JP5522884B2 - ウイルス療法の抗癌作用増強剤、癌の予防または治療方法 - Google Patents

Description

本発明は、インターロイキンを有効成分として含む、ウイルス療法の抗癌作用増強剤に関する。また、本発明は、組換え単純ヘルペスウイルスとインターロイキンとを併用投与することを特徴とする癌の予防または治療方法に関する。

近年、ウイルス感染の分子細胞的機構および癌発生に関する遺伝学的機序や癌細胞増殖の分子生物学的機構などの知見に基づいて、ウイルスゲノムを遺伝子工学的に改変し、癌細胞で選択的に複製するウイルスを作製して、癌治療に応用する試みがなされている。

遺伝子組換えウイルスを癌治療に応用するという概念は、１９９１年にMartuzaらにより提唱された（例えば、非特許文献１を参照。）。ウイルスはそれ自体病原性を有するものが多く、そのままヒト等に投与すると正常細胞にも悪影響を及ぼす。しかし、遺伝子組換えで特定の遺伝子を欠失させることによって、正常細胞ではウイルスＤＮＡを合成できず複製できないが、増殖が盛んな腫瘍細胞では欠落した遺伝子の機能が補償されて複製できるウイルスを作製することができる。

遺伝子組換えによって癌細胞内のみで選択的に複製するよう改変された癌治療ウイルスは、癌細胞に感染するとin situで複製し、その過程で宿主の癌細胞を死滅させる。複製したウイルスは周囲に散らばって再び癌細胞に感染し、その後、複製→細胞死→感染を繰り返して抗腫瘍効果を現す。一方、正常細胞に感染した治療用ウイルスは複製しないため、正常組織には害が生じない。

このような変異ウイルスとして、例えば、単純ヘルペスウイルスＩ型（以下「ＨＳＶ−１」という。）ゲノムから、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を欠失させた変異ウイルス（以下「dlsptk」という。）が挙げられる。dlsptkは、正常細胞ではウイルスＤＮＡを合成できず複製できないが、増殖が盛んな腫瘍細胞では、細胞のｔｋ活性が高いため、欠落したウイルスｔｋが代償され、ウイルスは複製することができる。このdlsptkを腫瘍細胞に感染させると、腫瘍細胞のみを特異的に破壊させ、治療効果を発揮することが動物の脳腫瘍モデルで示されている（例えば、非特許文献１を参照）。

ＨＳＶ−１は、エンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスに分類され、癌治療に有利な以下の特徴を備えている。１）ヒトのあらゆる種類の細胞に感染可能である；２)ウイルスの生活環とゲノム配列が解明されている；３)ウイルス遺伝子の大半は機能が判明しており、遺伝子操作を加えることが可能である；４）ウイルスゲノムが大きい（約１５２ｋｂ）為に、大きな遺伝子や複数の遺伝子を組み込むことができる。さらに、ＨＳＶ−１は臨床応用に適した以下の利点を備える；５)比較的低いmultiplicity of infection(ＭＯＩ)で全ての細胞の死滅が可能である；６）増殖を抑制する抗ウイルス薬が存在する；７)血中抗ＨＳＶ−１抗体は、ウイルスの細胞から細胞への感染拡大に影響しない；８)ＨＳＶ−１に感受性を示すマウスやサルが存在するために、動物で安全性や効果の前臨床的評価を行える；９)ウイルスＤＮＡが宿主細胞のゲノムに取り込まれず染色体外に存在する。

これまでに本発明者は、癌治療用ウイルスとして、γ３４．５遺伝子を欠失させ、ＩＣＰ６遺伝子を不活化させたＨＳＶ−１（以下「Ｇ２０７」と言う。）の開発に重要な役割を果たし（例えば、非特許文献２〜１４を参照）、また、上記２つの遺伝子に加えてさらにＩＣＰ４７遺伝子（α４７遺伝子ともいう）も不活化させたＨＳＶ−１（以下「Ｇ４７Δ」と言う。例えば、特許文献１および非特許文献１５を参照。）を発明し、開発した。Ｇ２０７およびＧ４７Δは、正常組織での複製能は失われているが、腫瘍細胞では複製する能力を保持する。特にＧ４７Δは、３つの遺伝子を変異させたことにより、腫瘍特異性および安全性が高く治療用ウイルスとして非常に有用である。

