CN105744963A - 用于提高表面的生物相容性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于提高表面(1),特别是固体表面的生物相容性的方法,以及器材(3),例如植入物、传感器或细胞培养容器,使其与具有生物相容性表面的生物系统接触。为了以简单的方式和对于多种不同表面提高表面特别是针对细胞培养和组织的生物相容性,根据本发明使表面(1)与反应性自由基(2)接触。根据本发明的器材(3)具有根据本发明的方法处理过的生物相容性表面(1)。
Description
技术领域
本发明涉及用于提高表面特别是固体表面的生物相容性的方法。
本发明进一步涉及一种带有生物相容性表面的器材,例如与生物系统接触的植入物,传感器或细胞培养容器。
背景技术
与生物系统接触的材料必须具有高的生物相容性,即:(I)所述材料必须对于该生物系统没有损害作用和(II)所述生物环境必须不造成任何材料变化如腐蚀、生物降解等。
为了增加材料的生物相容性,存在用于表面改性的各种不同的机械、化学和物理方法。通过机械改性(例如,通过抛光或研磨),应当达到规定的表面形貌或粗糙度水平,应当除去表面的杂质和应当提高对于随后的分子结合过程的粘附性能(I.R.Rudolf,K.T.Z.V.A.D.Materialiintehnologije/MaterialsandTechnology46(2012)251–256)。
通过与特定的试剂直接反应、通过表面上分子的共价结合、通过基于等离子体的技术如等离子体支持的蚀刻、沉积或聚合以及等离子体-浸没离子注入,表面可以化学地改性(P.K.Chu,J.Y.Chen,L.P.Wang,N.Huang,Mater.Sci.Eng.,R36(2002)143–206)。
Liu,Chu和Ding提供了用于生物医学应用的钛和钛合金表面改性的不同可能性的综述(X.Liu,P.K.Chu,C.Ding,Mater.Sci.Eng.,R47(2004)49–121)。钛表面可以用酸或苛性碱溶液进行化学处理。此外,化学改性包括溶胶-凝胶涂敷、阳极氧化、化学气相沉积以及生物化学改性。在物理途径中,钛表面可以通过热喷雾(例如火焰喷雾或等离子体喷雾)、通过物理气相沉积或通过离子注入或离子沉积进行改性。就电化学来说,钛表面的生物相容性可以通过阳极氧化和通过羟基磷灰石电泳或阴极沉积提高(K.-H.Kim,N.Ramaswamy,Dent.Mater.J.28(2009)20–36)。
另外,对于聚合物表面改性描述了不同的物理和化学方法(F.Abbasi,H.Mirzadeh,A.-A.Katbab,Polym.Int.50(2001)1279–1287)。用于硅酮聚合物表面改性的最通常的物理方法是等离子体处理和激光处理以及电晕放电。硅酮聚合物表面可以通过蚀刻、氧化、水解、官能化以及“表面接枝”进行化学改性。
对于所有提及的方法,表面性能会被改变以便以不同的方式增加生物相容性。
发明内容
本发明的目的是提供用于表面处理的方法,其使得以简单的方式提高了表面的特别是针对细胞培养物和组织的生物相容性和可用于多种不同的表面,特别是用于固体表面。
根据本发明实现了上述目的,其方式在于该表面用至少一种反应性自由基进行处理。通过用本发明的方法处理其生物相容性表面,开始提及的器材解决了所述问题。
根据本发明,令人惊讶地显示出的是用至少一种反应性自由基的表面处理使得表面去毒和由此提高了该表面的生物相容性。与现有方法相反,所述表面通过反应性自由基去毒,这在不向该表面添加例如额外的层的情况下增加了其与生物系统的生物相容性。
另外的优点在于所述自由基可以以非常不同的方式生成和该方法因此可以适应于不同的材料要求。如果所述目标是要改善例如热敏表面的生物相容性,则所述自由基可以例如在环境温度下通过芬顿反应产生。如果所述表面要尽可能不使用化学物质地进行处理,光分解或辐射分解可以例如用于自由基生成。
“反应性自由基”是带有至少一个反应性未成对电子的原子或分子。反应性自由基通常非常迅速地反应,常常在小于一秒之内。至少一种反应性自由基包含其中表面仅用单一类型的自由基(自由基原子、自由基离子、自由基分子或自由基分子离子)处理的实施方案以及其中不同类型的自由基与该表面接触的实施方案。在本发明的意义上生物相容性的提高通过该表面的去毒性而表现出来,即:与没有与反应性自由基接触的未处理表面相比,根据本发明的经处理的表面是较小细胞毒性的,即:较小的细胞和/或组织损害。提高的生物相容性可以通过细胞毒性试验测定,其中将未处理的表面和在一种情况中,用反应性自由基处理的表面与细胞培养物接触,和其中随后在溶液中测定细胞活力。通过根据本发明的方法,细胞活力可以升高至少10%,优选至少25%和特别优选至少50-100%。
