初回刺激、続いてワクシニアに基づく追加刺激が、活性化されたE7特異的CD8+T細胞を生成させるために有効な初回刺激−追加刺激レジメンであることが示唆される。
(実施例2)
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を頸腟部内送達により用いたワクチン接種では、筋肉内注射によるワクチン接種と比較してより多数のE7特異的CD8+T細胞が頸腟路において生成する。
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を頸腟部内送達により用いたワクチン接種では、筋肉内注射によるワクチン接種と比較してより多数のE7特異的CD8+T細胞が頸腟路において生成する。
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、TA−HPVでの追加刺激からなるワクチン接種レジメンに関して、異なる投与経路の抗原特異的CD8+T細胞の生成に対する影響を調査した。C57BL/6マウスに対して、頸腟部内(ICV)または筋肉内(IM)のいずれかで、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン、続いて、6日後にTA−HPVを用いてワクチン接種を行った。TA−HPVワクチン接種の1週間後、マウスを、E7ペプチド負荷H−2Db四量体染色を使用したフローサイトメトリー分析により種々の位置におけるE7特異的CD8+T細胞について試験した。図2に示されている通り、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン、続いてTA−HPVを用いたICVによるワクチン接種およびIMによるワクチン接種では、ナイーブマウスのものと比較して、マウスの脾細胞の中で生成したE7特異的CD8+T細胞の百分率が有意に高かった。しかし、IM経路によるワクチン接種とIVAG経路によるワクチン接種の間に有意差はないと思われた。図3には、IMによりpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを用いてワクチン接種を行ったマウスでは、ICVによるワクチン接種を行ったマウスと比較して、末梢血中に生成したE7特異的CD8+T細胞が有意に多かった。さらに、ICVによるワクチン接種を行ったマウスでは、生成したE7特異的CD8+T細胞がナイーブマウスよりも有意に多かった。対照的に、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを用いたICVによるワクチン接種では、IMによるワクチン接種を行ったマウスおよびナイーブマウスと比較して、マウス頸腟路において誘導されたE7特異的CD8+T細胞の百分率が最も高かった(図4)。総合すると、このデータにより、頸腟路において多くのE7特異的CD8+T細胞を生成させるためには、頸腟部内送達によるワクチン接種が筋肉内注射によるワクチン接種と比較して有意に効率が高い方法であることが示される。
(実施例3)
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種では、所属リンパ節において生成するE7特異的CD8+T細胞の数が筋肉内ワクチン接種よりも有意に多い。
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種では、所属リンパ節において生成するE7特異的CD8+T細胞の数が筋肉内ワクチン接種よりも有意に多い。
次に、ワクチン投与経路の、所属リンパ節における抗原特異的CD8+T細胞に対する影響を試験した。C57BL/6マウスに対して、ICVまたはIMのいずれかで、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン、続いて、6日後にTA−HPVを用いてワクチン接種を行った。最後のワクチン接種の1週間後、腸骨リンパ節(ILN)を単離し、E7特異的CD8+T細胞について、E7ペプチド負荷H−2Db四量体染色を使用してフローサイトメトリー分析によって試験した。図5に示されている通り、本発明者らは、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを用いてICVによるワクチン接種を行ったマウスでは、IMによるワクチン接種を行ったマウスおよびナイーブマウスと比較して、ILNにおけるE7特異的CD8+T細胞の百分率が最も高いことを見いだした。これらの結果により、強力な局所E7特異的細胞媒介性免疫応答を誘導するためには、ICVによるワクチン接種がIMによるワクチン接種と比較してより効率の高いやり方であることが示される。
(実施例4)
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種により、E7特異的CD8+T細胞におけるa4β7およびCCR9の発現が誘導される。
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種により、E7特異的CD8+T細胞におけるa4β7およびCCR9の発現が誘導される。
