CN105745220B - 结合β淀粉状蛋白的环状肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肽，其包含至少一种与β淀粉状蛋白物类结合的肽，其中所述肽具有以环化形式存在的氨基酸序列。公开了该肽在医药中，特别是用于治疗阿尔茨海默症的用途。

Description

结合β淀粉状蛋白的环状肽及其用途
本发明涉及结合β淀粉状蛋白的环状肽及其用途。
现有技术
由DE 699 30 164 T2已知内含肽介导的肽环化。
由DeMattos等人（DeMattos, R.B., Bales, K.R., Cummins, D.J., Dodart,J.-C., Paul, S.M., Holtzman, D.M.(2001).Peripheral anti-Aβ antibody altersCNS and plasma Aβ dearance and decreases brain Aβ burden in a mouse model ofAlzheimer's disease. PNAS, 第98卷, 第8850-8855页）已知用于治疗阿尔茨海默痴呆症的抗Aβ定向抗体。
但是此外不存在用于治疗阿尔茨海默痴呆症（AD，拉丁语Morbus Alzheimer）的根原性（ursächlich）有效药物。所用药物在最佳情况下能够缓和某些症状，但是不能减慢，更不用说停止疾病的进展。
存在一系列物质，其能够在动物试验中在预防，但不一定在治疗阿尔茨海默痴呆症方面获得成功。
阿尔茨海默疾病的特征是β淀粉状蛋白-肽（A-β肽、Aβ或Aβ肽）的细胞外沉积物。通常在AD患者的脑中死后发现斑块式A-β肽沉积。因此各种形式的A-β肽例如原纤维导致该疾病的产生和进展。此外，多年来将可自由扩散的小的A-β寡聚物视为AD产生和进展的主要原因。A-β单体在我们体内不断产生且本身也许不具毒性。推测的是，A-β单体是否依据其最终通过在体内形成和降解速率得到的浓度，随机地并因此随着年龄增长越来越可能自发地构成A-β寡聚物。一经产生的A-β寡聚物可通过类似于朊病毒的机理增多并最终导致疾病。
目前存在以不同方式例如通过γ分泌酶抑制或调节而减小A-β单体浓度的某些物质、结合A-β的抗体等，这明显足以在动物试验（在此在疾病病症完全爆发之前，大多已治疗动物）中成功地起预防性作用。在II和III阶的人体临床研究中，仅允许治疗确诊阿尔茨海默痴呆症的人。对此，迄今所有这些物质都失败。这可能是因为在此在疾病开始后A-β单体浓度的少许或中等减小不再足以阻止产生越来越大量的A-β寡聚物。
迄今不能够在病症爆发之前诊断阿尔茨海默痴呆症。目前，阿尔茨海默痴呆症主要通过对已经遭受痴呆症状的人进行神经心理学测试来识别。此外，其它疾病如创伤可通过各种检验方法排除。但是已知A-β寡聚物和时间上此后形成的斑块在出现症状之前最多20年就在患者脑中产生并造成不可逆损伤。对患者静脉内注射并在穿过血脑障壁之后与A-β寡聚物和斑块结合的分子探针能够借助成像方法可见并因此实现早期确诊阿尔茨海默痴呆症。
存在的结合A-β的物质的缺点因此是亲和性不足以阻止A-β寡聚物增多。
缺点还在于，不存在用于体内成像法的专门与A-β物类结合并使其可见的探针。因为A-β寡聚物在病史中起如此重要和早期的作用，这正是希望的。
发明目的
本发明的目的是提供用于以下用途的肽：
A) 通过阻止形成毒性A-β寡聚物或聚集物和/或将其去毒化，对阿尔茨海默症进行病因治疗，和/或
B) 通过提供用于体内成像的探针，可靠地诊断阿尔茨海默痴呆症。
在下文中，术语“A-β”、“Beta淀粉状蛋白”、“β淀粉状蛋白”和“Aβ”相互同义使用。
目的的实现方式
本发明的目的通过根据权利要求1的本发明的肽和通过根据从属权利要求的该肽的试剂盒、组合物、探针和用途来实现。对此的有利的实施方案分别显现在基于其的权利要求中。
发明描述
本发明的肽包含至少一种与β淀粉状蛋白物类结合的肽，例如由现有技术已知的D3，其中所述肽具有能够使其与A-β结合的线性氨基酸序列，并且通过使所述肽经由共价键合以环化形式存在，所述性能保持或增强。
所述肽D3及其线性序列由公开文献WO 02/081505 A2已知。
本发明的肽有利地基本上由D-对映异构体氨基酸组成。在本发明中，术语“基本上由D-对映异构体氨基酸组成”表示所用氨基酸至少60%，优选75%、80%，特别优选85%、90%、95%，特别是96 %、97%、98%、99%、100%由D-对映异构体氨基酸构成。
