CN105738436A - 一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法 - Google Patents

一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，首先，将玻碳电极用3?巯丙基三乙氧基硅烷和氯酸金修饰，制备得到纳米金修饰玻碳电极；然后溶胶?凝胶印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，在修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的长春新碱印迹电化学传感器，本发明制备的长春新碱分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对长春新碱表现出较高的亲和性和选择性。该长春新碱分子印迹传感器与电化学工作站连接构成能够专一模板分子识别传感器。本发明制得的传感器成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速，可反复使用。

Description

一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种检测长春新碱分子印迹传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品、生物样品中的长春新碱。
背景技术
长春新碱能抗癌，疗效比长春碱约高10倍，可用于治疗急性淋巴细胞性白血病，疗效较好，对其他急性白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和乳腺癌也有疗效。与长春花碱（vinblastine）、泛洛洛新及泛洛洗汀等一起含在蔓长春花（Vincamajor）中的生物碱。具有使细胞分裂（有丝分裂）在中期停止的作用，这与秋水仙素相似，但其作用比秋水仙素更强。与秋水仙素一样可以与微管蛋白结合而抑制其生物活性，但结合部位不同。另外它与秋水仙素不同的是对微管蛋白以外的蛋白质如肌动蛋白及10纳米细丝蛋白等也起作用。在临床医学上作为抗癌剂之一而被应用，特别是对造血器官的肿瘤比较有效。长春碱硫酸盐可用于治疗何杰金氏病和绒毛膜上皮癌，疗效较好；对淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤、急性白血病（VP，VDLP方案中的"V"为长春新碱,D为柔红霉素,"L"为门冬酰胺酶,"P"为泼尼松）、乳腺癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤和恶性黑色素瘤等也有一定疗效。
长春新碱是一种双吲哚型生物碱。分子式C46H56N4O10，分子量为824.96。存在于夹竹桃科植物长春花中。甲醇中重结晶时为针状结晶。熔点211～216℃。由于夹竹桃科植物除了长春新碱以外还含有其它多种组分，如长春碱、次长春碱，而它们的性质相似，导致长春新碱提取分离、测定的困难，因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便使用的检测长春新碱的方法十分重要。传统检测长春新碱的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱法，色谱法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，也限制了其应用。
分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。
依据此技术制备的分子印迹传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全中的长春新碱含量准确定量测定十分必要，对于长春新碱生产和药理研究也具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种检测长春新碱分子印迹传感器的制备方法，主要是以长春新碱为模板，在玻碳电极表面通过3-巯丙基三乙氧基硅烷、石墨烯及纳米金粒子之间的电化学作用而制备的分子印迹传感器。
仪器与试剂
CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），玻碳电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
石墨烯；3-巯丙基三乙氧基硅烷、无水乙醇；衣康酸，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；氯金酸；长春新碱；丙烯酸甲酯；过硫酸铵，磷酸缓冲溶液。
氧化石墨烯的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，浓硫酸：50~60%，石墨烯：3~8%，高锰酸钾：1.0~5%，超声分散20~30min，再加入32~42%去离子水，各组分含量之和为百分之百，温度升至65±2℃搅拌反应8~10h，冷却至室温，过滤，用去离子水反复洗涤至滤液为中性，真空干燥，得到氧化石墨烯；
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米金修饰玻碳电极：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl2O3粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，将玻碳电极放入含3-巯丙基三乙氧基硅烷质量百分浓度为18~23%的乙醇溶液中，温度升至50±2℃，浸泡6~8h，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，将玻碳电极浸泡在0.1~0.2mol/L氯酸金溶液中，浸泡时间为4~6h，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡10min，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，即得纳米金修饰玻碳电极；
（2）印迹溶胶的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，乙醇：62~72%，氧化石墨烯：5~8%，丙烯酸甲酯：10~18%，衣康酸：5~10%，过硫酸铵：2~6%，搅拌10min，再加入长春新碱：1.0~3.0%，各组分含量之和为百分之百，温度升至65±2℃搅拌反应6~8h，即得印迹溶胶；
（3）长春新碱分子印迹传感器的制备方法：取步骤（2）的印迹溶胶于12μL滴加到步骤（1）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与硫酸（体积比为乙醇：硫酸为18:1）混合溶液浸泡6~8h，除去电极上的模板分子，即得长春新碱分子印迹传感器。
本发明的优点及效果是：
本发明将溶胶-凝胶印迹技术、石墨烯、纳米金粒子、层层自组装法和滴涂法相结合，在玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无石墨烯和纳米金修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本申请制备的长春新碱分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对长春新碱表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与长春新碱的浓度在1.0×10-7~9.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.38×10- 8mol/L将本发明制备的长春新碱分子印迹传感器成功用于药品、生物样品中长春新碱的检测中，回收率在95.82~104.6%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米金修饰玻碳电极：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl2O3粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，将玻碳电极放入含3-巯丙基三乙氧基硅烷质量百分浓度为20%的乙醇溶液中，温度升至50±2℃，浸泡7h，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，将玻碳电极浸泡在0.15mol/L氯酸金溶液中，浸泡时间为5h，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡10min，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，即得纳米金修饰玻碳电极；
