CN105713974B - 一种与牙鲆数量性状相关的snp标记、其筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与牙鲆数量性状相关的SNP位点、其筛选方法及应用。通过候选基因关联分析法，对MSTN基因中SNP与牙鲆数量性状进行关联分析，获得了一个与数量性状相关的SNP标记，所述SNP标记可用于牙鲆标记辅助选育，缩短育种周期。

Description

一种与牙鲆数量性状相关的SNP标记、其筛选方法及应用
技术领域
本发明属于水产养殖中的筛选技术领域，具体涉及一种与牙鲆数量性状相关的SNP标记、其筛选方法及应用。
背景技术
牙鲆(Paralichthys olivaceus)，又名偏口、左口、左偏、牙片等，隶属于鲽形目(Pleuronectiformes)，牙鲆科(Bothidae)，牙鲆属，主要分布在俄罗斯远东地区、日本、韩国和我国沿海，属于土著种类。它个体大，生长快，味道鲜美，深受东亚各国的青睐。
体重、体长等数量性状一直以来都是鱼类育种的主要选育性状。肌肉生长抑制素基因(Myostatin，MSTN)作为与肌肉生长相关的候选基因成为各种动物育种研究的热点。该基因又称为生长分化因子-8(GDF-8),属于转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)家族，是肌肉细胞生长的负调控因子。1997年美国John Hopkins大学医学院的McPherron等在研究转化生长因子β(TGF-β)时，在小鼠的骨骼肌细胞中发现并首次扩增出该基因的cDNA。研究表明，敲除MSTN基因的小鼠肌肉是正常野生型小鼠的2～3倍，且肌肉的脂肪含量也比较低。通过转基因技术和RNAi技术抑制斑马鱼的MSTN基因发现试验鱼的肌肉明显比正常鱼发达，因此认为该基因在动物肌肉生长发育中起重要的抑制作用，也可能参与脂肪生成的调节。近年来的一些研究还发现鱼类的MSTN基因可以在除肌肉外的多个组织中表达，如脑、肠、鳃、肾、性腺等,还有可能影响其他组织的发育。由于MSTN在遗传育种上的潜在应用价值,自其被发现以来，一直备受科研工作者的广泛关注，目前，已克隆得到多种鱼类的MSTN基因，如斑马鱼、虹鳟、大口黑鲈、眼斑拟石首鱼、大黄鱼、加州鲈、鲤鱼、日本牙鲆、斑点叉尾鮰等。人们期望通过对该基因的控制来增加肌肉产量。
鉴于MSTN在水产养殖中潜在的应用前景，本发明对牙鲆鱼的MSTN基因在进行重测序，筛查SNP，与数量性状进行关联分析，确定与数量性状相关的SNP标记，标记可用于牙鲆分子标记辅助选育。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种与牙鲆数量性状相关的SNP标记、其筛选方法及应用。通过候选基因关联分析法，对MSTN基因中SNP与牙鲆数量性状进行关联分析，获得了一个与数量性状相关的SNP标记，所述SNP标记可用于牙鲆标记辅助选育，缩短育种周期。
本发明所采用的技术方案为：一种与牙鲆数量性状相关的SNP标记，所述SNP标记包括：SNP1标记、SNP2标记和SNP3标记，所述SNP标记位于MSTN基因上，所述MSTN基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述SNP1标记位于MSTN基因第2个内含子第741bp位置，其碱基为C或T；
所述SNP2标记位于MSTN基因第3个外显子第30bp位置，其碱基为C或T；
所述SNP3标记位于MSTN基因3’UTR第330bp位置，其碱基为C或A。
本发明还提供了一种上述的MSTN基因的扩增方法，其特征在于，使用第一引物组和第二引物组从所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段，所述SNP1标记和SNP2标记位于所述MSTN2片段上，所述SNP3标记位于所述MSTN3片段上；所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述第二引物组包括第二上游引物和第一下游引物；第一上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，第一下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，第二上游引物的序列如SEQ ID NO：4所示，第二下游引物的序列如SEQ ID NO：5所示。
其中，SEQ ID NO：2的序列为GTGAATAGTGTGGGTGCATGC；
SEQ ID NO：3的序列为ACGCTCTCCGTCCCAACTCAAG；
SEQ ID NO：4的序列为CATGCACTTGCAGAAGTATCC；
SEQ ID NO：5的序列为CAGCAAACAAGCTAGAAACTT。