在本发明的一个实施方案中，本发明的环化肽以最高1 μM，优选800、600、400、200、100、10 nM，特别优选1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100 pM，特别优选最高50 pM，最优选最高25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 pM直至优选亚pM的解离常数（KD-值）结合β淀粉状蛋白物类，其中可取各个中间值。
所述环化肽的解离常数（KD-值）在此在本发明的一个有利的实施方案中相比于结合性的具有线性序列的肽，但特别是优选相比于可衍生出该环状肽的线性肽的每种而言是有利地减小的。与此相关联的是本发明肽的改进的性能，如结合亲和性和降解和/或阻止形成毒性β淀粉状蛋白物类的有效性。但是特别地，这不仅仅涉及在所述A-β（单体、寡聚物和原纤维）的高亲和性位点的较低KD值。
本发明的肽有利地具有这样的氨基酸序列，其中线性分子例如通过缩合反应例如通过第一与最后氨基酸的共价键合而环化。当然，存在其它的环化可能方式，例如通过其它氨基酸相互键合。仅示例性地提及第二氨基酸与最后氨基酸的键合。每种可能的其它键合同样可设想。
在所述肽的第一和最后氨基酸相互键合的情况下，有利地导致在肽链（氨基酸序列）中不存在开放末端。
该措施此外导致，具有线性氨基酸序列且其在环化之后得到不再可区分的相同氨基酸次序的所有肽就此相同。
实例：已知的肽D3的线性氨基酸序列是rprtrlhthrnr。通过N端氨基和C端羧基之间的酰胺键键合的相应的环化肽“cD3”不再能与环化肽prtrlhthrnrr、rtrlhthrnrrp、trlhthrnrrpr、rlhthrnrrprt、lhthrnrrprtr、hthrnrrprtrl、thrnrrprtrlh、hrnrrprtrlht、rnrrprtrlhth、nrrprtrlhthr或rrprtrlhthrn区分。
环化肽的制备是现有技术，并可以例如根据如DE 102005049537 A1中所述的方法来进行。
通过肽的第一和最后氨基酸的环化有利地导致，不再存在肽链的“开放”末端，其通常是细胞、动物或人中例如经由氨肽酶和羧肽酶的肽降解活性攻击点。
环化肽在动物和人中有利地具有比相应线性肽更大的稳定性。但是，单独的该效果对本发明不是决定性的，解释如下。此外如已表明，这仅适用于其中线性肽的相应两个末端相互键合的头尾或尾头环化情况。
相反地在本发明中认识到，相比于可衍生出该环化肽的结合性的线性肽而言，本发明的环化肽以更高的亲和性与Aβ物类，更确切地说还尤其与特别毒性的β淀粉状蛋白寡聚物结合。也就是说，在环化肽的情况下的KD值比在线性肽的情况下更低，并且特别是比在可衍生出所述环化肽的线性肽的情况下更低。
因此在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明环化肽的结合亲和性相比于可衍生出其的线性肽而言提高1%、2、3、4、5、6、7、8、9，特别是10%、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，特别是100%、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199，特别是200 %、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299，特别是300%、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399，特别是400%、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499，有利地甚至500%、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599，特别有利是600%、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699，特别有利是700%、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799，同样特别有利是800%、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899，同样特别有利是900%、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999，同样特别有利是1000 %，或甚至10000%或甚至最高100000%或1000000%，其中可取各个中间值。但是特别地，这不仅仅涉及与所述A-β（单体、寡聚物、原纤维等）的高亲和性位点的提高的亲和性。