（2）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：9.0mL，氧化石墨烯：0.6g，丙烯酸甲酯：1.3g，衣康酸：0.8g，过硫酸铵：0.3g，搅拌10min，再加入长春新碱：0.2g，温度升至65±2℃搅拌反应7h，即得印迹溶胶；
（3）长春新碱分子印迹传感器的制备方法：取步骤（2）的印迹溶胶于12μL滴加到步骤（1）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与硫酸（体积比为乙醇：硫酸为18:1）混合溶液浸泡7h，除去电极上的模板分子，即得长春新碱分子印迹传感器。
实施例2
（1）纳米金修饰玻碳电极：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl2O3粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，将玻碳电极放入含3-巯丙基三乙氧基硅烷质量百分浓度为18%的乙醇溶液中，温度升至50±2℃，浸泡8h，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，将玻碳电极浸泡在0.1mol/L氯酸金溶液中，浸泡时间为6h，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡10min，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，即得纳米金修饰玻碳电极；
（2）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：7.8mL，氧化石墨烯：0.8g，丙烯酸甲酯：1.1g，衣康酸：1.0g，过硫酸铵：0.6g，搅拌10min，再加入长春新碱：0.3g，温度升至65±2℃搅拌反应6h，即得印迹溶胶；
（3）长春新碱分子印迹传感器的制备方法：取步骤（2）的印迹溶胶于12μL滴加到步骤（1）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与硫酸（体积比为乙醇：硫酸为18:1）混合溶液浸泡6h，除去电极上的模板分子，即得长春新碱分子印迹传感器。
实施例3
（1）纳米金修饰玻碳电极：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl2O3粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，将玻碳电极放入含3-巯丙基三乙氧基硅烷质量百分浓度为23%的乙醇溶液中，温度升至50±2℃，浸泡6h，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，将玻碳电极浸泡在0.2mol/L氯酸金溶液中，浸泡时间为4h，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡10min，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，即得纳米金修饰玻碳电极；
（2）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：9.0mL，氧化石墨烯：0.5g，丙烯酸甲酯：1.0g，衣康酸：0.5g，过硫酸铵：0.5g，搅拌10min，再加入长春新碱：0.3g，温度升至65±2℃搅拌反应8h，即得印迹溶胶；
（3）长春新碱分子印迹传感器的制备方法：取步骤（2）的印迹溶胶于12μL滴加到步骤（1）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与硫酸（体积比为乙醇：硫酸为18:1）混合溶液浸泡8h，除去电极上的模板分子，即得长春新碱分子印迹传感器。
实施例4
（1）纳米金修饰玻碳电极：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl2O3粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，将玻碳电极放入含3-巯丙基三乙氧基硅烷质量百分浓度为22%的乙醇溶液中，温度升至50±2℃，浸泡6.5h，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，将玻碳电极浸泡在0.2mol/L氯酸金溶液中，浸泡时间为4.5h，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡10min，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，即得纳米金修饰玻碳电极；
（2）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：8.5mL，氧化石墨烯：0.7g，丙烯酸甲酯：1.8g，衣康酸：0.6g，过硫酸铵：0.2g，搅拌10min，再加入长春新碱：0.1g，温度升至65±2℃搅拌反应6.5h，即得印迹溶胶；
（3）长春新碱分子印迹传感器的制备方法：取步骤（2）的印迹溶胶于12μL滴加到步骤（1）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与硫酸（体积比为乙醇：硫酸为18:1）混合溶液浸泡6.5h，除去电极上的模板分子，即得长春新碱分子印迹传感器。
实施例5
（1）纳米金修饰玻碳电极：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl2O3粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，将玻碳电极放入含3-巯丙基三乙氧基硅烷质量百分浓度为19%的乙醇溶液中，温度升至50±2℃，浸泡7.5h，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，将玻碳电极浸泡在0.15mol/L氯酸金溶液中，浸泡时间为5.5h，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡10min，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，即得纳米金修饰玻碳电极；
（2）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：8.7mL，氧化石墨烯：0.5g，丙烯酸甲酯：1.5g，衣康酸：0.7g，过硫酸铵：0.4g，搅拌10min，再加入长春新碱：0.2g，温度升至65±2℃搅拌反应7.5h，即得印迹溶胶；
（3）长春新碱分子印迹传感器的制备方法：取步骤（2）的印迹溶胶于12μL滴加到步骤（1）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与硫酸（体积比为乙醇：硫酸为18:1）混合溶液浸泡7.5h，除去电极上的模板分子，即得长春新碱分子印迹传感器。
实施例6
将上述实施例1~5所制备的长春新碱分子印迹传感器，用于长春新碱的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的长春新碱标准溶液，底液为pH7.5的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作曲线绘制：将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本申请实施例1~5所制备的长春新碱分子印迹传感器电极为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，在K3[Fe(CN)6]溶液中，采用循环伏安法在-0.30~0.3V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I0，含有不同浓度的长春新碱标准溶液的响应电流即为Ii，响应电流降低的差值为△I=I0-Ii，△I与长春新碱标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△I~c工作曲线；
（3）长春新碱的检测：用待测样品代替步骤（1）中的长春新碱标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中长春新碱的含量；
所述K3[Fe(CN)6]溶液的浓度为6mmol/L；
所述pH7.5的磷酸盐缓冲溶液的浓度在100mmol/L。
响应电流与长春新碱的浓度在1.0×10-7~9.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.38×10-8mol/L将本发明制备的长春新碱分子印迹传感器成功用于药品、生物样品中长春新碱的检测中，回收率在95.82~104.6%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于生物医药、食品、环保检测等相关领域。

