CN105749302A - 一种基于壳聚糖的mri造影剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于壳聚糖的MRI造影剂及制备方法。该造影剂包括：作为造影剂主体的聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖；以及，主要连接于聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖的侧链上的钆螯合物。进一步的，该造影剂还可包含连接于聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖的侧链上的靶向基团，例如叶酸。所述制备方法包括：首先提供聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖，然后将钆的螯合配体，例如二乙烯三胺五乙酸偶联在聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖上，再与Gd³⁺形成钆螯合物并优选连接叶酸等靶向基团，获得所述造影剂。该基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的生物相容性好，易生物降解，并具备高弛豫率，其制备方法简单，所需反应温度适中，易于控制。

Description

一种基于壳聚糖的MRI造影剂及制备方法

技术领域

本发明属于医学临床磁共振成像技术，具体的涉及一种磁共振成像造影用的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂及制备方法。

背景技术

造影剂是医学临床中核磁共振成像时用来缩短成像时间、提高成像对比度和清晰度的一种成像增强对比剂，它能改变体内局部组织中水质子的弛豫速率，提高正常与患病部位的成像对比度，从而显示体内器官的功能状态。在诊断磁共振成像中，接近50％的检测要用到MRI造影剂。造影剂主要分为两类：顺磁剂，即T₁类；铁磁性或超顺性造影剂，即T₂类。其中临床应用较为广泛的小分子非靶向的Gd基造影剂属于T₁类。这类小分子造影剂应用于生物体尚存在一些缺点，如血液循环时间短、弛豫率低、无靶向性，具有一定的毒性，甚至会引起生物体肾细胞的纤维化。因此高弛豫率，低毒，具有组织或肿瘤靶向性成为MRI造影剂发展的焦点。

现有技术中，已经出现将小分子的钆螯合物交联到大分子的载体的相关技术，其不仅可以提高造影剂分子的弛豫效率和体内循环时间，还能利用增强渗透和保留(EPR)效应来被动靶向癌组织，从而增加成像对比度。如将Gd³⁺螯合在5代的聚酰胺胺的树形分子上，制备靶向性的纳米簇造影剂分子；将Gd³⁺螯合在自组装的二十烷酸壳聚糖胶束上，制备造影剂分子(Cheng,Z.L.,Angew.Chem.Int.Ed.(2010),49,346–350.UbonvanTermsarasaba.,Biointerfaces.109(2013)280–286)。但在应用中，上述造影剂仍存在体内循环时间及组织驻留时间短，弛豫效率偏低，以及载体不易降、生物毒性较大和Gd³⁺负载量小的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物相容性好，易生物降解，高弛豫率的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂及其制备方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂，包括：

作为造影剂主体的乙烯亚胺接枝的壳聚糖，

主要连接于聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖的侧链上的钆螯合物。

进一步的，所述造影剂还包括：主要连接于聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖的侧链上的靶向基团。

其中，所述靶向基团可优选为叶酸，但不限于此。

在一较佳实施方案之中，所述造影剂具有下式所示结构：

其中，n为8～30之间的整数。

一种基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的制备方法，包括：首先提供聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖，其后将钆的螯合配体偶联在聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖上，再与Gd³⁺形成钆螯合物，获得所述造影剂。

一较优实施方式中，所述制备方法进一步包括：将壳聚糖与马来酸酐在50℃～70℃反应得到N-马来酰化的壳聚糖，所述壳聚糖的分子量为Mw5000～10000Da，所述马来酸酐与壳聚糖结构单元的摩尔比为2～5：1。

一较优实施方式中，所述制备方法进一步包括：以浓度为0.2～0.3wt％的氢氧化钠溶液作为反应溶剂，之后将分子量为600～1200Da的聚乙烯亚胺通过迈克尔加成反应接枝到N-马来酰化的壳聚糖上。

一较优实施方式中，所述制备方法进一步包括：在所述迈克尔加成反应完成后，将反应混合物透析后冻干，获得聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖。

一较优实施方式中，所述制备方法进一步包括：在中性或弱酸性条件下，使钆的螯合配体二乙烯三胺五乙酸通过活化羟基的偶联试剂与聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖进行偶联。

一较优实施方式中，所述制备方法进一步包括：在pH值为5～7的条件下，使作为偶联试剂的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、二乙烯三胺五乙酸及氨按照1：5：5的摩尔比于50～80℃反应，之后透析、冻干，获得DTPA偶联的聚乙烯亚胺接枝壳聚糖。

在一实施案例中，该造影剂的制备方法可包括如下步骤：

(1)将壳聚糖分散在DMSO中，加入马来酸酐，得到N-马来酰化的壳聚糖NMC；

(2)利用迈克尔加成反应将聚乙烯亚胺接枝到N-马来酰化的壳聚糖上，制备NMC-g-PEI，即聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖；