这通过相应降低的KD值表现。作为所述环化肽与β淀粉状蛋白物类，并特别与β淀粉状蛋白寡聚物的结合亲和性量度的KD值相比于结合性的线性肽，优选相比于可衍生出所述环化肽的各种结合性的线性肽而言减小1%、2、3、4、5、6、7、8、9，特别是10%、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，特别是99.1、99.2、99.3、99.4、99.5%、99.6、99.7、99.8、99.9直至99.99或甚至99.999%。
但是特别地，这些更低的KD值有利地不仅仅基于A-β（单体、寡聚物、原纤维等）的高亲和性位点。
本发明的环化肽因此可以比结合性的线性肽更有效地，还特别是比可衍生出该环化肽的线性肽对等物（相同氨基酸序列）更有效地用作诊断目的的探针。
但是它们还可以特别地比线性肽更有效地，特别是比可衍生出其的线性肽对等物更有效地用作治疗剂。
在本发明中，因此此外认识到，本发明的环化肽相比于线性肽，但是特别是相比于可衍生出该环化肽的具有线性序列的肽对等物而言额外地以更高的有效性或效率阻止形成特别毒性β淀粉状蛋白寡聚物或将其破坏和/或去毒化。该有效性特别是提高1%、2、3、4、5、6、7、8、9，特别是10%、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.9，特别有利地甚至100%。
对此，将具有各种Aβ-构象异构体（Konformer）的样品测试性地在简单的情况中例如分级（fraktioniert）。在每种级分中，根据分级步骤使各种构象异构体如单体、寡聚物、原纤维或更高级的聚集物富集，然后可以精确测定。
术语“精确测定”包括在分级时通过已知类型和性质的分子进行校准步骤。在分级之后，在每种级分中仅存在特定类型的Aβ构象异构体，例如单体、寡聚物或原纤维等。
例如，这些构象异构体在作为分级步骤的密度梯度离心时根据其s值或沉降系数分离。不同大小的分子可以具有相同的流体动力学半径，但仍具有不同的s值并据此分离。通过用已知s值的分子进行校准，将借助密度梯度离心所获的Aβ构象异构体根据其s值精确测定。
此外，使用或不用活性物质处理所获级分并例如通过RP-HPLC测定。以此方式能够测定所述活性物质的有效性。
以下介绍另一种方法。为了定量分析活性物质，可以使用所谓的QIAD测试（Aβ 聚集物尺寸分布干涉的定量测定）。样品中的活性物质对淀粉状肽和/或蛋白的颗粒尺寸分布的影响的定量分析方法在此具有以下步骤。首先使A-β在受控条件下聚集，以产生各种不同的A-β聚集物。这样选择该条件，以形成特别多的特别细胞毒性的小的A-β寡聚物。然后，将待检验的物质例如本发明环化肽之一加入到样品中。该活性物质改变样品中的颗粒尺寸分布。定量确定该变化。该变化是减少或甚至完全消除特定颗粒尺寸的特定毒性物类的量度。通过QIAD法测量特定颗粒尺寸的A-β聚集物的增加或减少。虽然某些具有特定尺寸的A-β聚集物一开始就存在于样品中，它们在活性物质的影响下减少或甚至完全消除。其它颗粒尺寸在活性物质的影响下增加或保持恒定。由A-β形成的颗粒优选根据其流体动力学颗粒半径彼此分离。以此方式有利地导致从样品中获得多个级分。具有特定聚集物尺寸的淀粉状肽和/或蛋白的颗粒富集在这些级分中。颗粒分离可以通过密度梯度离心进行。这些级分例如通过吸移在空间上彼此分离。随后，在各个级分中的A-β浓度通过A-β物类的完全变性在紧随所述分级之后进行的反相（RP-）HPLC过程中测定。聚集物变性可以例如用30%乙腈和0.1%三氟乙酸在80℃的柱温度下完全地进行，并在C8柱上根据疏水性分离。洗脱的A-β借助UV吸收在215 nm下检测。峰面积可以通过Agilent Chemstation软件进行积分。由此产生的数值用之前实施的校准进行计算，由此可以计算存在于各个级分中的A-β的浓度。对每个级分可以计算来自多个例如六个彼此独立进行的实验的平均值与所得的标准偏差。HPLC分析的优点在于，能够不依赖于聚集物状态和溶剂而非常敏感地检测（例如大约20 nM或1.8 ngAβ1-42）并可靠定量。该方法的决定性优点是密度梯度离心和反向HPLC的联用，其还实现Aβ寡聚物的可靠定量。
β淀粉状蛋白物类和特别是β淀粉状蛋白寡聚物的提高的消除（或形成）有效性的本发明效果可以用该方法实现，但不仅是用该方法。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述提高的亲和性和消除、去毒化（或形成）有效性的效果甚至出现在体外和/或体内。