Claims (4)

1.一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米金修饰玻碳电极：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl2O3粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氮气吹干，将玻碳电极放入含3-巯丙基三乙氧基硅烷质量百分浓度为18~23%的乙醇溶液中，温度升至50±2℃，浸泡6~8h，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，将玻碳电极浸泡在0.1~0.2mol/L氯酸金溶液中，浸泡时间为4~6h，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡10min，取出用无水乙醇充分洗涤，用氮气吹干，即得纳米金修饰玻碳电极；
（2）印迹溶胶的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，乙醇：62~72%，氧化石墨烯：5~8%，丙烯酸甲酯：10~18%，衣康酸：5~10%，过硫酸铵：2~6%，搅拌10min，再加入长春新碱：1.0~3.0%，各组分含量之和为百分之百，温度升至65±2℃搅拌反应6~8h，即得印迹溶胶；
（3）长春新碱分子印迹传感器的制备方法：取步骤（2）的印迹溶胶于12μL滴加到步骤（1）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与硫酸混合溶液浸泡6~8h，除去电极上的模板分子，即得长春新碱分子印迹传感器。
2.根据权利要求1所述的一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的丙烯酸甲酯与衣康酸质量比2：1为最优。
3.根据权利要求1所述的一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的乙醇与硫酸混合溶液的体积比为乙醇：硫酸=18:1。
4.根据权利要求1所述的一种长春新碱分子印迹传感器的制备方法所制备的长春新碱分子印迹传感器。
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