根据本发明的解决方案可以通过不同的实施方案进一步提高,所述实施方案分别是自身有利的和可以以任何方式相互任意组合。这些实施方案和相关优点下面说明。
根据本方法的一个实施方案,所述反应性自由基可以使表面的触发生物反应和具有细胞和/或组织损害作用的活性中心失活。因此,表面上触发细胞毒性反应的活性中心通过用反应性自由基处理有目的地和特定地失活。这是令人惊讶和出乎意料的,因为人们预期反应性自由基在表面上触发生成活性中心和因此具有细胞毒性作用的化学反应。触发细胞毒性反应的活性中心是细胞表面上具有细胞和/或组织损害作用的原子或物质。通过反应性自由基,这些活性中心可以例如通过转变成非细胞毒性的物质或通过从细胞表面提取,例如通过反应裂解/反应断裂,而有目的地和特定地失活。
根据一个另外的实施方案,所述反应性自由基可以包含氧自由基、氮自由基、碳自由基、硫自由基和/或卤素自由基类中的至少一种。反应性氧自由基包括其中至少一个未成对电子位于氧原子上的所有自由基。氧自由基的实例是超氧化物阴离子、羟基自由基、过氧羟自由基、过氧自由基或烃氧基自由基。氮自由基的实例是一氧化氮或氮3(tri-nitrogen)。碳自由基包含例如三重态卡宾和烷基自由基,和硫自由基包括例如含硫自由基。卤素自由基包含,尤其是,氯自由基和溴自由基。
根据一个另外的实施方案,反应性自由基可以通过自由基起始剂断裂生成。自由基起始剂是可以转变成至少一个反应性自由基的分子。例如,分子氯(Cl2)中的氯-氯键或分子溴(Br2)中的溴-溴键可以通过光的影响裂解,由此所述分子自由基起始剂转变成反应性自由基。
根据一个实施方案,可以使所述表面与自由基起始剂接触,与反应性自由基相反,所述自由基起始剂通常是稳定的,和所述自由基起始剂可以随后原位转变成反应性自由基。这样,可以确保整个表面被均匀地处理。
所述自由基起始剂可以通过光分解、辐射分解、热分解、通过等离子体和/或通过化学的例如电化学的和/或生物化学的例如酶反应转变成反应性自由基。因此所述自由基生成可以以不同的途径并与待处理表面性能相适应地发生,例如通过光、例如UV辐射,或使用X射线和其它电离辐射非热方式。在环境温度下也可以化学转变,例如以化学或电化学芬顿反应形式,其中过氧化氢通过与Fe(II)离子或者与其它过渡金属离子如Cu(II)、Ti(III)、Cr(II)或Co(II)在酸性介质中反应分解,同时形成高度反应性的羟基自由基。
根据本发明的方法的一个另外的实施方案,所述反应性自由基可以是羟基自由基。羟基自由基可以以简单方式从生物无害物质如水中生成。羟基自由基特别可以如下形成:
a)在芬顿反应中;
b)通过过氧化物光分解;
c)通过水或可以辐射分解为羟基自由基的其它含氧化合物辐射分解;或
d)通过等离子体处理可转变成羟基自由基的含氧化合物优选水或过氧化物的等离子体反应。
其生物相容性通过根据本发明的方法提高了的表面可以例如包括贵金属、贵金属化合物和/或合金、或聚合物。贵金属如金常在生物传感器中用作电极和作为植入材料。植入物和细胞培养容器常常由聚合物制成,尽管它们在生物环境中并不造成任何材料变化如腐蚀,但是它们对于生物系统具有细胞和/或组织损害作用,因此其生物相容性可以通过根据本发明的方法提高。
根据一个另外的实施方案,所述表面可以属于植入物、传感器或细胞培养容器。优点是所述植入物、传感器和/或培养容器可以首先制备和随后根据本发明进行处理。根据本发明的方法是通用的,即:它可以用于任何种类的表面和任何表面类型,因为对于规定种类的表面和/或规定的表面类型来说可以通过与材料要求匹配的各种不同的方法提供特别合适的反应性自由基。
根据本发明,进一步提供了与生物系统接触的带有根据上述方法之一进行了处理的生物相容性表面的器材,例如植入物、传感器或细胞培养容器。所述器材特征在于具有提高的生物相容性的表面,这可以简单地通过以下方式检验:当比较反应性自由基处理之前的表面与用反应性自由基处理过的表面时,在与细胞培养物接触时后者显示出高得多的细胞活力。根据本发明的器材的另一特征在于:触发生物反应和具有细胞和/或组织损害作用的活性中心有针对性地失活,即:转变为生物非活性的分子,或者例如在生物活性金离子的情况下,从表面分离。