さらに、本発明者は、免疫系が正常なマウスを用いた研究により、腫瘍内投与された遺伝子組換えＨＳＶ−１は、腫瘍内で増殖して殺細胞効果を示すばかりでなく、特異的抗腫瘍免疫を惹起して、その抗腫瘍効果を増強することを明らかにした（例えば非特許文献６、７および１６を参照）。例えば、Ａ／Ｊマウスの皮下に作成したＮ１８腫瘍（神経芽腫）へＧ２０７を腫瘍内投与すると、Ｎ１８細胞に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocytes; ＣＴＬ）の活性上昇を伴う全身性抗腫瘍免疫が誘導され、遠隔の皮下腫瘍あるいは脳内腫瘍の増大も抑制された。Ｇ２０７治療で治癒したマウスは腫瘍特異的な防御免疫を獲得し、Ｎ１８細胞特異的ＣＴＬ活性上昇は１年以上維持された。すなわち、癌治療用ＨＳＶ−１の腫瘍内投与はin situの癌ワクチンとしても作用し、腫瘍抗原の同定を必要とせず、腫瘍細胞などの培養を必要とするex vivo法に比べて簡便であり、原発巣を治療すると全身性抗腫瘍免疫を介して転移巣をも制御できる可能性もあって臨床上非常に有利である。
ＵＳ２００２／０１８７１６３Ａ１号公報 Martuza, R.L. et al.; Science 252: 854-6 (1991) Chahlavi, A. et al.; Neoplasia 1: 162-169 (1999) Hunter, W. D. et al.; J Virol 73: 6319-6326 (1999) Chahlavi, A. et al.; Gene Ther 6: 1751-1758 (1999) Nakamura, S. et al.; Glia 28: 53-65 (1999) Todo, T. et al,; Hum Gene Ther 10: 2741-2755 (1999) Todo, T. et al,; Hum Gene Ther 10: 2869-2878 (1999) Todo, T. et al,; Cancer Gene Ther. 7: 939-946 (2000) Markert, JM. et al,; Gene Ther. 7: 867-874 (2000) Todo, T. et al,; Mol. Ther. 2: 588-595 (2000) Nakano, K. et al,; Mol. Ther. 3: 431-437 (2001) Varghese, S. et al,; Hum. Gene Ther. 12: 999-1010 (2001) Jorgensen, TJ. et al,; Neoplasia 3: 451-456 (2001) Todo, T. et al,; San Diego, Academic Press:45-75 (2001) Todo, T. et al,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6396-6401 (2001) Toda M. et al,; Hum. Gene Ther., 10: 385-393 (1999)

Ｇ２０７等の組換え単純ヘルペスウイルス（以下、単に「組換えＨＳＶ」という。）を用いた癌の治療では、十分な量のウイルスが腫瘍組織内に送り込まれることが、その効果を発揮する条件の一つである。しかしながら、そのような理想的な状況は、臨床において常に実現されるとは限らない。

組換えＨＳＶによる抗癌作用を、副作用を生じることなく増強できる方法や医薬があれば、ウイルス療法はより有用なものとなる。また、特にウイルス療法の抗癌作用のうち、抗腫瘍免疫効果を増強することができれば、ウイルスを投与した癌組織以外の部位にも抗癌作用が及び、転移巣等においてもより高い治療効果を得ることができるものと考えられる。

そこで、本発明は、ウイルス療法の抗癌作用、特に抗腫瘍免疫作用を効果的かつ安全に増強する医薬、およびこの医薬を利用した癌の予防または治療方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、癌治療において、癌細胞で選択的に増幅する組換えＨＳＶを投与する際、インターロイキン１８（以下「ＩＬ−１８」という。）を併用投与することによって治療効果を増強できること、およびこの効果がＨＳＶを投与した癌組織以外の部位においても十分に得られることを見出した。また、インターロイキン１８を全身投与する場合に、インターロイキン１２を腫瘍局所に投与または発現することにより、その効果はさらに増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、
〔１〕癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスと併用して全身投与されることを特徴とする、インターロイキンを有効成分として含むウイルス療法の抗癌作用増強剤；
〔２〕前記インターロイキンが、インターロイキン１８である、上記〔１〕に記載の剤；
〔３〕前記抗癌作用が、抗腫瘍免疫の惹起を含む、上記〔１〕または〔２〕に記載の剤；
〔４〕前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されている、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の剤；
〔５〕前記組換え単純ヘルペスウイルスは、さらにそのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されている、上記〔４〕に記載の剤；
〔６〕前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのゲノムＤＮＡにインターロイキン１２をコードする遺伝子が発現可能な構成で挿入されている、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の剤；
〔７〕癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスと、インターロイキンとを併用投与することを特徴とする、癌の予防または治療方法；
〔８〕前記インターロイキンが、インターロイキン１８である、上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕前記インターロイキン１８を、全身投与する、上記〔７〕または〔８〕に記載の方法；
〔１０〕さらに、インターロイキン１２を、腫瘍組織周辺に局所投与する、上記〔９〕に記載の方法；
〔１１〕前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのゲノムＤＮＡにインターロイキン１２をコードする遺伝子が発現可能な構成で挿入されている、上記〔９〕に記載の方法；
〔１２〕前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されている、上記〔７〕から〔１１〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１３〕前記組換え単純ヘルペスウイルスは、さらにそのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されている、上記〔１２〕に記載の方法；
〔１４〕前記癌の予防または治療方法が、前記組換え単純ヘルペスウイルスを投与された腫瘍組織以外の部位の癌の予防または治療方法である、上記〔７〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１５〕インターロイキン１８の全身投与と併用して腫瘍組織内に注射投与されることを特徴とする、癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスを含む癌の治療剤または予防剤であって、前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されており、且つゲノムＤＮＡにインターロイキン１２をコードする遺伝子が発現可能な構成で挿入されている、癌の治療剤または予防剤；
〔１６〕前記組換え単純ヘルペスウイルスは、さらにそのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されている、上記〔１５〕記載の癌の治療剤または予防剤、に関する。

本発明によれば、毒性のない程度の十分に低容量のインターロイキン、特にＩＬ−１８を含む抗癌作用増強剤を、癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスと併用投与することにより、ウイルス療法の効果を顕著に高めることができる。また、ＩＬ−１８を全身投与する場合に、ＩＬ−１２を腫瘍局所に投与することによって、当該効果をさらに増強することができる。これらのインターロイキンの併用投与は、特にウイルス療法による抗腫瘍免疫を増強し、ウイルスを投与した腫瘍組織以外の部位における治療効果も向上させる。このことは、本発明に係る方法が、複数箇所に発生した転移巣にも有効であることを示唆し、ウイルス療法をより一層有用性の高いものとする。