作为一种实施方式，使用第一引物组和第二引物组从所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段之前，先对所述MSTN基因进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，使用的反应体系为：总体积为50μL，DNA 1μL，10*buffer5μL，Mg2+5μL，dNTP 1μL，引物1μL/条，Taq酶0.6μL，余量为水。
在PCR扩增过程中，使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性3min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性15s，在55℃温度下复性15s，在72℃温度下延伸30s；完成35个循环之后，在72℃的温度下延伸3min。
本发明还提供了所述SNP标记在牙鲆筛选中的应用。
一种应用所述SNP标记进行牙鲆筛选的方法，包括以下步骤：
A、牙鲆筛选：根据GB/18654.3-2008中的数量性状指标为标准，筛选得到不同的牙鲆，数量性状指标包括但不限于全长、体长和体高；
B、同池混养：将筛选后的牙鲆在同池中混养；
C、基因分型：一定的养殖周期后，对不同牙鲆的MSTN基因中所述SNP标记进行鉴定，同时根据GB/18654.3-2008标准，测得不同牙鲆的数量性状指标；
D、对不同牙鲆的数量性状指标与其SNP标记的基因型进行关联分析。
优选的，在筛选出牙鲆之后，将每条牙鲆分别经过诱导得到不同的雌核发育家系和/或杂合克隆家系，并对每个雌核发育家系和/或杂合克隆家系进行标记；标记完成后，将所有家系中的牙鲆同池混养。每个家系中所有的个体的遗传物质是相同的，后期只需要在每个家系中选出少量或部分牙鲆个体进行分型测序即可，极大地减小了后期基因分型测序的工作量；另外，同一家系中的数据能够采用取平均值的方式进行数据分析处理，增加了数据的可靠性。
作为一种实施方式，对每条牙鲆的MSTN基因进行PCR扩增后，对PCR产物使用SNaPshot SNP分型方法对牙鲆的MSTN基因进行鉴定，SNaPshot SNP分型方法中所用的延伸引物的序列如下：所述SNP1标记对应的第一延伸引物的序列如SEQ ID NO：6所示；所述SNP2标记对应的第二延伸引物的序列如SEQ ID NO：7所示；所述SNP3标记对应的第三延伸引物的序列如SEQ ID NO：8所示；针对每个SNP标记的延伸体系及反应相同，延伸反应体系为：总体积为6μL，PCR产物2μL，Snapshot Mix试剂1μL，延伸引物0.3μL，余量为水；延伸程序为：在96℃温度下变性1min，然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：96℃温度下变性10s，在52℃温度下复性5s，在60℃温度下延伸30s；延伸程序结束后，使用测序仪对延伸产物进行测序。
SNaPshot SNP分型是一种以单碱基延伸原理为基础，同时利用多重PCR对多个已知SNP标记进行遗传分型的方法。在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多态标记5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP标记。
其中，SEQ ID NO：6的序列为：
TTTTATGAATGGTTGCTGAAATGACAAAAATGAAAT；
SEQ ID NO：7的序列为：CTCTCCTGACTCGCTTTGGGCC；
SEQ ID NO：8的序列为：
CGTATAAATGGAGAGAACACGGTAACGATGGAGAAAAAAG。
进一步的，所述基因分型步骤中，PCR扩增反应体系为：总体积为15μL，DNA 1μL、10*buffer 1.5μL、Mg2+1.5μL、dNTP 0.3ul、引物0.3ul/条、Taq酶0.3ul、余量为水；使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性3min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性15s，在56℃温度下复性15s，在72℃温度下延伸30s；完成35个循环之后，在72℃的温度下延伸3min。
所述基因分型步骤中，SNP1标记、SNP2标记和SNP2位3标记分别对应第三引物组，第四引物组和第五引物组，所述第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，所述第四引物组包括第四上游引物和第四下游引物，所述第五引物组包括第五上游引物和第五下游引物：第三上游引物的序列如SEQ ID NO：9所示，第三下游引物的序列如SEQ ID NO：10所示，第四上游引物的序列如SEQ ID NO：11所示，第四下游引物的序列如SEQ ID NO：12所示，第五上游引物的序列如SEQ ID NO：13所示，第五下游引物的序列如SEQ ID NO：14所示。
其中，SEQ ID NO：9的序列为CTGTGGTTAACCAACCGTCAG；
SEQ ID NO：10的序列为CTTCTGCAAGTGCATGTACTC；
