CN105738544B - 二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法，所述方法利用结合紫外检测器的高效液相色谱法进行，其中，采用五氟苯基色谱柱；流动相由流动相A和流动相B组成；采用醋酸铵缓冲液作为所述流动相A；采用甲醇作为所述流动相B；洗脱方式为梯度洗脱。采用该方法，可以很好地分离二对甲苯磺酸拉帕替尼的同分异构体杂质，灵敏度高，专属性强，分离度达到要求。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体地，涉及二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法。
背景技术
二对甲苯磺酸拉帕替尼具有式1所示的结构：
拉帕替尼，是一种能够同时靶向人表皮生长因子受体(EGFR)和人表皮生长因子受体-2(HER2)的小分子激酶抑制剂，药用为二对甲苯磺酸拉帕替尼，由英国葛兰素史克公司开发，于2007年3月获得美国FDA批准，用于联合用药：合用卡培他滨治疗过度表达HER2的晚期或转移性乳腺癌，合用来曲唑治疗过度表达HER2、激素受体阳性的转移性乳腺癌绝经期妇女。
然而，目前二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种分离度好、分离效率高的二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法。
二对甲苯磺酸拉帕替尼中通常含有杂质，本发明的发明人发现分别具有式2、式3所示结构的两个二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体是主要杂质，而含有同分异构体杂质会影响二对甲苯磺酸拉帕替尼的质量和稳定性。本发明的发明人经过不断探索和反复实验，提出了一种分离度好、分离效率高的二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法。
因此，本发明提供了一种二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法。根据本发明的实施例，该方法利用结合紫外检测器的高效液相色谱法进行，其中，采用五氟苯基柱；流动相由流动相A和流动相B组成；采用醋酸铵缓冲液作为所述流动相A；采用甲醇作为所述流动相B；洗脱方式为梯度洗脱。采用本发明的方法，可以很好地分离二对甲苯磺酸拉帕替尼的同分异构体杂质，灵敏度高，专属性强，分离度达到要求。
根据本发明实施例的二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法还可以具有以下附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述紫外检测器的检测波长为261±2nm。发明人将二对甲苯磺酸拉帕替尼的供试品溶液，应用紫外-可见分光光度计在190nm～400nm进行全扫描，发现二对甲苯磺酸拉帕替尼的最大吸收波长为261nm，故选择261±2nm作为检测波长。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法的柱温为35摄氏度～40摄氏度。由此，有利于二对甲苯磺酸拉帕替尼和其同分异构体杂质进行分离，如果温度过高或过低，分离效果均不理想。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法的流速为0.8～1.2ml/min。由此，有利于二对甲苯磺酸拉帕替尼和其同分异构体杂质进行分离，且分离度好，分离效果佳，如果流速过快或过慢，分离效果均不理想。
根据本发明的实施例，在所述醋酸铵缓冲液中，醋酸铵的浓度为40～60mmol/L时，二对甲苯磺酸拉帕替尼和其同分异构体杂质进行分离的效果理想，且分离度复合要求，专属性好。
根据本发明的实施例，所述醋酸铵缓冲液用冰醋酸调节pH至4.0～5.0。由此，有利于二对甲苯磺酸拉帕替尼和其同分异构体杂质进行分离，分离效果理想，分离效率高。如果pH过高或过低，分离效果均不理想。
根据本发明的实施例，所述线性梯度洗脱的条件为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
由此，有利于二对甲苯磺酸拉帕替尼和其同分异构体杂质进行分离，能够获得较理想的分离效果。
发明人发现，利用本发明所述的二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析方法，能够快速有效地将二对甲苯磺酸拉帕替尼和其同分异构体杂质分离，且用时短、分离度好、分离效率高、专属性强。
根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：
(1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(2)色谱条件：
仪器采用高效液相色谱仪配备紫外检测器；采用五氟苯基色谱柱，以用冰醋酸调节pH至4.0～5.0的浓度为40～60mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，洗脱方式为等度洗脱，检测波长为261±2nm，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为35摄氏度～40摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的条件为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