所述环化肽可以具有连接物基团。术语“连接物基团”优选表示：在分子例如D3中的额外的单个氨基酸，其本身可在治疗阿尔茨海默痴呆症中用于结合A-β成分。通过该额外的氨基酸，不应损害环化肽与A-β的结合。
对于可根据本发明使用的环状肽的某些示例性的序列如下所示：
cD3: rprtrlhthrnr（SEQ ID NO:8）、
cRD2: ptlhthnrrrrr（SEQ ID NO:3）或其多倍体和同源物。
根据本发明有利地包括所有其它的与A-β有效结合的环化形式的线性肽。
在本发明的一个特别有利的实施方案中，本发明的肽具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个分别本身单独与A-β有效结合的肽基础单元，其中在此可以是相同或不同的肽基础单元。这些肽基础单元头头、尾尾或头尾线性偶合，并用或不用额外的连接物基础单元（例如一个或多个氨基酸）总体上通过共价键合例如经由其两个末端而环化。
所述至少两个肽单体单元可以在此又例如经由生物素基团和链霉亲和素四聚体共价或非共价地相互键合。所述肽的特征在于头头、尾尾或头尾线性偶合的单元。
仅示例性提及：
cRD2D3: ptlhthnrrrrrrprtrlhthrnr（SEQ ID NO:1）、
cD3D3: rprtrlhthrnrrprtrlhthrnr（SEQ ID NO:2）、
cRD2: ptlhthnrrrrr（SEQ ID NO:3）、
cRD2RD2, ptlhthnrrrrrptlhthnrrrrr（SEQ ID NO:4）、
cD3r, rprtrlhthrnrr（SEQ ID NO:5）、
cD3p, rprtrlhthrnrp（SEQ ID NO:6）、
cD3a, rprtrlhthrnra（SEQ ID NO:7）、
cD3: rprtrlhthrnr（SEQ ID NO:8）、
cDB3, rpitrlrthqnr（SEQ ID NO:9）、
cDB3DB3, rpitrlrthqnrrpitrlrthqnr（SEQ ID NO:10）、
cD3(p2k), rkrtrlhthrnr（SEQ ID NO:11）
或其多倍体和同源物。
还可以由上述序列中2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个的各种任意组合以环化形式形成本发明的肽。
因为治疗处理的目标分子优选是A-β寡聚物并因此当然是多价靶，在本发明的一个特别优选的实施方案中对于治疗，即消灭存在的A-β寡聚物使用如下物质，该物质由已有效结合A-β寡聚物的单元的多个复制体（Kopie）或由已有效结合A-β寡聚物的多个各种单元组成。该肽同样是环化的。在这种情况下，本发明的肽还包含本身与A-β物类和特别是寡聚物有效结合的多个肽基础单元，其分别由氨基酸构成并总体上通过共价键合环化。
在另一个变型中，所述肽基础单元具有上述序列的片段，或具有与上述序列同源的序列。
“同源序列”或者“同源物”在本发明中表示，氨基酸序列与所述单体的上述氨基酸序列之一具有至少50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 %的同一性。代替术语“同一性”，在本说明书中同义地使用术语“同源”或者“同源性”。两个核酸序列或多肽序列之间的同一性借助基于Smith, T.F.和Waterman, M.S（Adv.Appl.Math.2:482-489 (1981)）的算法的BESTFIT程序的比较来计算，其中通过设定以下氨基酸参数：空位产生罚分:8和空位扩展罚分:2；和以下核酸参数：空位产生罚分:50和空位扩展罚分:3。优选地，两个核酸序列或多肽序列之间的同一性通过在各自情况下整个序列长度上的核酸序列/多肽序列的同一性来定义，如借助基于Needleman, S.B.和Wunsch, C.D.（J. Mol.Biol.48:443-453）的算法的GAP程序的比较来计算，其中通过设定以下氨基酸参数：空位产生罚分:8和空位扩展罚分:2；和以下核酸参数：空位产生罚分:50和空位扩展罚分:3。
两个氨基酸序列当它们具有相同的氨基酸序列时，在本发明中则是相同的。