SEQ ID NO：11的序列为CTGTGGTTAACCAACCGTCAG；
SEQ ID NO：12的序列为CTTCTGCAAGTGCATGTACTC；
SEQ ID NO：13的序列为ATGCACACATGCTGGACGTTG；
SEQ ID NO：14的序列为AGCTTAGCGAAACGTGTATTAG。
进一步的，所述基因分型步骤中，PCR循环结束后，进行纯化步骤，再将纯化后的PCR产物进行SNaPshot SNP分型方法处理；用ExoI去除PCR产物中的剩余引物，用FastAP去除PCR产物中剩余的dNTP。所述纯化步骤为：取3ul PCR产物用ExoI和FastAP纯化，纯化反应体系为：总体积7μL，PCR产物3μL，ExoI 0.2μL，FastAP 0.8μL，ExoI buffer 0.7μL，余量为水；纯化过程为：在37℃温度下保持15min后，在80℃温度下保持15min。
需要说明的是，本发明中，在PCR扩增步骤中，所使用的DNA为模板DNA；所使用的水是超纯水。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种与牙鲆数量性状相关的SNP标记、同时公开了所述SNP标记的筛选方法和使用所述SNP标记进行牙鲆筛选的方法，使用所述SNP标记进行牙鲆筛选，能够增加选择强度，缩短育种周期。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种与牙鲆数量性状相关的SNP标记，所述SNP标记包括：SNP1标记、SNP2标记和SNP3标记，所述SNP标记位于MSTN基因上，所述MSTN基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述SNP1标记位于MSTN基因第2个内含子第741bp位置，其碱基为C或T；
所述SNP2标记位于MSTN基因第3个外显子第30bp位置，其碱基为C或T；
所述SNP3标记位于MSTN基因3’UTR第330bp位置，其碱基为C或A。
实施例2
一种实施例1中MSTN基因的扩增方法，使用第一引物组和第二引物组从所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段，所述SNP1标记和SNP2标记位于所述MSTN2片段上，所述SNP3标记位于所述MSTN3片段上；所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述第二引物组包括第二上游引物和第一下游引物；第一上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，第一下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，第二上游引物的序列如SEQ ID NO：4所示，第二下游引物的序列如SEQ ID NO：5所示。
其中，SEQ ID NO：2的序列为GTGAATAGTGTGGGTGCATGC；
SEQ ID NO：3的序列为ACGCTCTCCGTCCCAACTCAAG；
SEQ ID NO：4的序列为CATGCACTTGCAGAAGTATCC；
SEQ ID NO：5的序列为CAGCAAACAAGCTAGAAACTT。
在PCR扩增过程中，使用第一引物组和第二引物组从所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段之前，先对所述MSTN基因进行PCR扩增，使用的反应体系为：总体积为50μL，DNA 1μL，10*buffer 5μL，Mg2+5μL，dNTP1μL，引物1μL/条，Taq酶0.6μL，余量为水。
在PCR扩增过程中，使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性3min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性15s，在55℃温度下复性15s，在72℃温度下延伸30s；完成35个循环之后，在72℃的温度下延伸3min。
PCR产物切胶纯化
PCR扩增后，进行PCR产物切胶纯化，包括以下步骤：
通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中。尽可能多地去掉不含目标DNA的琼脂糖。每管琼脂糖凝胶块不超过400mg，否则会导致溶胶不完全。切胶过程尽可能快，减少DNA在紫外线中的暴露时间以降低对DNA的损伤；
根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖加300～600μl的比例加入Buffer B2；
将离心管置于50℃水浴5～10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。胶块完全溶化即可；
将溶化好的溶液全部移入吸附柱，5000转离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