下面,通过示例性实施方案参考附图和具体实验更详细地解释本发明。按照上面的解释,实施方案中以示例性的方式所示的特征的组合可以通过根据本发明的器材或根据本发明的方法的用于特定的使用情况要求的性能通过另外的特征补充。同样,也按照上面的解释,如果个别特征的作用在特定的使用情况下不相关,对于描述的实施方案可以忽略该特征。
附图说明
附图中相同的附图标记用于具有相同功能和/或相同结构的元件。
附图表明:
图1:用于根据第一实施方案提高表面的生物相容性的根据本发明的方法的示意图;
图2:用于根据第二实施方案提高表面的生物相容性的方法示意图;
图3:关于细胞活性作为从金表面分离的金的质量的函数的曲线图;
图4:在小鼠腹膜腔中(a)植入之前机械抛光的金表面,(b)植入之后机械抛光的金表面,(c)植入之前“芬顿抛光的”金表面和(d)植入之后“芬顿抛光的”金表面的AFM图像和横截面分析。
具体实施方式
下面,将参考图1的示意性图解释用于提高表面1,在图1的示意性图中为固体表面的生物相容性的根据本发明的方法的第一实施方案。使所述表面1与反应性自由基2接触。所述自由基可以具有n个未成对电子(表示为·)。含有两个未成对电子的自由基称为双自由基;在三个未成对电子的情况下,其称为三自由基等。
所述表面1可以是其生物相容性要提高的器材3例如植入物、传感器或细胞培养容器的表面。
反应性自由基2导致表面1的触发生物反应和具有细胞和/或组织损害作用的活性中心4失活。活性中心4在附图中示意地标记为包括星形的圆环,其中所述星形象征着细胞毒性作用,即:活性中心4的细胞和/或组织损害性能。
如图1中右侧所示,反应性自由基2使表面1的活性中心4失活。失活可以例如如图1顶部右侧所示通过所述活性中心4从表面裂解和从此表面分离发生。失活也可以这样发生,即:活性中心4通过反应性自由基2以不再具有细胞和/或组织损害作用的方式转变,其以表示细胞毒性作用的星形在图1的底部不再显示的方式表征。
根据本发明方法的一个另外的实施方案示意性显示在图2中。在图2的实施方案中,反应性自由基2通过自由基起始剂5的裂解生成。与反应性自由基2相反,自由基起始剂5是稳定的,即:反应性较小和更持久。在图2中所示的实施方案的方法中,使自由基起始剂5首先与器材3的表面1接触。随后,自由基起始剂5将原位,即:现场转变成反应性自由基2。对于所述转变,自由基起始剂5通过裂解剂(Spaltagen)6转化为反应性自由基2。
裂解剂6可以是化学物质或酶以及辐射如UV辐射、x射线或电离辐射,以及参数变化,例如温度或压力,其造成自由基起始剂5裂解成为反应性自由基2。取决于表面1的类型和织构,裂解剂6和因此自由基起始剂5的转变方法可以进行选择,其不改变表面1的性能,除了根据本发明提高的生物相容性之外。例如,表面1的生物相容性可以在没有温度升高的情况下通过光分解(光辐射)或辐射分解(电离辐射)得以提高。这对于热敏性表面是特别有利的。
自由基起始剂5通过裂解剂6转变成反应性自由基2之后(图2右侧),根据本发明的第二个实施方案的方法与图1中所示的方法类似地继续进行,由此反应性自由基2通过表面1的活性中心4的有针对性地失活提高了表面1的生物相容性。
根据本发明的教导内容下面将通过具体的实验结果进行解释说明。
1.金层细胞毒性的降低
γ灭菌之后检查不锈钢丝上电沉积的金层的细胞活性。将未处理的金层和用氧自由基处理的金层用人类成年皮肤关节间纤维软骨(NHDF细胞)进行细胞毒性试验。为此,由钢丝产生洗出物和通过比色测定(TTC测定)检查其对NHDF细胞的细胞活力的影响(详细的描述参见:N.Saucedo-Zeni等,Int.J.Oncol.41(2012)1241–1250)。
所述自由基通过芬顿溶液和通过过氧化氢的UV光分解生成。使用下面的芬顿溶液组成:C乙酸盐缓冲液=0.1mol·L-1和整体处理时间总计120分钟,其中每5分钟将“旧的”芬顿溶液被新鲜的芬顿溶液代替。
使用“705UV消解器”(Metrohm,瑞士)通过H2O2的UV光分解得到自由基。表现出的是如果使用0.3%的H2O2溶液,金层30分钟的处理足以完全使金层去毒。
然而未处理的金层中的细胞活力仅仅为20-60%,用反应性氧自由基进行上述处理之后金层的细胞活力总计几乎100%,即:所述金层通过自由基处理完全去毒。