特别地，具有在环化之后得到不再可区分的相同氨基酸次序的氨基酸序列的所有线性肽在本发明中相同。实例：D3的线性氨基酸序列是rprtrlhthrnr。通过N端氨基和C端羧基的酰胺键键合的相应的环化肽“cD3”不再能与环化肽prtrlhthrnrr、rtrlhthrnrrp、trlhthrnrrpr、rlhthrnrrprt、lhthrnrrprtr、hthrnrrprtrl、thrnrrprtrlh、hrnrrprtrlht、rnrrprtrlhth、nrrprtrlhthr或rrprtrlhthrn区分。此外，本发明的环化肽相比于可衍生出其的结合性的线性肽的至少一种，优选相比于各种而言，具有亲和性和有效性方面的正面效果。也就是说在环化D3的情况下，相比于具有序列prtrlhthrnrr、rtrlhthrnrrp、trlhthrnrrpr、rlhthrnrrprt、lhthrnrrprtr、hthrnrrprtrl、thrnrrprtrlh、hrnrrprtrlht、rnrrprtrlhth、nrrprtrlhthr或rrprtrlhthrn的结合性的线性肽。本发明的环化肽在这方面表现出a)相比于可衍生出其的线性肽的至少一种，优选每种而言更高的与β淀粉状蛋白物类的结合亲和性。本发明的环化肽表现出b)相比于可衍生出该环化肽的结合性的线性肽的至少一种，优选每种而言在阻止形成和/或去毒化尤其β淀粉状蛋白寡聚物方面更高的有效性。上述环化D3在此仅理解为示例性。但是，该效果也特别还不仅仅出现于具有SEQ ID NO: 1-11的环化肽的情况下。
在一个变型中，同源物理解为上述基础单元的相应的逆反序列。术语“逆反序列”根据本发明表示这样的氨基酸序列，其由对映异构体形式的氨基酸组成（反：α-C原子的手性相反）且其中原始氨基酸序列的序列次序还是相反的（逆=向后）。
本发明的肽基础单元和肽聚合物（通常称为本发明的肽）适合用于医药中。
在一个实施方案中，这是用于治疗阿尔茨海默症的本发明的肽。在另一个实施方案中，这是可用于治疗帕金森、CJD（库贾氏病）、ALS（肌萎缩性侧束硬化症）或其它神经变性疾病或糖尿病的本发明的肽。
本发明的另一主题是试剂盒，其含有本发明的肽。在此类试剂盒中，本发明的肽可以在容器中任选与缓冲剂或溶剂一起包装或包装在其中。该试剂盒的所有组分可以在相同容器中或分别分开包装。此外，该试剂盒可以含有其使用说明。此类试剂盒例如可以在具有塞子和/或隔膜的注射瓶中包含本发明的肽。此外，其中还例如含有一次性注射器。
本发明此外涉及本发明的肽作为用于识别、定性和/或定量测定尤其β淀粉状蛋白寡聚物的探针的用途。本发明的主题还是这样的探针，其含有本发明的肽用于识别、定性和/或定量测定尤其β淀粉状蛋白寡聚物。
此类探针特别重要，因为由此使早期诊断阿尔茨海默痴呆症成为可能。由此，可以在非常早的阶段就对抗该疾病。此外，可以因此追踪该疾病或治疗实验或治疗的进展。
此类分子探针含有本发明的肽并可对患者例如静脉内注射。该探针的其它成分可以为：染料、荧光染料、放射性同位素（例如用于PET）、钆（用于MRI）和/或在成像中用于探针的成分。在穿过血脑障壁之前或之后，该探针可以特别地与A-β寡聚物和/或斑块结合。如此标记的β淀粉状蛋白物类和特别是A-β寡聚物和/或斑块可以借助成像法如SPECT、PET、CT、MRT、NIR（近红外）、质子MR波谱等可见。
本发明的另一主题是所述环化肽用于阻止毒性β淀粉状蛋白寡聚物增多和/或形成和/或将其去毒化的用途。本发明的肽因此还用于形成非毒性的肽-β淀粉状蛋白寡聚物-复合体。
本发明的主题还是含有本发明的肽的组合物，其特别用于治疗或预防阿尔茨海默症。
本发明的主题此外是含有本发明的肽的组合物，其特别用于阻止毒性A-β寡聚物或用于破坏由其形成的聚合物和原纤维。
本发明的“组合物”可以例如是疫苗、药物（例如以片剂形式）、注射溶液、食品或食品添加剂，其在可基于专业知识制备的制剂中含有本发明的肽。
本发明的肽通过结合A-β寡聚物或由其形成的聚集物以及原纤维并因此转变为非毒性化合物，将它们去毒化。能够抑制形成原纤维的物质不一定必须能够破坏预成形的原纤维，因为预成形的A-β原纤维非常稳定且只能极困难和缓慢地再次破坏。
因此，本发明的主题还是用于将A-β寡聚物、由其形成的聚合物或原纤维去毒化的方法。
认识到，当已存在A-β时，治疗目标必须是将其通过具有尽可能最高的与A-β的亲和性的物质来解决。实际上，该亲和性可能完全不够大，本发明肽的相应的解离常数则位于pM范围中或还更低。
此外认识到，预防和治疗之间的重要区别在于以下考虑。为了阻止形成最初A-β寡聚物，少许亲和且有效的A-β配体可能就已足够。因为由多个A-β单体形成A-β寡聚物是非常高阶的反应，其极高度依赖于A-β单体浓度。甚至活性A-β单体浓度的少许降低可因此阻止形成最初的A-β寡聚物。这是在预防时的情况。
但是，如果已产生A-β寡聚物，其可（类似朊病毒）增多，这不是高阶反应并因此几乎不依赖于A-β单体浓度。这是在治疗时的情况。因此如果已产生A-β寡聚物，治疗目标必须是将其通过具有尽可能最高的与A-β寡聚物的亲和性和/或特别有效地消除它们和/或特别有效地阻止其形成的物质来解决。相应的解离常数对此必须位于亚-µM、nM或pM范围中或甚至更低。在本发明中是这种情况，并且本发明的环化肽在治疗时以相对低的解离常数结合β淀粉状蛋白物类，特别是A-β寡聚物。