以下、本発明に用いられる用語等の意義を明確にし、本発明を詳細に説明する。

本発明において「ウイルス療法」とは、遺伝子工学的に改変することにより、あるいは自然変異や元来の性質により、癌細胞で選択的に複製し、正常細胞では複製できないウイルスを投与することによって、癌細胞のみを破壊して癌を治癒せしめる療法を意味する。

本発明においてウイルス療法で用いられるウイルスとしては、例えば、癌細胞選択的に複製するように改変された組換えＨＳＶや、癌細胞選択的に複製する自然変異単純ヘルペスウイルスが挙げられる。このようなウイルスとしては、γ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されているＨＳＶ、さらにＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されているＨＳＶ等が挙げられる。

γ３４．５遺伝子産物は、double-stranded RNA-activated protein kinase（ＰＫＲ）の機能に拮抗するタンパク質である。正常細胞では、ＨＳＶ−１感染に呼応してＰＫＲがリン酸化され、それが翻訳開始因子ｅＩＦ−２αをリン酸化し、その結果ウイルスのタンパク質合成が抑制される。従って、γ３４．５遺伝子が機能しないと、正常細胞ではウイルスの複製が抑制されることになる。しかし、癌細胞、特にＲａｓシグナル伝達経路が活性化している細胞ではＰＫＲがすでに抑制されているため、γ３４．５を欠失した変異ＨＳＶ−１でもウイルスの複製が可能となる。

ＩＣＰ６遺伝子は、リボヌクレオチド還元酵素（ribonucleotide reductase; ＲＲ）の大サブユニットをコードする遺伝子である。ＲＲ遺伝子を除去または不活化すると、ＨＳＶ−１は非分裂細胞（正常細胞）では複製できない。しかし、分裂が盛んでＲＲ活性が上昇した細胞では、ウイルスの欠落酵素が補われて複製が可能となる。

ＩＣＰ４７タンパク質は、transporter associated with antigen processing (ＴＡＰ)を阻害することによって、感染細胞のMHC Class Iの発現を低下させ、ウイルスが宿主の免疫サーベイランスから逃れるように作用する。このため、ＩＣＰ４７遺伝子を不活化すると、感染癌細胞のMHC Class I発現が維持されるため、抗腫瘍免疫が増強される。

γ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されたＨＳＶとしては、例えば上述のＧ２０７が挙げられ、γ３４．５、ＩＣＰ６およびＩＣＰ４７遺伝子の３つが欠失若しくは不活化されたＨＳＶとしては、例えば上述のＧ４７Δが挙げられる。中でも、Ｇ４７Δは三重変異により、複製の腫瘍特異性および安全性が高く、ウイルス療法に好適である。

これらの組換えＨＳＶは、上記文献に記載の方法またはそれに準ずる方法によって、当業者であれば適宜作製することができる。

本発明に係るウイルス療法の抗癌作用増強剤は、インターロイキンを有効成分として含む。インターロイキンは、リンパ球や単球、マクロファージなど免疫担当細胞の産生するタンパク質性の生物活性物質の総称であり、これまでにＩＬ−１〜ＩＬ−２９の２９種類が知られている。本発明に係る抗癌作用増強剤に含まれるインターロイキンは、ウイルス療法と併用することによって、その抗癌作用を増強する限り特に限定されないが、ナチュラルキラー細胞刺激因子であるＩＬ−１２や、クッパー細胞の産生するサイトカインとしてクローニングされたＩＬ−１８、ＩＬ−１２と同じくｐ４０サブユニットを有し、記憶Ｔリンパ球の増殖を強力に誘導する因子として発見されたＩＬ−２３（Cordoba-Rodriguez, R.; Expert Opin Biol Ther. 2003 Aug; 3(5) 715-23のほか、ＩＬ−２７等（Cordoba-Rodriguez, R.; Expert Opin Biol Ther. 2003 Aug; 3(5) 715-23）が好ましく、中でもＩＬ−１８およびＩＬ−１２が好適である。

ＩＬ−１８は、インターフェロンγ誘導因子（Interferon γ inducing factor; ＩＧＩＦ）として知られる分子量１８，０００の炎症性サイトカインであり、Ｔ細胞やＮＫ細胞におけるインターフェロンγ（以下「ＩＦＮ−γ」という。）産生の誘導、ＮＫ細胞の活性増強、リンパ球でのＦａｓリガンドの発現の増強、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子産生の誘導などの生物活性を有することが知られている。

インターロイキンは、単独でも抗癌作用を示すとの報告もあるが、十分な効果を得るためには高濃度で投与しなければならず、副作用等の観点からも実用性が低い。しかしながら、本発明に係る抗癌作用増強剤として組換えＨＳＶと併用する場合は、毒性を示さない程度に十分な低濃度のインターロイキンを投与することによって、ウイルスを単独に用いた場合よりも顕著に高い抗癌効果を得ることができる。

さらに、本発明においては、ＩＬ−１８を全身投与することにより、ウイルスを投与した腫瘍組織とは異なる部位においても抗癌効果が大きく向上することが見出された。このことは、ＩＬ−１８が、ウイルス療法の抗癌作用のうち、特に抗腫瘍免疫の増強に寄与したことを示し、本発明に係る抗癌作用増強剤が、複数箇所に発生した癌や転移巣を有する癌患者にも有用であることを示す。