向吸附柱中加入500μl Wash Solution，5000转离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇，残余的乙醇会严重影响得率和后续实验；此步骤重复一次；
将空吸附柱和收集管放入离心机，10000转离心1min。
在吸附膜中央加入30μl Elution Buffer，室温静置1～2min，1000转离心1min，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
测序反应
对经过纯化的PCR产物进行测序，包括以下步骤：
测序反应体系：总体系5μl，单向引物1μl(测序时引物为实验前稀释好的单向引物，如正向或反向引物，用量固定为3.2μM)，纯化的PCR产物2μl(纯化的PCR产物所加的量根据琼脂糖凝胶检测的情况而定。若PCR扩增条带较弱，则多加一点，如加至3μl，此时则减少引物的体积(加1μl)以保证总体积5μl，但是引物总的含量不变，此时应调整引物的稀释倍数：稀释后的浓度应为3.2μmol/l)，BigDye Mix kit 1μl(Mix kit为标准用量的1/12，MixKit分装成40μl/管，每次用前先取90μl灭菌ddH2O于其中，反复吸打以混匀)；
测序反应程序为：在94℃温度下预变性1min；然后进行28个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性20s，在50℃温度下复性10s，在60℃温度下延伸4min；完成28个循环之后，在4℃的温度下保持30min；
NH4AC、EDTA纯化：待测序反应结束后，将96孔板以3700rpm离心0.5min；每个孔中加1μl NH4AC、EDTA溶液，3700转离心0.5min；置于混匀器上震荡0.5min，3700转离心0.5min；
100％酒精沉淀：每个孔中加入18μl的100％乙醇溶液；将收集好的产物(96孔板)放置在-20℃下沉淀30min(或过夜)，然后在高速离心机下4500rpm离心30min；将96孔板倒扣(下垫2～3层吸水纸)400rpm离心2min；
75％酒精洗涤：每孔加50μl的75％酒精；4500rpm离心10min；将96孔板倒置(垫2～3层吸水纸)，400转离心2min；
干燥与变性：将96孔板竖起来，用风扇吹干10min；每孔加6μl Hi-Di，3700rpm离心1min，-20℃存放待上测序仪。
实施例3
一种应用实施例1中所述SNP标记进行牙鲆筛选的方法，包括以下步骤：
牙鲆筛选：根据GB/18654.3-2008中的数量性状指标为标准，筛选得到不同的牙鲆，数量性状指标包括但不限于全长、体长和体高；在筛选出牙鲆之后，将每条牙鲆分别经过诱导得到不同的雌核发育家系和/或杂合克隆家系，并对每个雌核发育家系和/或杂合克隆家系进行标记；本实施例中，选用了3个不同的雌核发育家系，3个不同的杂合克隆家系，将6个不同的家系进行荧光标记；
B、同池混养：将所选家系中的牙鲆同池中混养15个月；
C、基因分型：养殖15个月后，每个家系随机选取20尾，共120尾，对牙鲆MSTN基因中所述SNP标记进行鉴定，同时根据GB/18654.3-2008标准，测得不同牙鲆的数量性状指标；
所述基因分型步骤中，对每条牙鲆的MSTN基因进行PCR扩增后，进行纯化步骤，并对纯化后的PCR产物使用SNaPshot SNP分型方法对牙鲆的MSTN基因进行鉴定，
SNaPshot SNP分型方法中所用的延伸引物的序列如下：所述SNP1标记对应的第一延伸引物的序列如SEQ ID NO：6所示；所述SNP2标记对应的第二延伸引物的序列如SEQ IDNO：7所示；所述SNP3标记对应的第三延伸引物的序列如SEQ ID NO：8所示；针对每个SNP标记的延伸体系及反应相同。
其中，SEQ ID NO：6的序列为
TTTTATGAATGGTTGCTGAAATGACAAAAATGAAAT；
SEQ ID NO：7的序列为CTCTCCTGACTCGCTTTGGGCC；
SEQ ID NO：8的序列为
CGTATAAATGGAGAGAACACGGTAACGATGGAGAAAAAAG。
所述基因分型步骤中，PCR扩增反应体系为：总体积为15μL，DNA 1μL、10*buffer1.5μL、Mg2+1.5μL、dNTP 0.3ul、引物0.3ul/条、Taq酶0.3ul、余量为水；使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性3min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性15s，在56℃温度下复性15s，在72℃温度下延伸30s；完成35个循环之后，在72℃的温度下延伸3min。