由于其结合可自由扩散的小的A-β寡聚物、较大的A-β寡聚物直至原纤维的性能，本发明的肽可用于阿尔茨海默痴呆症的所有阶段中。基于本发明的教导，可以制备还选择性地与各种形式的A-β寡聚物结合的肽。
除了已提及的用于制备本发明肽的方法以外，例如肽合成法、蛋白重组制备和公认的用于任意的所谓低分子量化合物的有机合成法是可行的。
可设想的特别是所述线性分子的共价环化。由此特别地避免肽链的一个，有利地甚至两个开放末端。这一方面提高肽在动物和人中的稳定性，这导致明显更有利的药代动力学性能。但是通过环化，还特别有利地导致非结合态的肽的可能构象数目剧烈减少。由此又减小游离态的熵，这再次使结合反应的熵部分变得更有利以有助于与目标分子Aβ形成复合体。相比于可衍生出所述环化肽的结合性的线性肽，由此最终明显提高与目标分子的亲和性。消除和/或阻止形成毒性β淀粉状蛋白物类和特别是β淀粉状蛋白寡聚物的有效性同样如此。本发明的效果在此是决定性的，还可提到仅为环化的有利副作用的可能提高的稳定性。
该环化例如通过线性肽的头尾（头与尾）或者尾头（尾与头）或其它环化进行。可以在此考虑各种可能的环化。
因为治疗处理的目标分子特别是A-β寡聚物并因此当然是多价靶，想法是由已有效结合A-β寡聚物的肽单元的多个复制体制备用于治疗（消灭存在的A-β寡聚物）的物质，其有利地还是环化的。在该情况下，所述肽包含多个本身就与A-β寡聚物有效结合的肽基础单元，其分别由氨基酸线性构成并总体上在其剩余的两个末端之间共价相连成为环。
通过该措施，有利地导致KD的进一步降低。因此有利地导致，至少理论上和在不存在例如由于位阻的干扰性影响下，以x的解离常数（KD）与A-β寡聚物结合的结合A-β寡聚物单元的n聚体达到x的n次方的表观KD。
在此存在多种实现这一点的可能方式：结合A-β寡聚物的单元，即肽单体单元可以例如经由生物素基团和链霉亲和素四聚体共价或非共价地相互键合。
共价键合可以通过单体单元头头、尾尾或头尾线性偶合且不使用连接物基团或使用连接物基团来实现。在此，还可以重组不相同的单体单元，并根据本发明进行环化。
实施例
此外，借助实施例和所附的附图进一步阐述本发明。由此，决不限制本发明。相反地，本领域技术人员清楚在其专业知识范围内，被证明与A-β物类有效结合的其它肽能以环化形式制备并可用于预防和治疗阿尔茨海默痴呆症。
图1展示了在加入线性D3（现有技术）和cD3（环化D3）之后标准化的密度梯度离心的级分变化。D3（加阴影的条）和cD3（黑色）对A-β聚集物的尺寸分布的影响的对比（白色的对照）表明了cD3比线性D3还更有效地消除级分4至8中的寡聚物。
图2：展示对于β淀粉状蛋白单体的KD值（动力学）。
图3：展示了对于β淀粉状蛋白寡聚物的KD值（动力学）。
图4：展示了对于β淀粉状蛋白原纤维的KD值（动力学）。
图5：Moris水迷宫测试（MWW）。
名为D3的D-对映异构体线性肽由公开文献WO 02081505 A2已知。通过对于主要单体的A-β（1-42）的镜像噬菌体展示选择进行识别，计划是通过结合使其稳定并阻止其转变为毒性A-β聚集物。根据目前所知，D3优选结合特别毒性的A-β寡聚物，将其沉淀并同时将其转变为非毒性、非淀粉状和ThT阴性的无定形聚集体。在动物模型中，甚至通过用饮用水口服给药D3实现使经治疗的转基因AD小鼠含有明显更少的斑块并具有显著改进的认知能力。
第一实施例
第一实施例涉及展示在β淀粉状蛋白寡聚物降解时通过环化提高D3有效性或效率。对此，将结合性的线性肽D3的第一和最后氨基酸的N端和C端通过肽键共价键合。
根据本发明环化的D3（“cD3”）获自peptides&elephants GmbH公司（位于Mühlenberg 11, 14476 Potsdam-Golm，德国）。