また、本発明においては、ＩＬ−１８の全身投与による上記効果は、ＩＬ−１２を腫瘍組織周辺に局所投与することにより、さらに増強されることが見出された。一般に、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２を全身投与すると抗癌作用を示すものの強い副作用が現れることが多い。しかしながら、本発明に係る方法では、ＩＬ−１２の局所投与で、組換えＨＳＶとＩＬ−１８の併用による抗癌作用を増強する効果が得られ、副作用の発生を抑制することが可能である。ＩＬ−１２の局所投与の方法は特に限定されないが、例えば、本発明で用いられる組換えＨＳＶのゲノムＤＮＡに、ＩＬ−１２をコードする遺伝子を発現可能に挿入し、当該組換えＨＳＶを投与する方法を用いることができる。本方法の場合、組換えＨＳＶは、注射投与によって腫瘍組織周辺にのみ投与してもよいし、静脈内投与などにより全身投与してもよい。本発明に係る組換えＨＳＶは、癌細胞選択的に増殖するため、全身投与しても腫瘍細胞においてのみＩＬ−１２が発現するからである。また、組換えＨＳＶとは別にＩＬ−１２タンパク質を直接投与する場合には、腫瘍組織周辺に注射等によって局所投与するとよい。

なお、組換えＨＳＶのゲノムＤＮＡにＩＬ−１２をコードする遺伝子が発現可能に挿入されているとは、該遺伝子が組換えＨＳＶのゲノムＤＮＡにおいてプロモーターの下流に機能的に結合した状態で挿入されていることを意味する。「機能的に結合した」とは、転写因子が上記プロモーターに結合することにより、その下流に位置するＩＬ−１２遺伝子の転写が開始されるように、プロモーターとＩＬ−１２遺伝子が結合していることを意味する。プロモーターは、ＨＳＶのゲノムＤＮＡにもともと存在するものを利用してもよいし、ＩＬ−１２遺伝子とともに発現カセットとしてＨＳＶのゲノムＤＮＡに挿入することもできる。

本発明に係る抗癌作用増強剤に含まれるインターロイキンは、生体由来のものであってもよいし、遺伝子工学的手法により産生されたものであってもよい。なお、ヒトの治療に用いられる場合は、ヒトインターロイキンを用いることが最も好ましい。

本発明に係る抗癌作用増強剤の投与形態は特に限定されず、経口でも非経口的でもよい。哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類等によって異なり特に限定されないが、有効成分として含まれるインターロイキンの量が、約２μｇないし約５ｇ、好ましくは約２０μｇないし約５００ｍｇ、さらに好ましくは約１００μｇないし約２５ｍｇ、注射投与の場合は約０．０３ないし３０００μｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ないし１０００μｇ／ｋｇの範囲となるようにして、それぞれ1回または数回に分けて投与することができる。

本発明にかかる抗癌作用増強剤は、インターロイキンを自体公知の薬学的に許容できる担体等と混合し、慣用される方法により製剤化することが可能である。剤形は特に限定されず、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等が挙げられるが、特に好ましくは注射剤である。製剤化には、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化可能である。

例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなどの水溶性高分子；エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなどの多価アルコール；グルコース、ショ糖などの糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなどの無機粉体；精製水などがあげられる。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等；結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等；崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等；滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油、等；着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものであれば、いかなるものでもよく；矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等；抗酸化剤としては、アスコルビン酸、α−トコフェロール、等、医薬品に添加することが許可されているものがそれぞれ用いられる。

経口製剤は、賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。

錠剤・顆粒剤の場合には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。

シロップ剤、注射用製剤、点眼剤、等の液剤の場合は、ｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤、等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤、緩衝剤、懸濁化剤、抗酸化剤、等を加えて、常法により製剤化する。該液剤の場合、凍結乾燥物とすることも可能で、また、注射剤は静脈、皮下、筋肉内に投与することができる。懸濁化剤における好適な例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、等；溶解補助剤における好適な例としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等；安定化剤における好適な例としては、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテル等；保存剤における好適な例としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等があげられる。

上述の医薬組成物は、各種癌疾患の予防または治療に有用である。組換えＨＳＶを用いたウイルス療法があらゆる種類の固形癌に有効であることがすでに知られており（例えば、上記非特許文献１４を参照）、本発明に係る医薬組成物は、これらの癌すべてに用いることができる。具体的疾患としては、例えば脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、黒色腫、神経芽腫等が挙げられる。中でも脳腫瘍と神経芽腫に有用である。

本発明に係る抗癌作用増強剤は、癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスと併用投与されることを特徴とする。本発明において「併用投与」とは、併用による相乗効果が得られる投与の仕方であれば、その投与量、投与方法、投与時期等は特に限定されず、治療目的や疾患、投与対象によって適宜選択することができる。例えば、組換えＨＳＶと抗癌作用増強剤とを同時に投与してもよいし、いずれか一方を先に投与してもよい。また、少なくとも一方を繰り返し投与しても、投与の頻度がそれぞれ異なっていてもよい。好ましくは、抗癌作用増強剤を繰り返し投与し、この期間中に組換えＨＳＶをより低い頻度で投与する。