(3)将DTPA配体通过EDC反应交联到NMC-g-PEI上，即得造影剂分子配体NMC-g-PEI-DTPA，即DTPA偶联的聚乙烯亚胺接枝壳聚糖

(4)将FA-NHS修饰到造影剂上并与Gd³⁺螯合，得到所述的高分子造影剂。

该基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂采用壳聚糖作为造影剂主体，壳聚糖具有生物相容性好，生物毒性低和生物可降解的优点，壳聚糖的分子量大小可以不限。将钆螯合物连接在聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖上，能够增加造影剂分子的尺寸及单位分子量的钆装载率，从而提高弛豫效率，并延长其血液循环时间。钆螯合物主要位于聚乙烯亚胺接枝壳聚糖的侧链上。通过在造影剂分子上连接靶向基团叶酸，可利用叶酸受体介导的靶向作用，使造影剂分子在肿瘤部位富集，从而提高造影剂的造影效果。经试验发现，该造影剂弛豫率(约6.6mM^-1·s^-1)明显高于小分子造影剂的弛豫率。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：该基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的生物相容性好，易生物降解，并具备高弛豫率。其制备方法简单，所需反应温度适中，易于控制。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的阐述。

附图说明

图1是本发明实施例1中一种造影剂制备工艺的原理图；

图2是本发明壳聚糖、NMC-g-PEI及本发明造影剂配体的¹HNMR图；

图3是本发明高分子造影剂与Gd-DTPA弛豫率对比图；

图4是本发明高分子造影剂与Gd-DTPA的T₁加权成像对比图；

图5是本发明高分子造影剂在KB细胞中的细胞毒性；

图6是H₂O(A)、Gd-DTPA(B)、叶酸预孵育后加入本发明造影剂(C)及本发明造影剂(D)分别与KB细胞孵育后的T₁加权成像对比图；

图7A-图7C是分别将PBS(A)、无靶向的本发明造影剂(B)及叶酸修饰的本发明造影剂(C)注射入荷瘤小鼠后5h活体成像效果对比图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)壳聚糖预处理：壳聚糖溶解在浓度为0.1M的冰醋酸溶液中，然后把浓度为0.2M的氢氧化钠(NaOH)加入到上述溶液中，得到壳聚糖沉淀。然后用水将沉淀多次洗涤近至pH值＝7.0。

(2)将经过处理的壳聚糖分散在DMSO溶液中，将含有马来酸酐的DMSO溶液逐滴加入上述中。滴加完毕，把混合后的溶液在油浴中60℃反应8h。用丙酮沉淀产物并真空干燥，得到N-马来酰化的壳聚糖(NMC)。

(3)将N-马来酰化的壳聚糖完全溶解在浓度为0.25％的氢氧化钠溶液中，然后把含聚乙烯亚胺的水溶液滴加到上述溶液中，60℃反应24h。将反应液透析后冻干得白色絮状产物，即聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖(NMC-g-PEI)。

(4)将NMC-g-PEI溶于水中，加入二乙烯三胺五乙酸，调节pH值至6，加入EDC，70℃反应10h。混合液用截留分子量3500的透析袋透析，冻干，得到NMC-g-PEI-DTPA。

(5)将NMC-g-PEI-DTPA溶于水中，加入GdCl₃，并用NaOH维持溶液pH为6，42℃反应过夜。然后用截留分子量3000的超滤管除去未反应的Gd³⁺。

(6)将FA-NHS的DMSO溶液加入到上述溶液中，室温反应2h，用截留分子量3000的超滤管除去未反应的FA-NHS。即为制备的基于壳聚糖衍生物的可降解的靶向MRI造影剂FA-NMC-g-PEI-DTPA。

实施例2测定NMC、NMC-g-PEI及NMC-g-PEI-DTPA的¹HNMR图，包括：以重水为溶剂分别测试NMC、NMC-g-PEI及NMC-g-PEI-DTPA¹HNMR图，如图2所示。

实施例3在11.7T的MRI测试仪上测试本发明高分子造影剂与Gd-DTPA弛豫时间T₁及T₁加权成像，包括：

分别配制0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mM的上述两种样品，测试后，以浓度为横坐标，弛豫时间的倒数为纵坐标进行线性拟合得到本发明的造影剂和Gd-DTPA的弛豫率分别为6.6mM^-1·s^-1和4.8mM^-1·s^-1(图3)。本发明的造影剂弛豫率明显高于Gd-DPTA。通过两者在不同浓度下的T₁加权成像(图4)可以看出，随浓度的增加，两者均有变亮的趋势，但本发明造影剂的造影效果明显亮于Gd-DTPA。