为了由密度梯度离心制备级分，使用下列方法。将构象异构体根据其s值或沉降系数分离。不同大小的分子可以具有相同的流体动力学半径，但仍具有不同的s值并据此分离。通过用已知s值的分子进行校准，将借助密度梯度离心所获的A-β构象异构体根据其s值精确测定。所述密度梯度离心在此具有优点，即用其可将所有A-β构象异构体在单个方法步骤中彼此分离。通过在固定之前使用密度梯度离心步骤，其中将寡聚物或更高级的A-β寡聚物形式分层在预先形成的密度梯度上并且将包含于其中的聚集物颗粒根据其s值通过超离心而分离，可以在离心过程中将不同A-β聚集物（寡聚物和原纤维或无定形聚集物）根据其尤其依赖于颗粒尺寸的沉降系数彼此分离并分级。具有所希望的A-β构象异构体的级分可以随后直接注射到负载有链霉亲和素的传感器表面上以固定。密度梯度的准备通过随后将浓度为50 %（260 µl）、40 %（260 µl）、30 %（260 µl）、20 %（260 µl）、10 %（260 µl）和5 %（100 µl）（体积/体积）的密度梯度溶液（稀释在10 mM磷酸钠缓冲液pH 7.4中的碘克沙醇）叠层来进行。然后，将样品移液至密度梯度上并在4℃和259000 g下进行离心3小时。这时从密度梯度中从上向下取出总共14个各140 µl的级分。单体存在于第一级分中，寡聚物特别存在于级分4之上，原纤维通常位于级分11至13。
不处理来自密度梯度离心的所获级分（对照：分别左边的未填色的柱）或者用现有技术已知的D3（D3, 20 µM：分别中间的加阴影的柱）或用分子D3的其中第一和最后氨基酸的N端和C端通过肽键共价键合的环化变体（cD3, 20 µM：分别右边的黑色柱）处理。
结果示于图1中。明显的是，环化cD3有利地对级分1-2的A-β单体浓度不显示影响。
但是对于级分4-8或4-10，可有利地看出A-β单体浓度明显减少。
可比拟的效果也出现在其余的本发明肽的情况中。
第二实施例：
下列步骤涉及亲和性研究以及对特别毒性的β淀粉状蛋白寡聚物降解的研究。
制备Aβ单体、寡聚物和原纤维
将1 mg冻干的Aβ1-42和N端生物素化的Aβ1-42分别溶解在1 ml 100%六氟异丙醇（HFIP）中并在室温下溶解过夜。对于寡聚物和原细胞制备，以1:10的比例使用非生物素化的Aβ与N端生物素化的Aβ并使HFIP蒸发（Eppendorf的浓缩器5301）。产生的Aβ薄膜以80 µM的最终浓度吸收在磷酸钠缓冲液（10 mM, pH 7.4）中并温育（RT, 600 rpm）。在寡聚物制备时的温育时间为3 h，在原纤维制备时为24 h。为了制备单体，使用不温育的100% N端生物素化的Aβ1-42。
密度梯度离心
在Aβ制备之后进行密度梯度离心，以将各种Aβ物类根据其尺寸提纯。为此，使用10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4中的碘克沙醇梯度，其具有碘克沙醇的从50%至5%体积/体积的增大浓度。施涂100 µl的Aβ样品并借助超离心分离（3 h, 4℃, 259000 g）。然后，将梯度分级为14个各140 µl的级分。单体Aβ位于上部开始的两个级分，Aβ寡聚物在级分4至6中，Aβ原纤维在级分11至13中。
用于SPR波谱（表面等离子共振）的固定
对于SPR波谱使用Biacore（GE Healthcare）的T200。借助密度梯度离心提纯的Aβ物类直接借助生物素-链霉亲和素-偶联根据制造商说明固定在传感器芯片（系列S传感器芯片SA）上。1X PBS充当流动缓冲液。在25℃下和5 µl/min的流速下进行负载。然后从流动池中在30 µl/min的持续流动下过夜除去非特异性结合的配体。
结合动力学
结合动力学同样借助SPR波谱在Biacore（GE Healthcare）的T200仪上测量。标准条件为5℃和30 µl/min的流速。D肽的各种冻干物吸收在流动缓冲液1X PBS中并连续缓冲。“单循环”动力学作为方法，其中将五个增大的分析物浓度泵送通过固定化的流动池。根据分析物选择接触时间90-120 s用于联合和解离以及1800-5400 s用于最终解离。传感器图借助非负载的流动池和所用流动缓冲液双重关联。借助动力学拟合模型（异相结合模型）使用Biacore T200评估软件（2.0版本）评估结合曲线。
图2-4展示了本发明环化肽的结合行为的结果（亲和性研究）。在这些图中的是各种受试物与β淀粉状蛋白单体（图2）、β淀粉状蛋白寡聚物（图3）、β淀粉状蛋白原纤维（图4）的结合强度的动力学评估数据。所示分别为两个结合常数，其在异相结合模型拟合时产生，并分别绘制为白色条和黑色条。重要的是在此应看出对数标度，这表示条尺寸中的小差别是解离常数KD中的大差别。白色条分别是低亲和性位点，即低亲和性结合位点及其结合强度，黑色条显示高亲和性结合位点及其结合强度。
表明了，仅在线性肽D3的情况中，均相1:1结合模型足以拟合结合曲线。
此外表明，在所用环化肽的几乎所有情况中，对于低亲和性结合位点的白色条类似高。相反地，在黑色条显示的高亲和性结合位点中产生大的差别。
此外明显的是，在单体的情况中，环状cD3r（SEQ ID NO:5）获得非常好的效果（图2），即具有特别高的亲和性。
在特别令人感兴趣的寡聚物的情况中，cD3r的结合比本发明的其它环化肽强甚至2个数量级（图3）。