なお、組換えＨＳＶの投与方法は、特に限定されず、組換えＨＳＶをそのまま用いてもよいし、自体公知の薬学的に許容できる担体や安定化剤、乳化剤等と混合し、慣用される方法により製剤化してもよい。剤形は特に限定されず、カプセル剤、シロップ剤、吸入剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、ローション剤等が挙げられるが、特に好ましくは注射剤である。

本発明はまた、癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスと、インターロイキンとを併用投与することを特徴とする、癌の予防または治療方法を提供する。「癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルス」「インターロイキン」「併用投与」「癌」の用語については、上述の抗癌作用増強剤について用いられる場合と同義であるので、説明を省略する。

本発明に係る癌の予防または治療方法では、インターロイキンの中でもＩＬ−１８を用いることが好ましい。ＩＬ−１８も、上述の抗癌作用増強剤について用いられる場合と同義であるので、説明を省略する。

本発明にかかる癌の予防または治療方法では、組換えＨＳＶは、腫瘍組織内に注射投与することが好ましい。腫瘍組織内に注射投与することにより、その組織内の癌細胞に対して高い殺細胞効果を与えることができる。投与方法は上記説明の通りである。

一方、インターロイキン、特にＩＬ−１８は、全身投与することが好ましく、ヒトの場合、例えば、静脈内に注射または点滴投与することにより全身投与ができる。全身投与によって、単純ヘルペスウイルスによる抗腫瘍免疫を、ウイルスの投与部位以外でも増強することが可能となり、転移巣においても高い抗癌作用を得ることができる。なお、インターロイキンの投与方法は特に限定されず、インターロイキンをそのまま用いるか、または自体公知の薬学的に許容できる担体等と混合し、慣用される方法により製剤化して投与することも可能である。製剤化方法については、既述の通りであり、ここでは説明を省略する。

本発明に係る癌の治療剤および予防剤は、ＩＬ−１８の全身投与と併用される、癌細胞選択的に複製する組換えＨＳＶを含むものであり、そのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されていると共に、ゲノムＤＮＡにＩＬ−１２をコードする遺伝子が発現可能な構成で挿入されているものである。このような、組換えＨＳＶは、上述したように、Ｇ２０７ウイルスゲノムに、ＩＬ−１２をコードする遺伝子を発現可能な構成で挿入することによって作製することが可能である。また、上記癌の治療剤および予防剤は、ＩＬ−１８と併用して投与されることを想定して、有効成分としてのＨＳＶウイルスの濃度や量が最適化されたものとなっている。なお、本発明に係る癌の治療剤および予防剤は、癌細胞選択的に複製する組換えＨＳＶを含むので、全身投与しても癌細胞のみにおいてＩＬ−１２を分泌させることができる。

本発明に係る癌の治療剤および予防剤に含まれる組換えＨＳＶは、さらに、そのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されていることが好ましい。このような組換えＨＳＶは、上述したＧ４７Δウイルスゲノムに、ＩＬ−１２をコードする遺伝子を発現可能な構成で挿入することによって作製することが可能であり、ＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されていることによって、さらに安全性の高い組換えＨＳＶとなる。

以下に示す本発明の参考例、実施例および試験例は例示的なものであり、本発明は以下に示す具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。

〔ＩＬ−１８とＧ４７Δの併用投与の効果〕
マウス神経芽腫細胞株のＮｅｕｒｏ２ａ（５×１０⁶個）をＡ／Ｊマウスの皮下に移植し、マウス腫瘍モデルとして用いた。Ｎｅｕｒｏ２ａは、ＨＳＶ感染に感受性を有し、Ａ／Ｊマウスにおいて免疫原性が低い。したがって、抗腫瘍免疫の惹起による抗腫瘍効果が最も現れにくいモデルであると考えられ、このモデルで有効性を示すことができれば、他の癌にも有効であると考えることができる（Todo, T. et al.; Cancer Res. 61: 153-161 (2001)、Katsanis, E. et al.; Cancer Gene Ther., 2: 39-46 (1995)、Katsanis, E. et al.; Cancer Gene Ther., 3: 75-82 (1996)、Heuer, J. G., et al.; Hum. Gene Ther., 7: 2059-2068 (1996)）。

癌組織が５−６ｍｍとなったモデルマウスを、６−７匹ずつ群に分け、２つのＧ４７Δ投与群にはＧ４７Δ（１×１０⁶ｐｆｕ）を、２つのＧ４７Δ非投与群（図中「ｍｏｃｋ」で示される）には、１０％グリセロールを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を、０日目と３日目の２回、直接癌組織内に注射投与した。

一方、Ｇ４７Δ投与群および非投与群のそれぞれ１群に、ＩＬ−１８（１μｇ／日）を、他の１群にはＰＢＳを、０日目から６日目まで毎日、腹腔内に注射投与した。腫瘍組織を測定し、長さ×幅×高さ（ｍｍ）により体積を求めた。

上記試験を２回繰り返した結果を図１に示す。いずれの試験においても、Ｇ４７Δ投与群は、Ｇ４７非投与群に比較して、癌の体積の増加率が低いことが確認された。特に、併用投与群（■）は、Ｇ４７Δ単独投与群（□）に比較してもかなり増加率が低く、併用投与による抗癌作用の増強効果が確認された。