实施例4造影剂的细胞毒性检测

用WST法来测定本发明造影剂在KB细胞中的细胞毒性(图5)。在96孔板中以每孔8000细胞的密度种入KB细胞悬液100μL，将96孔板置于CO₂培养箱中，在37℃中培养24h。将造影剂溶于完全培养基中，过滤除菌，用完全培养基将聚合物溶液稀释成0.01～2mM不同的浓度。然后再将不同浓度的聚合物溶液加入到96孔板中，每孔加100μL，对照组加入100μL完全培养基，继续培养24h。最后移出培养基，每孔加入100μL新鲜培养基，然后每孔加入10μLWST，置于培养箱中培养2h，用酶标仪测定450nm处的吸收值OD_450nm。每个聚合物浓度及对照组做4个平行样。根据吸光值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞及聚合物溶液，对照组即不加聚合物溶液。

细胞相对存活率(％)＝100×(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)

如图5所示，KB细胞与本发明造影剂分子孵育后的存活率有浓度依赖性，低于0.25mM时均接近100％，至1mM时仍在95％以上，表面本发明造影剂分子的生物毒性很低。

实施例5细胞水平的T₁加权成像

将KB细胞培养在4个培养皿中，分别标记为ABCD皿，当细胞的汇合度达到60～70％时。A皿更换新鲜培养基作为空白对照，B皿用商用马根维显孵育、C皿与D皿均加入与B皿同样钆离子浓度的本发明造影剂孵育，其中C皿提前2h加游离FA孵育。孵育4h后侧试T₁加权成像(图6)，可以看出本发明造影剂图像的亮度要明显高于Gd-DTPA及对照样。同时，通过加游离叶酸孵育后，其图像亮度要明显低于未加叶酸孵育组，说明游离叶酸能有效的抑制本发明高分子造影剂与细胞的结合。以上实验表明本发明造影剂成像效果要明显优于商用造影剂，且具还有主动靶向效果。

实施例6测试本发明造影剂在活体中的成像效果

将荷瘤小鼠分为三组，分别注射等量的PBS(A)、无靶向的本发明造影剂(B)及叶酸修饰的本发明造影剂(C)。5h后将三组裸鼠依次注射10％的水合氯醛麻醉(5mL/kg)。用11.7T的MRI成像仪进行活体测试(图7)，实验结果说明注射叶酸修饰的造影剂组图像的亮度要明显高于无靶向和空白组。说明本发明造影剂不仅提高了成像对比度，还能很好的靶向肿瘤部位，在肿瘤部位富集，增强造影效果。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于壳聚糖的MRI造影剂，其特征在于包括：

作为造影剂主体的聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖，

以及，主要连接于聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖的侧链上的钆螯合物。

2.根据权利要求1所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂，其特征在于还包括：主要连接于聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖的侧链上的靶向基团；

所述靶向基团包括叶酸。

3.根据权利要求1或2所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂，其特征在于它具有下式所示结构：

其中，n为8～30之间的整数。

4.权利要求1-3中任一项所述基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的制备方法，其特征在于包括：首先提供聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖，其后将钆的螯合配体偶联在聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖上，再与Gd³⁺形成钆螯合物，获得所述造影剂。

5.根据权利要求4所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的制备方法，其特征在于包括：将壳聚糖与马来酸酐在50℃～70℃反应得到N-马来酰化的壳聚糖，所述壳聚糖的分子量为Mw5000～10000Da，所述马来酸酐与壳聚糖结构单元的摩尔比为2～5：1。

6.根据权利要求4或5所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的制备方法，其特征在于包括：以浓度为0.2～0.3wt％的氢氧化钠溶液作为反应溶剂，之后将分子量为600～1200Da的聚乙烯亚胺通过迈克尔加成反应接枝到N-马来酰化的壳聚糖上。

7.根据权利要求6所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂的制备方法，其特征在于包括：在所述迈克尔加成反应完成后，将反应混合物透析后冻干，获得聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖。

8.根据权利要求4所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂制备方法，其特征在于包括：在中性或弱酸性条件下，使钆的螯合配体二乙烯三胺五乙酸通过活化羧基的偶联试剂与聚乙烯亚胺接枝的壳聚糖进行偶联。

9.根据权利要求8所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂制备方法，其特征在于包括：在pH值为5～7的条件下，使作为偶联试剂的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、二乙烯三胺五乙酸及氨按照1：5：5的摩尔比于50～80℃反应，之后透析、冻干，获得DTPA偶联的聚乙烯亚胺接枝壳聚糖。

10.根据权利要求4所述的基于壳聚糖的靶向性MRI造影剂制备方法，其特征在于包括：在室温下将靶向基团连接到DTPA偶联的聚乙烯亚胺接枝壳聚糖上，反应时间为2～6h，之后在pH值为5～7时，将Gd³⁺螯合到DTPA偶联的聚乙烯亚胺接枝壳聚糖上，反应时间为10～16h，获得所述造影剂；

其中，所述靶向基团包括叶酸。