(3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
结果显示：式2、以及式3所示结构的化合物杂质与二对甲苯磺酸拉帕替尼的主峰可以实现良好的分离。
根据本发明的一个具体示例，二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析方法包括以下步骤：
(a-1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(a-2)色谱条件：采用五氟苯基柱，以用冰醋酸调节pH至4.5的浓度为50mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，检测波长为261nm，流速为1.2ml/min，柱温为40摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
(a-3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。
结果显示，式2、以及式3所示结构的化合物杂质与二对甲苯磺酸拉帕替尼的主峰可以实现良好的分离，且分离度好、分离时间短、分离效率效率高、专属性强。
根据本发明的一个具体示例，二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析方法包括以下步骤：
(b-1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(b-2)色谱条件：采用五氟苯基柱，以用冰醋酸调节pH至5.0的浓度为40mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，检测波长为263nm，流速为1.0ml/min，柱温为35摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
(b-3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。
结果显示，式2、以及式3所示结构的化合物杂质与二对甲苯磺酸拉帕替尼的主峰可以实现良好的分离，且分离度好、分离时间短、分离效率效率高、专属性强。
根据本发明的一个具体示例，二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析方法包括以下步骤：
(c-1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(c-2)色谱条件：采用五氟苯基柱，以用冰醋酸调节pH至4.0的浓度为60mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，检测波长为259nm，流速为0.8ml/min，柱温为38摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
(c-3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。
结果显示，式2、以及式3所示结构的化合物杂质与二对甲苯磺酸拉帕替尼的主峰可以实现良好的分离，且分离度好、分离时间短、分离效率效率高、专属性强。
根据本发明的实施例，所述五氟苯基色谱柱为Phenmonex Kinetex 2.6μm PFP100×4.6mm色谱柱。由此，分离效果理想。
本发明的有益效果：利用本发明所述的分析检测方法，能够快速有效地将二对甲苯磺酸拉帕替尼和其同分异构体杂质分离，且分离度高、专属性强，分离度达到要求。
附图说明
图1显示了根据本发明的一个实施例，二对甲苯磺酸拉帕替尼的紫外扫描图；
图2显示了根据本发明的一个实施例，二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液B的色谱图；
图3显示了根据本发明的一个实施例，二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液C的色谱图；
图4显示了根据本发明的一个实施例，二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液D的色谱图；
图5显示了根据本发明的一个实施例，二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液E的色谱图；
图6显示了根据本发明的一个实施例，二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液F的色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：检测波长的确定
取用加乙腈-水(体积比4:1)混合溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含20μg原料药的溶液，在紫外-可见分光光度计在190nm～400nm进行全扫描，二对甲苯磺酸拉帕替尼的紫外扫描结果见图1。由图1可知，二对甲苯磺酸拉帕替尼的最大吸收波长为261nm，故选择261±2nm作为检测波长。
实施例2：
采用Phenmonex luna C18 3μm,100×4.6mm色谱柱，以50mmol/L醋酸铵缓冲溶液(取3.85g醋酸铵，溶于990ml水中，用冰醋酸调节pH至4.5，用水稀释至1000ml)为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长261nm，柱温40℃，进样5μl，按下表进行线性梯度洗脱梯度条件：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 60 | 40 |