また、２つのＧ４７Δ非投与群（●および○）には差が見られず、１μｇ／日のＩＬ−１８単独投与では、抗癌作用を示さないことが確認された。

〔ＩＬ−１８とＧ４７Δの併用投与による抗腫瘍免疫の誘導〕
図１の右図の試験において、Ｇ４７Δ投与／ＩＬ−１８投与群、Ｇ４７Δ投与／ＩＬ−１８非投与群、Ｇ４７Δ非投与／ＩＬ−１８投与群、Ｇ４７Δ非投与／ＩＬ−１８非投与群のマウスから、２０日目に３匹ずつ抽出し、各マウスの脾臓細胞を摘出した。脾臓細胞（各２×１０⁵個）は、マイトマイシンＣで前処理Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（５×１０⁵）の存在下または非存在下で、ＩＦＮ−γ産生試験では２４時間、ＩＬ−４産生試験では４８時間それぞれ培養した。ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４産生細胞の数は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。

結果を図２に示す。Ｇ４７ΔおよびＩＬ−１８を併用投与した群では、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞の刺激によるＩＦＮ−γ産生細胞が、他の群に比較して顕著に増加した。ＩＬ−４産生細胞は、Ｇ４７Δ投与／ＩＬ−１８投与群で、２つのＧ４７Δ非投与群よりも有意に増加したが、Ｇ４７Δ投与／ＩＬ−１８非投与群との間には有意な差が見られなかった。

〔Ｇ４７Δ／ＩＬ−１８併用投与の遠隔腫瘍組織に対する抗癌効果〕
Ｇ４７ΔおよびＩＬ−１８の併用投与による、全身性抗腫瘍免疫惹起の増強を確認した。

左右両側の腹部に直径約４ｍｍのＮｅｕｒｏ２ａ皮下腫瘍組織を有するＡ／Ｊマウスを用い、Ｇ４７Δ投与群には、左側の腫瘍組織内にのみＧ４７Δ（２×１０⁶ｐｆｕ）を、Ｇ４７Δ非投与群には、左側の腫瘍組織内にのみ１０％グリセロールを含むＰＢＳを、それぞれ０日目と３日目の２回、注射投与した（各６匹ずつ）。

一方、ＩＬ−１８投与群にはＩＬ−１８（１μｇ／日）を、ＩＬ−１８非投与群にはＰＢＳを、それぞれ０日目から６日目まで７回、腹腔内に注射投与した。腫瘍組織を測定し、長さ×幅×高さ（ｍｍ）により体積を求めた。

結果を図３に示す。右側の腫瘍の体積の増加に関しては、Ｇ４７Δを単独投与した群（□）は、Ｇ４７Δ非投与群（○および●）と有意な差が見られなかったが、Ｇ４７ΔおよびＩＬ−１８の併用投与群（■）は、腫瘍の体積の増加が有意に抑制された。

この結果から、ＩＬ−１８またはＧ４７Δをそれぞれ単独で投与しても全身性抗腫瘍免疫が見られない場合においても、単独と同じ量のＩＬ−１８とＧ４７Δを併用投与することによって全身性抗腫瘍免疫が惹起され、Ｇ４７Δを投与していない遠隔腫瘍組織においても抗癌効果が得られることが確認された。

〔ヌードマウスにおけるＩＬ−１８とＧ４７Δの併用投与の効果〕
本実施例では、Ｔリンパ球を欠損するヌードマウスにＮｅｕｒｏ２ａ腫瘍細胞を皮下移植し、腫瘍組織が直径約６ｍｍになったものを、各群６−７匹ずつとして、Ｇ４７Δ投与／ＩＬ−１８投与群、Ｇ４７Δ投与／ＩＬ−１８非投与群、Ｇ４７Δ非投与／ＩＬ−１８投与群、Ｇ４７Δ非投与／ＩＬ−１８非投与群の４群に分けた。投与量および投与方法は、上記実施例１と同様である。

結果を、図４に示す。２つのＧ４７Δ投与群（□および■）は、２つのＧ４７非投与群（○および●）に比較して、腫瘍体積の増加が有意に抑制されたが、Ｇ４７Δ単独投与群（□）と、Ｇ４７ΔおよびＩＬ−１８の併用投与群（■）には有意な差は見られなかった。

この結果から、ＩＬ−１８併用投与によるＧ４７Δ抗癌作用増強効果は、Ｔリンパ球の存在を必要とし、免疫を介する機序によるものであることが判明した。

〔癌組織内でのＧ４７Δのウイルス複製に対するＩＬ−１８投与の影響〕
直径約６ｍｍのＮｅｕｒｏ２ａ皮下腫瘍を有するＡ／Ｊマウスを用い、腫瘍組織内にＧ４７Δを注射投与した（０日目）。このマウスのうち、ＩＬ−１８投与群にはＩＬ−１８（１μｇ／日）を、ＩＬ−１８非投与群にはＰＢＳを、０日目から６日目まで７回、腹腔内に注射投与した。Ｇ４７Δ投与から、３０分後、２日後、４日後、７日後および１１日後にそれぞれ３匹のマウスから皮下腫瘍を摘出し、腫瘍内に存在するＧ４７Δの力価を、プラークアッセイによって測定した。

結果を図５に示す。ＩＬ−１８投与群（■）と非投与群（□）では、いずれの時点においても、腫瘍から検出されたＧ４７Δの力価に統計的有意差を認めず、ウイルス複製能に有意な差は見られなかった。この結果は、同じプロトコールを用いた別の試験においても再現された。