另外,通过ICP-AES用“ICP-OpticalEmissionSpectrometerOptima2100DV”(PerkinElmer,USA)检查使用的芬顿溶液的金含量。在所述方法中发现分离的金的质量越大,细胞活性越高(见图3)。
已知由金植入物释放的金离子是生物活性的(A.Larsen,K.Kolind,D.S.Pedersen,P.Doering,M.Pedersen,G.Danscher,M.Penkowa,M.Stoltenberg,Histochem.Cell.Biol.130(2008)681-692;G.Danscher,A.Larsen,Histochem.Cell.Biol.133(2010)367-373)。在用于细胞活力试验的有机体的情况下(人类皮肤关节间纤维软骨),它们明显地是有毒的。因此,由图3明显可见,分离的金原子是触发生物反应的表面的活性中心。所述表面通过分离这些活性中心去毒。
2.金片植入小鼠腹膜腔
六个金片(大小:15mm×5mm×0.05mm)首先用氧化铝粉末机械抛光。随后将三个机械抛光的金片用通过芬顿溶液生成的氧自由基处理。为此,将所述金片浸入总是新鲜制成的由(NH4)2Fe(SO4)2·6(H2O)(Merck),Na2EDTA·2H2O(cEDTA=1·10- 3molL-1;Merck)和乙酸盐缓冲液(pH=4.7;Merck)组成的溶液中。芬顿反应通过加入(Merck)启动和将所述金片暴露于此溶液5分钟。重复此步骤12次从而整体处理时间总计120分钟。芬顿溶液总是含有10:1比例的和
从机械抛光以及芬顿处理的金片取AFM图像(见图4a和4c)并测定表面的粗糙度因子(见表1)。通过“NanoScopeI”(DigitalInstruments,USA)以接触模式进行AFM测量。
将所述金片植入小鼠腹膜腔中(每只小鼠一片金片)。14天后,将金片从小鼠取出和再次拍摄金表面的AFM图像(见图4b和4d)并测定粗糙度因子(见表1)。
基于AFM图像和粗糙度因子,清楚可见仅通过机械抛光处理的金表面在小鼠腹膜腔中是伸直的,即:生物活性的,即:细胞损害性的金从植入物上分离。机械抛光的并随后用自由基处理的金表面则显示出没有变化的表面粗糙度,因为在表面用反应性自由基处理的过程中活性中心失活。因此,腹膜腔中没有金从金表面分离。这证明了由于用自由基预处理,所以植入物具有较高的生物相容性(不受影响)。
表1:不同的处理过的金表面的粗糙度因子
附图标记
1表面
2反应性自由基
3器材(例如植入物、传感器或细胞培养容器)
4活性中心
5自由基起始剂
6裂解剂
Claims (10)
1.用于提高表面(1)特别是固体表面的生物相容性的方法,其中所述表面(1)与至少一种反应性自由基(2)接触。
2.根据权利要求1所述的方法,其中反应性自由基(2)使得表面(1)的触发生物反应和具有细胞-或组织损害作用的活性中心(4)失活。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中反应性自由基(2)包含至少一个氧自由基、氮自由基、碳自由基、硫自由基和/或卤素自由基。
4.根据权利要求1-3之一所述的方法,其中反应性自由基(2)通过自由基起始剂(5)断裂生成。
5.根据权利要求4所述的方法,其中使自由基起始剂(5)与表面(1)接触并原位转变成反应性自由基(2)。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其中自由基起始剂(5)通过光分解、辐射分解、热分解,通过等离子体、通过化学和/或生物反应转变成反应性自由基(2)。
7.根据权利要求1-6之一所述的方法,其中反应性自由基(2)是羟基自由基,其如下形成:
a.在芬顿反应中;
b.通过过氧化物光分解;
c.通过水或可以辐射分解为羟基自由基的其它含氧化合物辐射分解;或
d.通过等离子体处理可转变成羟基自由基的含氧化合物优选水或过氧化物的等离子体反应。
8.根据权利要求1-7之一所述的方法,其中表面(1)含有贵金属、贵金属化合物或合金、或聚合物。
9.根据权利要求1-8之一所述的方法,其中表面(1)属于植入物、传感器或细胞培养容器。
10.器材(3),例如植入物、传感器或细胞培养容器,其与具有根据权利要求1-9之一所述的方法处理过的生物相容性表面(1)的系统接触。
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