在原纤维的情况中，cD3r相比于本发明的其它肽而言获得非常好的效果，其中在此特别的是本发明的肽cD3P2K（SEQ ID NO:11）获得极好的效果并且甚至达到亚pM的结合范围中（图4）。
在图2-4中的R最大值说明，各个KD如何强烈地贡献于总负载能力。例如对于寡聚物（图3），对于肽cD3z给出79/21%的R最大。cD3z表示cD3零，即不具有其它氨基酸附着物的环化D3。白色条表明，低亲和性位点可以产生RU总负载强度的总共79%，KD2产生RU总共21%。这表示，对于这些肽存在结合位点的大约1:4的比例，即存在的低亲和性位点为高亲和性位点的大约4倍这么多。
在实验的结合数据的拟合时对于线性肽D3未出现高亲和性位点的事实可以如下解释，即其未与高亲和性位点结合，或对于高亲和性位点和低亲和性位点的亲和性不可区分。
由这些数据显而易见，线性D3在β淀粉状蛋白寡聚物中仅结合低亲和性位点，而不结合高亲和性位点。
图5展示了来自MWW测试的体内数据。通过该测试测量动物，在此改性的APPsDI小鼠的空间记忆。这些小鼠展现出行为问题和生物化学变化，其表明阿尔茨海默痴呆症的一方面，即记忆障碍。
在此，以秒为单位测量动物为了再次找到水桶中紧靠在水表面下隐藏的平台所需要的时间。这在连读几天的每天多个实验中测量。统计学评估然后得出，经治疗的动物相比于对照组是否更好地学习再次找到平台。绘制的是用本发明的肽cD3r治疗的小鼠相比于安慰剂实验（盐水）在连续五天中以秒为单位的寻找时间。
用环化肽cD3r治疗的动物显著学习了（非参数弗里德曼试验，渐进显著性cD3r =0.014；渐进显著性盐水 =0.238）。
Figure IDA0000950105280000011
Figure IDA0000950105280000021
Figure IDA0000950105280000031
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Claims (19)

1.肽，其包含至少一种与β淀粉状蛋白物类结合的肽，其中所述肽具有能够使其与A-β结合的线性氨基酸序列，并且通过使所述肽经由共价键合以环化形式存在，所述性能保持或增强，所述肽的特征在于呈环化形式的根据序列SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:11之一的至少一种结构。
2.根据权利要求1的肽，其特征在于，其基本上由D-对映异构体氨基酸组成。
3.根据权利要求1或2的肽，其特征在于，所述环化肽具有相比于可衍生出其的线性肽而言更高的与β淀粉状蛋白物类的结合亲和性。
4.根据权利要求1或2的肽，其特征在于，所述环化肽在阻止形成β淀粉状蛋白寡聚物和/或将其去毒化和/或消除时具有相比于可衍生出其的线性肽而言更高的有效性。
5.根据权利要求1或2的肽，其特征在于，其以最高1 μM的解离常数（KD-值）结合β淀粉状蛋白寡聚物。
6.根据权利要求1或2的肽， 其特征在于，其不具有所述肽链的开放末端。
7.根据权利要求1或2的肽，其特征在于，其由于缺少所述肽链中的开放末端，在动物和人中是药理学上稳定的。
8.根据权利要求1或2的肽，其在环化肽内的任意位置处具有或不具有一个或多个连接物基团。
9.根据权利要求1或2的肽，其特征在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个各自与A-β物类有效结合的线性肽基础单元，其中由此产生的整个肽共价键合并因此以环化形式存在。
10.根据权利要求1或2的肽，其特征在于相同或不同的肽基础单元的键合。
11.根据权利要求1或2的肽，其特征在于相互共价键合的肽基础单元。
12.根据权利要求1或2的肽，其特征在于头头、尾尾或头尾线性偶联的肽基础单元。
13.根据权利要求1或2的肽，其用于医药中。
14.试剂盒，其含有至少一种根据权利要求1至13任一项的肽。
15.探针，其含有至少一种根据权利要求1至13任一项的肽。
16.组合物，其含有至少一种根据权利要求1至13任一项的肽，其用于治疗阿尔茨海默症。
17.根据权利要求1至16任一项的肽用于制备用于识别、定性和/或定量测定β淀粉状蛋白物类的试剂盒或探针的用途。
18.根据权利要求1至16任一项的肽用于制备用于阻止形成β淀粉状蛋白寡聚物和/或将其破坏和/或去毒化的药物的用途。
19.根据权利要求1至16任一项的肽用于制备用于形成非毒性的聚合物-β淀粉状蛋白寡聚物-复合体的药物的用途。
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