この結果から、ＩＬ−１８の併用投与によるＧ４７Δの抗癌作用増強は、Ｇ４７Δのウイルス複製能に影響しているものではないことがわかった。

〔Ｔリンパ球サブセット枯渇下におけるＧ４７ΔとＩＬ−１８の併用投与の効果〕
坑ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体を用いて、Ｎｅｕｒｏ２ａ皮下腫瘍を有するＡ／ＪマウスにおけるＣＤ４陽性Ｔリンパ球またはＣＤ８陽性Ｔリンパ球を枯渇させ、Ｇ４７ΔおよびＩＬ−１８の併用効果におけるこれらの免疫細胞の寄与を検証した。

５−６ｍｍのＮｅｕｒｏ２ａ皮下腫瘍組織を有するＡ／Ｊマウスを、６−７匹ずつ群に分け、４つのＧ４７Δ投与群にはＧ４７Δ（２×１０⁶ｐｆｕ）を、１つの対照群（図中「Ｍｏｃｋ＋ＰＢＳ」で示される）には、１０％グリセロールを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を、０日目と３日目の２回、直接癌組織内に注射投与した。

Ｇ４７Δ投与群のうち半分に、ＩＬ−１８（１μｇ／日）を、他の半分にはＰＢＳを、０日目から６日目まで毎日、腹腔内に注射投与した。

ＣＤ４陽性Ｔリンパ球枯渇試験（左図）では、Ｇ４７Δ投与／ＩＬ−１８投与の２群とＧ４７Δ投与／ＩＬ−１８非投与の２群のうちそれぞれ１群に、抗ＣＤ４抗体（２５０μｇ）をＧ４７Δ投与の１日前、２日目、６日目、１２日目に腹腔内に投与した。坑ＣＤ４抗体を投与しない群には、対照としてラットＩｇＧを同量、同じタイミングで投与した。

ＣＤ８陽性Ｔリンパ球枯渇試験（右図）は、坑ＣＤ４抗体の代わりに坑ＣＤ８抗体（５０μｇ）を用いてＣＤ４陽性Ｔリンパ球枯渇試験と同様に施行した。

腫瘍組織を測定し、長さ×幅×高さ（ｍｍ）により体積を求めた。

結果を図６に示す。Ｇ４７Δ抗癌作用に対するＩＬ−１８併用による増強効果は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の枯渇により影響を受けなかったが、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を枯渇させると、ＩＬ−１８併用による抗癌作用増強効果が消失した。このことから、ＩＬ−１８併用投与による効果には、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を要する機序が関与していることが明らかとなった。

〔脳腫瘍に対するＧ４７ΔおよびＩＬ−１８の併用投与の効果〕
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をＡ／Ｊマウスの脳内に５×１０⁴個移植し、５日経過後、Ｇ４７Δ投与群には、Ｇ４７Δ（２×１０⁵ｐｆｕ）を、Ｇ４７Δ非投与群には１０％グリセロールを含むＰＢＳを、腫瘍組織内に注射投与した。それぞれの群のうち、ＩＬ−１８投与群にはＩＬ−１８（１μｇ／日）を、非投与群にはＰＢＳを、Ｇ４７Δ投与０日目から６日目まで毎日、腹腔内に注射投与した。マウスの生存期間を観察した。

結果を図７に示す。Ｇ４７ΔおよびＩＬ−１８の併用投与群の生存期間は、他の群に比較して有意に延長した。このことから、ＩＬ−１８併用投与は、免疫効果が及びにくいとされる脳内の腫瘍に対しても、十分に抗癌作用増強効果を発揮することが確認された。

〔ＩＬ−１２の局所投与による、組換えＨＳＶ（局所投与）とＩＬ−１８（全身投与）の抗腫瘍効果の増強〕
次に、上述の実施例に示したＧ４７Δ（局所投与）とＩＬ−１８（全身投与）の併用に、さらにＩＬ−１２の局所投与を追加した場合の抗腫瘍効果の増強、および全身性抗腫瘍免疫を介した遠隔腫瘍に対する抗腫瘍効果の増強を確認した。
本実施例では、ＩＬ−１２をコードする遺伝子を組換えＨＳＶウイルスゲノムに挿入し、組換えＨＳＶを投与することによって、ＩＬ−１２を局所投与した。
まず、ＩＬ−１２の局所発現のために、図８に示すように、ＩＬ−１２をコードする遺伝子を発現可能な構成で挿入したＧ４７ΔウイルスＤＮＡ（以下「Ｔ−ｍｆＩＬ１２」という。）を作製した。図中、ライン上のボックスはヘルペスウイルスＤＮＡに特有のＵ_L配列およびＵ_S配列に隣接するinverted repeat sequencesである。図示されるように、Ｔ−ｍｆＬ１２は、γ３４．５の両コピーに１．０ｋｂの欠失を、ＩＣＰ４７部位に３１２ｂｐの欠失をそれぞれ有するとともに、ＩＣＰ６遺伝子のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ部位間に８９４ｂｐの欠失を有する。ＩＣＰ６の欠失部位には、マウスＩＬ−１２遺伝子（図中、「transgene」で示される。）および、ＬａｃＺ遺伝子を挿入した。図中、太い矢印が転写領域である。なお、ＮはＮｃｏＩ、ＢｓはＢｓｔＥＩＩ、ＳｔはＳｔｕＩ、ＸはＸｈｏＩ、ＢはＢａｍＨＩ、ＳｃはＳｃａＩ、ＧはＢｇｌＩＩ、ＥＮはＥｃｏＮＩ、ＮｒはＮｒｕＩによる制限部位を示す。