初回刺激−追加刺激レジメンによって誘導されるE7特異的CD8+T細胞が組織常在記憶T細胞(Trm)であるかどうかを決定するために、本発明者らは、これらを、組織特異的分子であるα4β7およびCCR9の発現について評価した。α4β7は、粘膜アドレシン細胞接着分子−1(MAdCAM−1)と相互作用することによって機能する粘膜関連ホーミングインテグリンである。リガンドがCCL25であり、一般に呼吸器、胃腸および泌尿生殖器の組織の上皮に発現するケモカイン受容体であるCCR9もリンパ球の粘膜組織へのホーミングおよび保持に関与する。図6に示されている通り、ICVによりpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを用いて処置したマウスでは、頸腟路における全てのE7四量体陽性細胞の中で、a4β7またはCCR9を発現するE7特異的CD8+T細胞の百分率が最も高かった。さらに、ICVによるワクチン接種を行ったマウスでは、所属ILNにおいてa4β7またはCCR9を発現するE7特異的CD8+T細胞の百分率が最も高かった(図7)。これらのデータにより、α4β7またはCCR9を発現する抗原特異的CD8+T細胞を生成させるためにはICVによるワクチン接種が有効な方法であることが示される。
(実施例5)
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いた腟内ワクチン接種により、E7特異的CD8+T細胞におけるα4β7、CCR9およびCD103の同時発現が誘導される。
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンでの初回刺激、続いてTA−HPVでの追加刺激を用いた腟内ワクチン接種により、E7特異的CD8+T細胞におけるα4β7、CCR9およびCD103の同時発現が誘導される。
ICVでの初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンの、局所的および全身的な粘膜組織常在記憶T細胞(Trm)に対する影響を決定するために、ワクチン接種を行ったマウスの脾臓および頸腟路におけるE7特異的CD8+T細胞でのa4β7、CCR9およびCD103の発現を調査した。マウスに対して、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン、続いてTA−HPVを用いてICVによりワクチン接種を行い、それらの脾細胞および頸腟部組織をフローサイトメトリーによって分析した。図8に示されている通り、E7特異的CD8+T細胞でのa4β7発現とCCR9発現の両方が頸腟路において脾臓と比較して有意に高かった。このデータにより、本発明者らのDNA−ワクシニア初回刺激−追加刺激レジメンを用いたICVによるワクチン接種により、頸腟路内の粘膜Trmのものと一致する表面表現型を有するE7特異的CD8+T細胞の存在が増加することが示唆される。
(実施例6)
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAでの初回刺激、続いてTAHPVでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種により、筋肉内ワクチン接種と比較して治療的な抗腫瘍効果が有意に改善される。
pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAでの初回刺激、続いてTAHPVでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種により、筋肉内ワクチン接種と比較して治療的な抗腫瘍効果が有意に改善される。
さらに、異なる経路によって投与した本発明の初回刺激−追加刺激レジメンの治療効果を、ルシフェラーゼ発現TC−1腫瘍モデルを使用して評価した。ルシフェラーゼ活性のレベルはマウスにおける腫瘍負荷量を示す。C57BL/6マウスに対して、E7発現TC−1腫瘍細胞およびルシフェラーゼ発現TC−1腫瘍細胞を用いて皮下に攻撃を行った。1日後に、マウスを、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンを用いて免疫化し、6日後に、マウスを、TA−HPVを用いて免疫化した。腫瘍による攻撃後7日目および14日目にマウスを腫瘍の成長について発光画像化によってモニターした。図9に示されている通り、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチンおよびTA−HPVを用いたICVによるワクチン接種を受けたマウスでは、14日目に、IMによるワクチン接種を受けたマウスまたはワクチン接種を受けなかったマウスと比較して、発光の減少によって測定される抗腫瘍効果が有意に大きかった。ICVによるワクチン接種を行ったマウスでは、14日目には検出可能な発光がなく、これにより、TC−1腫瘍細胞が根絶されたことが示唆される。これらのデータにより、強力な治療的な抗腫瘍効果の発生に関して、ICVによるワクチン接種がIM注射によるワクチン接種と比較してより効率的であることが示される。
(実施例7)
筋肉内pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAでの初回刺激、続いて頸腟部内TA−HPVでの追加刺激により誘導されるE7特異的CD8+T細胞の数は脾臓と頸腟路のどちらにおいても最も多い。
筋肉内pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAでの初回刺激、続いて頸腟部内TA−HPVでの追加刺激により誘導されるE7特異的CD8+T細胞の数は脾臓と頸腟路のどちらにおいても最も多い。