| 8 | 42 | 58 |
| 19 | 10 | 90 |
| 35 | 10 | 90 |
| 35.1 | 60 | 40 |
| 42 | 60 | 40 |
实验步骤：
1.取二对甲苯磺酸拉帕替尼适量，用乙腈-水(体积比4：1)溶解并用乙腈-水(体积比4：1)定量稀释制成1ml含二对甲苯磺酸拉帕替尼0.8mg的溶液A，分别取适量式2所示结构的化合物杂质、式3所示结构的化合物杂质、以及式2杂质和式3杂质的混合物加入溶液A中，即分别得混合溶液为供试品溶液B、供试品溶液C、以及供试品溶液D。
2.分别取供试品溶液B、C和D及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液B的色谱图见图2，二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液C的色谱图见图3，二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液D的色谱图见图4。
由图2的结果可知，该色谱图中同分异构体杂质式2所示结构的化合物几乎包含在主峰里，无法分离。由图3的结果可知，式3所示结构的化合物杂质对应的峰与主峰无法分离。由图4可知，式3所示结构的化合物杂质对应的峰，式2所示结构的化合物杂质对应的峰与主峰重叠，其中，2min以前的峰为对甲苯磺酸峰，出峰顺序为式3所示结构的化合物杂质对应的峰、式2所示结构的化合物杂质对应的峰、拉帕替尼主峰。
实施例3
为提高分离度，将梯度调整变缓，采用Phenmonex luna C18 3μm,100×4.6mm色谱柱，以50mmol/L醋酸铵缓冲溶液(取3.85g醋酸铵，溶于990ml水中，用冰醋酸调节PH至4.5，用水稀释至1000ml)为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长261nm,柱温40℃，进样5μl，按下表进行线性梯度洗脱梯度条件：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 65 | 35 |
| 13 | 65 | 35 |
| 33 | 42 | 58 |
| 43 | 10 | 90 |
| 48 | 10 | 90 |
| 50 | 65 | 35 |
| 60 | 65 | 35 |
实验步骤：
1.取二对甲苯磺酸拉帕替尼适量，用乙腈-水(体积比4：1)溶解并用乙腈-水(体积比4：1)定量稀释制成1ml含二对甲苯磺酸拉帕替尼0.8mg的溶液A，取适量式2所示结构的化合物杂质加入溶液A中，即得混合溶液为供试品溶液E。
2.取供试品溶液E及空白溶剂照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液E的色谱图见图5。由图5的结果可知，该色谱图中式2所示结构的化合物杂质对应的峰与主峰仍然未分离。
实施例4
为提高式2所示结构的化合物杂质对应的峰与主峰分离度，采用五氟苯基柱Phenmonex Kinetex 2.6μm PFP 100×4.6mm色谱柱，以50mmol/L醋酸铵缓冲溶液(取3.85g醋酸铵，溶于990ml水中，用冰醋酸调节PH至4.5，用水稀释至1000ml)为流动相A，以甲醇为流动相B，检测波长261nm，柱温40℃，进样5μl，流速1.2ml/min，按下表进行线性梯度洗脱梯度条件：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
实验步骤：
1.取二对甲苯磺酸拉帕替尼适量，用乙腈-水(体积比4：1)溶解并用乙腈-水(体积比4：1)定量稀释制成1ml含二对甲苯磺酸拉帕替尼0.1mg的溶液A，取适量式2所示结构的化合物杂质、式3所示结构的化合物杂质加入溶液A中，即得混合溶液为供试品溶液F。
2.取供试品溶液F及空白溶剂照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。二对甲苯磺酸拉帕替尼供试品溶液F的色谱图见图6。
由图6的结果可知，式2所示结构的化合物杂质对应的峰、式3所示结构的化合物杂质对应的峰、主峰依次流出，各杂质分离效果好。
实施例5
为提高式2所示结构的化合物杂质对应的峰与主峰分离度，采用五氟苯基柱PhenmonexKinetex 2.6μm PFP 100×4.6mm色谱柱，以40mmol/L醋酸铵缓冲溶液(用冰醋酸调节PH至5.0)为流动相A，以甲醇为流动相B，检测波长263nm，柱温35℃，进样5μl，流速1.0ml/min，按下表进行线性梯度洗脱梯度条件：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
实验步骤：
1.取二对甲苯磺酸拉帕替尼适量，用乙腈-水(体积比4：1)溶解并用乙腈-水(体积比4：1)定量稀释制成1ml含二对甲苯磺酸拉帕替尼0.1mg的溶液A，取适量式2所示结构的化合物杂质、式3所示结构的化合物杂质加入溶液A中，即得混合溶液为供试品溶液F。
2.取供试品溶液F及空白溶剂照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
结果：式2所示结构的化合物杂质对应的峰、式3所示结构的化合物杂质对应的峰、主峰依次流出，各杂质分离效果好。
实施例6