所述基因分型步骤中，SNP1标记、SNP2标记和SNP2位3标记分别对应第三引物组，第四引物组和第五引物组，所述第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，所述第四引物组包括第四上游引物和第四下游引物，所述第五引物组包括第五上游引物和第五下游引物：第三上游引物的序列如SEQ ID NO：9所示，第三下游引物的序列如SEQ ID NO：10所示，第四上游引物的序列如SEQ ID NO：11所示，第四下游引物的序列如SEQ ID NO：12所示，第五上游引物的序列如SEQ ID NO：13所示，第五下游引物的序列如SEQ ID NO：14所示。
其中，SEQ ID NO：9的序列为CTGTGGTTAACCAACCGTCAG；
SEQ ID NO：10的序列为CTTCTGCAAGTGCATGTACTC；
SEQ ID NO：11的序列为CTGTGGTTAACCAACCGTCAG；
SEQ ID NO：12的序列为CTTCTGCAAGTGCATGTACTC；
SEQ ID NO：13的序列为ATGCACACATGCTGGACGTTG；
SEQ ID NO：14的序列为AGCTTAGCGAAACGTGTATTAG。
PCR循环结束后，进行纯化步骤，再将纯化后的PCR产物进行SNaPshot SNP分型方法处理；用ExoI去除PCR产物中的剩余引物，用FastAP去除PCR产物中剩余的dNTP。所述纯化步骤为：取3ul PCR产物用ExoI和FastAP纯化，纯化反应体系为：总体积7μL，PCR产物3μL，ExoI 0.2μL，FastAP 0.8μL，ExoI buffer 0.7μL，余量为水；纯化过程为：在37℃温度下保持15min后，在80℃温度下保持15min。
对纯化后的PCR产物使用SNaPshot SNP分型方法处理，其中延伸反应体系为：总体积为6μL，PCR产物2μL，Snapshot Mix试剂1μL，延伸引物0.3μL，余量为水；延伸程序为：在96℃温度下变性1min，然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：96℃温度下变性10s，在52℃温度下复性5s，在60℃温度下延伸30s；延伸程序结束后，取1ul延伸产物，加10ul上样HI-DI，在95℃温度下变性3min，立即冰水浴，并使用ABI3730测序仪对延伸产物进行测序。
D、关联分析：对不同牙鲆的数量性状指标与其SNP标记的基因型进行关联分析。运用一般线性模型(GLM)中LSD方法将实施例1中所述SNP标记基因型间的体重、体长、全长、体高等数量性状进行多重比较分析，结果如下表：
SNP标记LSD多重比较结果表
注:abc不同字母表示差异显著(P<0.05)，*表示差异极显著(P<0.01)。
结果显示SNP1、SNP2和SNP3与数量性状显著相关(P<0.05)。
SNP1标记位于所述MSTN基因第2个内含子第741bp位置，突变型为C-A，基因型AA为优势基因型，该基因型的个体数量性状均值显著高于AC和CC型个体；SNP2标记位于所述MSTN基因第3个外显子第30bp位置，突变型为C-T，密码子GAC-GAT，氨基酸Asp252Asp，氨基酸位置252，为同义突变，CT为优势基因型，数量性状均值均极显著高于其它个体；SNP3标记位于所述MSTN基因3’UTR第330bp位置，突变型为C-A，AC为优势基因型。
试验例1
本试验例是实施例1中所述SNP标记的验证。
所述SNP标记的基因型在不同生长速度(f：生长快速家系60尾，s：生长缓慢家系60尾)的家系中的频率进行G-test检验。结果如下表：
SNP标记基因型验证结果
注：f：生长快速家系；s：生长缓慢家系
验证结果显示：优势基因型(SNP1：AA，SNP2：CT，SNP3：AC)与劣势基因型(SNP1：CC，SNP2：AA，SNP3：AA或AC)出现频率在f组和s组中存在极显著差异，并且优势型的个体数量性状均值显著高于劣势基因型个体。
实施例1中所述的SNP标记可用于牙鲆分子辅助育种中，快速选育出生长快的牙鲆，缩短育种周期。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种与牙鲆数量性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记包括：SNP1标记、SNP2标记和SNP3标记，所述SNP标记位于MSTN基因上，所述MSTN基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述SNP1标记位于MSTN基因第2个内含子第741bp位置，其碱基为C或T；
所述SNP2标记位于MSTN基因第3个外显子第30bp位置，其碱基为C或T；
所述SNP3标记位于MSTN基因3’UTR第330bp位置，其碱基为C或A。