最後に、初回刺激−追加刺激送達経路の異なる組合せによって誘導される全身(脾臓)および局所(頸腟路)HPV E7特異的CD8+T細胞媒介性免疫応答を評価した。C57BL/6マウス(群当たり5匹)に対して、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNA(マウス当たり50μg)を用いて筋肉内または頸腟部内に、ワクチン接種間に7日間の間隔を空けて2回ワクチン接種を行い、続いて、2回目のDNAワクチン接種の7日後に、筋肉内または頸腟部内にTA−HPVでの追加刺激を行った。最後のワクチン接種の7日後に脾細胞および頸腟部細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析した。図10には、2回のIMによるDNAでの初回刺激、続いてICVによるTA−HPVでの追加刺激により、頸腟路と脾臓のどちらにおいても最も高いE7特異的CD8+T細胞産生が誘発されることが示されている。さらに、DNAでの初回刺激の部位にかかわらず、ICVによるTA−HPVでの追加刺激により、E7特異的CD8+T細胞の優れた局所的産生が生じた(図10D)。CD8+T細胞の全身産生のためにはIMによるDNAでの初回刺激、続いてIMによるTA−HPVでの追加刺激が有効であるが、この組合せは、頸腟路における局所HPV E7特異的CD8+T細胞の産生には有効ではない。総合すると、これらの結果により、頸腟路と脾臓の両方においてHPV E7特異的CD8+T細胞を生成するためには、IMによるDNAでの初回刺激、続いてICVによるTA−HPVでの追加刺激が最も望ましい組合せであることが示唆される。
本試験では、本発明者らは、E7特異的CD8+T細胞免疫応答を誘導するためには、同種DNA−DNA初回刺激−追加刺激レジメンと比較して、異種DNA−ワクシニア初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンが最適であることを同定した。本発明の方法では、TA−HPVワクシニアを用いたICV投与経路では、IM投与と比較して、脾臓、末梢血、頸腟路および所属リンパ節において生成するE7特異的CD8+T細胞がより多いことが示される。さらに、本発明者らは、驚いたことに、これらの治療用ワクシニアワクチンを用いたICVによるワクチン接種によって誘導されるE7特異的CD8+T細胞が粘膜関連ホーミングインテグリンであるα4β7およびCCR9を発現し、これにより、それらが粘膜Trmと一致することが示されることを見いだした。最後に、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAワクチン、続いてICVによりTA−HPVを用いてワクチン接種を行ったマウスでは、TC−1腫瘍に対して、IMによりワクチン接種を行ったマウスと比較して有意により強力な治療的な抗腫瘍効果が惹起されることが実証された。総合すると、これらのデータにより、HPV関連疾患を制御するための細胞媒介性免疫応答を生じさせるためには、治療用HPVワクチンを本発明の頸腟部内経路によって投与することが最も有効であり得ることが示される。
本発明の方法では、治療用HPVワクチンを頸腟内経路によって投与することにより、粘膜Trm表現型を有する抗原特異的CD8+T細胞、ならびに、驚いたことに筋肉内ワクチン接種によって生じるものよりも優れた強力な抗腫瘍効果が生じることが示される。さらに、本結果により、当該投与経路の、IMによるpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70 DNAでの初回刺激、続いてICVによるTA−HPVでの追加刺激を使用する臨床試験への即時の臨床的変換が支持される。結論として、結果により、Trm媒介性免疫応答が誘導されるようにワクチン接種経路を改変することによって現行の治療用HPVワクチン接種レジメンを改善することができることが示されている。
本明細書において引用されている刊行物、特許出願、および特許を含めた参考文献は全て、これによって、参考文献のそれぞれが個別にかつ明確に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じく参照により組み込まれる。
「1つの(a)」および「1つの(an)」および「その(the)」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、本発明の記載に関しては(特に以下の特許請求の範囲と関連して)、本明細書において特に指定がある場合、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」および「含有する(containing)」という用語は、特に断りのない限り、制約のない用語である(すなわち、「これらに限定されないが、〜が挙げられる」を意味する)と解釈されるべきである。本明細書では、値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指定のない限りただ単にその範囲内に入る別々の値のそれぞれについて個々に参照する簡潔な方法としての機能を果たすものとし、別々の値のそれぞれが、それが本明細書において個々に列挙されたのと同じく本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法は全て、本明細書において別段の指定がある場合、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書において提供される任意のかつ全ての例、または例示的な言葉(例えば、「などの(such as)」)の使用は、ただ単に本発明をよりよく照らすためのものであり、別段特許請求されていない限り、本発明の範囲に対する限定を提起するものではない。本明細書のどの言葉も、任意の特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
本発明を実行するための本発明者らに公知の最良の方式を含めた、本発明の例示的な実施形態が本明細書に記載されている。それらの実施形態の変形は前述の説明を読めば当業者には明らかになろう。本発明者らは、そのような変形を必要に応じて当業者が使用することを予想し、本発明者らは、本明細書で具体的に記載されているものとは別のやり方で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、開示されている主題の改変および等価物を全て包含する。さらに、本明細書において別段の指定がある場合、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、その可能性のある変形全てにおける上記の要素の任意の組合せが本発明に包含される。