为提高式2所示结构的化合物杂质对应的峰与主峰分离度，采用五氟苯基柱PhenmonexKinetex 2.6μm PFP 100×4.6mm色谱柱，以60mmol/L醋酸铵缓冲溶液(用冰醋酸调节PH至4.0)为流动相A，以甲醇为流动相B，检测波长259nm，柱温38℃，进样5μl，流速0.8ml/min，按下表进行线性梯度洗脱梯度条件：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 68 | 32 |
| 30 | 63 | 37 |
| 40 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 52 | 68 | 32 |
| 60 | 68 | 32 |
实验步骤：
1.取二对甲苯磺酸拉帕替尼适量，用乙腈-水(体积比4：1)溶解并用乙腈-水(体积比4：1)定量稀释制成1ml含二对甲苯磺酸拉帕替尼0.1mg的溶液A，取适量式2所示结构的化合物杂质、式3所示结构的化合物杂质加入溶液A中，即得混合溶液为供试品溶液F。
2.取供试品溶液F及空白溶剂照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
结果：式2所示结构的化合物杂质对应的峰、式3所示结构的化合物杂质对应的峰、主峰依次流出，各杂质分离效果好。
由上述结果可知：用普通C18色谱柱无法良好的分离二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质，但本发明换成五氟苯基色谱柱后分离效果变好，灵敏度高，专属性强，分离度达到要求。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种拉帕替尼同分异构体杂质的分析检测方法，其特征在于，所述方法利用结合紫外检测器的高效液相色谱法进行，其中，
色谱柱采用五氟苯基柱；
流动相由流动相A和流动相B组成；
采用醋酸铵缓冲液作为所述流动相A；
采用甲醇作为所述流动相B；
洗脱方式为梯度洗脱，
其中，所述线性梯度洗脱的条件为：
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫外检测器的检测波长为261±2nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为35～40摄氏度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流速为0.8～1.2ml/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述醋酸铵缓冲液中，醋酸铵的浓度为40～60mmol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醋酸铵缓冲液用冰醋酸调节pH至4.0～6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(2)色谱条件：采用五氟苯基柱，以用冰醋酸调节pH至4.0～6.0的浓度为40～60mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，检测波长为261±2nm，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为35～40摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，
，
(3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：
(a-1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(a-2)色谱条件：采用五氟苯基柱，以用冰醋酸调节pH至4.5的浓度为50mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，检测波长为261nm，流速为1.2ml/min，柱温为40摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，
，
(a-3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：
(b-1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(b-2)色谱条件：采用五氟苯基柱，以用冰醋酸调节pH至5.0的浓度为40mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，检测波长为263nm，流速为1.0ml/min，柱温为35摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，
，
(b-3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：
(c-1)取二对甲苯磺酸拉帕替尼原料药，用体积比为4：1的乙腈-水混合溶剂超声溶解，配制成二对甲苯磺酸拉帕替尼浓度为0.1mg/ml的供试品溶液；
(c-2)色谱条件：采用五氟苯基柱，以用冰醋酸调节pH至4.0的浓度为60mmol/L的醋酸铵缓冲液为所述流动相A，以甲醇为所述流动相B，检测波长为259nm，流速为0.8ml/min，柱温为38摄氏度，按下表所示条件进行所述线性梯度洗脱，
，
(c-3)取所述供试品溶液5μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述五氟苯基柱为PhenmonexKinetex 2.6μm PFP 100×4.6mm色谱柱。
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