2.一种权利要求1中MSTN基因的扩增方法，其特征在于，使用第一引物组和第二引物组从所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段，所述SNP1标记和SNP2标记位于所述MSTN2片段上，所述SNP3标记位于所述MSTN3片段上；所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述第二引物组包括第二上游引物和第一下游引物；第一上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，第一下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，第二上游引物的序列如SEQID NO：4所示，第二下游引物的序列如SEQ ID NO：5所示。
3.根据权利要求2所述的MSTN基因的扩增方法，其特征在于，使用第一引物组和第二引物组从所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段之前，先对所述MSTN基因进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，使用的反应体系为：总体积为50μL，DNA 1μL，10*buffer 5μL，Mg2+5μL，dNTP 1μL，引物1μL/条，Taq酶0.6μL，余量为水。
4.根据权利要求3所述的MSTN基因的扩增方法，其特征在于，在PCR扩增过程中，使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性3min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性15s，在55℃温度下复性15s，在72℃温度下延伸30s；完成35个循环之后，在72℃的温度下延伸3min。
5.权利要求1所述的SNP标记在牙鲆筛选中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
牙鲆筛选：根据GB/18654.3-2008中的数量性状指标为标准，筛选得到不同的牙鲆，数量性状指标包括但不限于全长、体长和体高；
同池混养：将筛选后的牙鲆在同池中混养；
基因分型：一定的养殖周期后，对不同牙鲆的MSTN基因中所述SNP标记进行鉴定，同时根据GB/18654.3-2008标准，测得不同牙鲆的数量性状指标；
对不同牙鲆的数量性状指标与其SNP标记的基因型进行关联分析。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，在筛选出牙鲆之后，将每条牙鲆分别经过诱导得到不同的雌核发育家系和/或杂合克隆家系，并对每个雌核发育家系和/或杂合克隆家系进行荧光标记；标记完成后，将所有家系中的牙鲆同池混养。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因分型步骤中，对每条牙鲆的MSTN基因进行PCR扩增后，对PCR产物使用SNaPshot SNP分型方法对牙鲆的MSTN基因进行鉴定，SNaPshot SNP分型方法中所用的延伸引物的序列如下：所述SNP1标记对应的第一延伸引物的序列如SEQ ID NO：6所示；所述SNP2标记对应的第二延伸引物的序列如SEQ ID NO：7所示；所述SNP3标记对应的第三延伸引物的序列如SEQ ID NO：8所示；针对每个SNP标记的延伸体系及反应相同，延伸反应体系为：总体积为6μL，PCR产物2μL，Snapshot Mix试剂1μL，延伸引物0.3μL，余量为水；延伸程序为：在96℃温度下变性1min，然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：96℃温度下变性10s，在52℃温度下复性5s，在60℃温度下延伸30s；延伸程序结束后，使用测序仪对延伸产物进行测序。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因分型步骤中，PCR扩增反应体系为：总体积为15μL，DNA 1μL、10*buffer 1.5μL、Mg2+1.5μL、dNTP 0.3ul、引物0.3ul/条、Taq酶0.3ul、余量为水；使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性3min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性15s，在56℃温度下复性15s，在72℃温度下延伸30s；完成35个循环之后，在72℃的温度下延伸3min。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述基因分型步骤中，PCR循环结束后，进行纯化步骤，再将纯化后的PCR产物进行SNaPshot SNP分型方法处理；所述纯化步骤为：取3ul PCR产物用ExoI和FastAP纯化，纯化反应体系为：总体积7μL，PCR产物3μL，ExoI0.2μL，FastAP 0.8μL，ExoI buffer 0.7μL，余量为水；纯化过程为：在37℃温度下保持15min后，在80℃温度下保持15min。
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