Claims (25)
- 被験体の粘膜組織におけるヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、前記方法は、以下:
a)前記被験体の筋組織または粘膜組織にpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70からなる第1のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、および
b)前記粘膜組織に第2のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ
を包含する、方法。 - 前記第2のワクチン構築物が、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70またはTA−HPVである、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のワクチン構築物が、TA−HPVである、請求項2に記載の方法。
- 前記第2のワクチン構築物が、前記第1のワクチン構築物の投与後5〜30日以内に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のワクチン構築物が、前記第1のワクチン構築物の投与後6日以内に投与される、請求項4に記載の方法。
- 前記組織が、口腔粘膜、鼻粘膜、頸腟部粘膜および肛門粘膜からなる群より選択される粘膜組織である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粘膜組織が、前記頸腟部粘膜である、請求項6に記載の方法。
- 前記HPV関連疾患が、がんまたはがんの前駆病変である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HPV関連疾患が、がんであり、前記がんが、子宮頸がんである、請求項8に記載の方法。
- 前記被験体が、HPV関連疾患であると診断されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が、子宮頸がんまたはがんの前駆病変であると診断されている、請求項10に記載の方法。
- 前記被験体が、HPV関連疾患であると診断されていない、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物を投与するステップが、前記組成物を注射することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 粘膜組織に組成物を投与するステップが、前記組成物を前記粘膜組織の粘膜下領域内に注射することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 子宮頸がんまたはがんの前駆病変の処置を必要とする被験体において子宮頸がんまたはがんの前駆病変を処置するための方法であって、前記方法は、以下:
a)前記被験体の頸腟部の筋組織または粘膜組織にpNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70からなる第1のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、および
b)前記頸腟部の筋組織または粘膜組織に第2のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ
を包含する、方法。 - 前記第2のワクチン構築物が、pNGVL4a−sig/E7(detox)/HSP70またはTA−HPVである、請求項15に記載の方法。
- 前記第2のワクチン構築物が、TA−HPVである、請求項16に記載の方法。
- 前記第2のワクチン構築物が、前記第1のワクチン構築物の投与後5〜30日以内に投与される、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のワクチン構築物が、前記第1のワクチン構築物の投与後6日以内に投与される、請求項18に記載の方法。
- 前記方法が少なくとももう1回繰り返される、請求項15から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が繰り返されない、請求項15から19のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物を投与するステップが、前記組成物を注射することを含む、請求項15から21のいずれか一項に記載の方法。
- 粘膜組織に組成物を投与するステップが、前記組成物を前記粘膜組織の粘膜下領域内に注射することを含む、請求項15から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のワクチン構築物を投与した後に、少なくとも1種の生物学的に活性な作用因子の有効量を投与するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的に活性な作用因子が、イミキモド(1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−4−アミン)である、請求項24に記載の方法。
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