左右両側の腹部に直径約５ｍｍのＮｅｕｒｏ２ａ皮下腫瘍組織を有するＡ／Ｊマウスを用い、Ｔ−ｍｆＩＬ１２投与群には、左側の腫瘍組織内にのみＴ−ｍｆＩＬ１２（１×１０⁶ｐｆｕ）（１０％グリセロールを含むＰＢＳ中）を、非投与群には、左側の腫瘍組織内にのみ１０％グリセロールを含むＰＢＳのみを、それぞれ０日目と３日目の２回注射投与した（各５−６匹ずつ）。
一方、ＩＬ−１８投与群には、ＩＬ−１８（１μｇ／日）を、ＩＬ−非投与群にはＰＢＳを、それぞれ０日目から６日目まで７回、腹腔内に注射投与した。腫瘍組織を測定し、長さ×幅×高さ（ｍｍ）により体積を求めた。

結果を図９に示す。図中「Ｍｏｃｋ＋ＰＢＳ」は、Ｔ−ｍｆＩＬ１２およびＩＬ−１８のいずれも投与しなかった群、「Ｍｏｃｋ＋ＩＬ−１８」はＩＬ−１８の全身投与のみ行ってウイルスを投与しなかった群、「Ｔ−ｍｆＩＬ１２＋ＰＢＳ」はＩＬ−１２を発現する組換えＨＳＶのみ投与してＩＬ−１８を投与しなかった群、「Ｔ−ｍｆＩＬ１２＋ＩＬ−１８」は、ＩＬ−１２を発現する組換えＨＳＶの局所投与とＩＬ−１８の全身投与を併用した群、をそれぞれ示す。
左側の腫瘍に関しては、ウイルス非投与群（○および●）に比べて、Ｔ−ｍｆＩＬ１２の単独投与（◇）でも腫瘍の増大が有意に抑制されたが、Ｔ−ｍｆＩＬ１２とＩＬ−１８の併用（◆）により、さらに有意に強い抗腫瘍効果を示した。
また、右側の遠隔腫瘍に関しては、Ｔ−ｍｆＩＬ１２単独投与群（◇）は、ウイルス非投与群に比べ軽度の腫瘍増大抑制が見られたのみであったが、ＩＬ−１８の併用投与（◆）により、抗腫瘍効果が著明に増強され、Ｔ−ｍｆＩＬ１２単独投与群と有意な差を示した。
この結果から、ウイルス投与腫瘍および非投与遠隔腫瘍のいずれにおいても、またＩＬ−１８の全身投与単独では腫瘍の増大が効果的に抑制できない場合においても、ＩＬ−１２遺伝子を組み込んだ組換えＨＳＶの抗腫瘍効果がＩＬ−１８の全身投与併用により増強されることが確認された。

皮下Neuro2a腫瘍を有するマウスへの、G47ΔおよびIL-18の併用投与の効果を試験した結果を示す。 G47ΔおよびIL-18の併用投与による、腫瘍細胞刺激に反応する脾細胞の誘導を検証する試験の結果を示す。 G47ΔおよびIL-18の併用投与による、G47Δ非投与の遠隔腫瘍組織に対する抗癌効果を試験した結果を示す。 ヌードマウスにおけるG47ΔおよびIL-18の併用投与の効果を試験した結果を示す。 IL-18投与による、癌組織内でのG47Δのウイルス複製への影響を試験した結果を示す。 ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔリンパ球の枯渇下における、G47ΔおよびIL-18の併用投与の効果を試験した結果を示す。 脳腫瘍に対するG47ΔおよびIL-18の併用投与の効果を試験した結果を示す。 ＩＬ−１２をコードする遺伝子を発現可能な構成で挿入したＧ４７ΔウイルスＤＮＡ（Ｔ−ｍｆＩＬ１２）の構造を示す。 両側に皮下Neuro2a腫瘍を有するマウスに、IL-12を発現するG47Δ（左側腫瘍へ局所投与）およびIL-18（全身投与）を併用投与した場合の、ウイルス投与を投与した腫瘍（左側）と遠隔腫瘍（右側）に対する抗腫瘍効果を試験した結果を示す。

Claims (7)

1. 癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスと併用して全身投与されることを特徴とする、インターロイキン１８を有効成分として含むウイルス療法の抗癌作用増強剤。
2. 前記抗癌作用が、抗腫瘍免疫の惹起を含む、請求項１に記載の剤。
3. 前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されている、請求項１又は２に記載の剤。
4. 前記組換え単純ヘルペスウイルスは、さらにそのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されている、請求項３に記載の剤。
5. 前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのゲノムＤＮＡにインターロイキン１２をコードする遺伝子が発現可能な構成で挿入されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の剤。
6. インターロイキン１８の全身投与と併用して腫瘍組織内に注射投与されることを特徴とする、癌細胞選択的に複製する組換え単純ヘルペスウイルスを含む癌の治療剤または予防剤であって、
   前記組換え単純ヘルペスウイルスは、そのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されており、且つゲノムＤＮＡにインターロイキン１２をコードする遺伝子が発現可能な構成で挿入されている、癌の治療剤または予防剤。
7. 前記組換え単純ヘルペスウイルスは、さらにそのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されている、請求項６に記載の癌の治療剤または予防剤。

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