CN105709220B

CN105709220B - 用于猪圆环病毒与猪流感的疫苗组合物及制备方法和应用

Info

Publication number: CN105709220B
Application number: CN201410724407.9A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 杨青原; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2034-12-03
Also published as: CN105709220A

Abstract

本发明涉及一种用于预防和/或治疗猪圆环病毒病和猪流感的疫苗组合物及其制备方法和应用，所述疫苗组合物包括i)猪圆环病毒亚单位抗原或者编码猪圆环病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸，以及ii)猪流感病毒亚单位抗原或者编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸。本发明还涉及用于同时治疗和/或预防两种猪类疾病的核酸分子、重组质粒和宿主细胞。

Description

用于猪圆环病毒与猪流感的疫苗组合物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于同时治疗和/或预防猪圆环病毒病和/或猪流感的疫苗组合物及其制备方法。本发明还涉及用于同时治疗和/或预防两种猪类疾病的核酸分子、重组质粒和宿主细胞。本发明进一步涉及所述疫苗组合物在制备药物中的应用。

背景技术

猪圆环病毒病主要是由猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)导致，该病除表现为猪断乳后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)外，还与猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)、增生性坏死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia,PNP)、先天性震颤(CongenitaltemorAll,CT-All)等相关疾病(PCVD)有关。另外，猪圆环病毒病、猪流感的混合感染对养猪业危害也十分严重。

PCV于1974年首次在猪肾(porcine kidney,PK)细胞系中被发现，为圆环病毒科的成员，其基因组由一环状单链DNA组成，直径仅为17nm，无囊膜，是动物病毒中最小的病毒，能够在哺乳动物细胞中自主复制。该病毒有猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)两种基因型，其中，PCV1无致病性，感染猪后不出现临床症状；PCV2具有致病性，含有两个主要的开放阅读框ORF1和ORF2。

猪流感(swine influenza,SI)是由猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)引起的不同日龄、性别和品种猪的一种急性、高传播性呼吸系统传染病，临床上以突发、高热、精神沉郁、食欲废绝、咳嗽、呼吸困难、反复发作、衰竭、高发病率、死亡为特征。目前，在世界范围内SIV只有H1N1、H3N2和H1N2这三种亚型被持续分离到(Kothalawala,et al.,2006)。单独感染猪流感病毒可导致猪只生产性能下降，料肉比升高，增重减缓，给猪场造成一定的经济损失，但临床上，猪流感病毒常与猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体等并发或继发感染，造成严重的呼吸道疾病，给养猪业带来巨大的危害。特别地，猪流感还能引起人类流感的大爆发，造成严重的公共卫生危害。目前甲型H1N1流感病毒从美洲几乎蔓延到全世界，传播途径可以是人传人，也可以是动物传人。良好的药物和疫苗是预防和控制流感的有效措施，但许多地区和国家出现了耐药的流感毒株，只有高效的疫苗才能控制流感的传播。

猪流感病毒粒子呈球形或椭圆形，主要结构蛋白包括：红细胞凝集素HA，病毒外壳表面膜上的主要糖蛋白；神经氨酸苷酶NA，也是病毒外壳表面膜上的一种糖蛋白；基质蛋白M1，形成病毒外壳的主体蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣壳，参与病毒粒子的形成。其中，红细胞凝集素HA也是感染-中和抗体的结合靶标(Laver WG,Webster RG.Preparationand immunogenicity of an influenza virus hemaglutinin and neuraminidasesubunit vaccine.Virology,1976,69(2):511-522)，使得病毒与宿主细胞表面含若干的受体贴附，并发生低pH诱导的构象转变，引发病毒外壳与内体膜融合，这一构象的转变过程为蛋白酶将血凝素的前体蛋白HA0切割为两个二硫键连接的HA1和HA2(Lazarowitz SG,Choppin PW.Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses byproteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide.Virology,1975,68(2):440-454)，但HA2亚基N端有一段高度疏水的区域，使得其在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中很难获得可溶性的HA2蛋白(谢良志，孙春昀，张延静.一种可溶表达的流感病毒血凝素HA2融合蛋白.中国专利CN101921339A)。

目前，已经有利用PCV的Cap蛋白的免疫原性来研制预防或治疗猪圆环病毒病的疫苗的报导，也有利用SIV的HA的免疫原性来研制预防或治疗猪流感的报导。然而，目前并没有将预防和/或治疗猪圆环病毒病与猪流感结合起来的疫苗的报导。本领域亟需一种能够通过打一针疫苗就能够同时治疗和/或预防这样两种疾病并能够产生良好甚至比常规疫苗更好的效果的疫苗。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物能够有效预防和/或治疗猪圆环病病毒和/或猪流感病毒引起的疾病。

所述疫苗组合物包括i)猪圆环病毒亚单位抗原或者编码猪圆环病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸，

以及ii)猪流感病毒亚单位抗原或者编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒亚单位抗原为一个或多个猪圆环病毒2型的多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段。在本发明的一个优选的实施方式中，所述编码猪圆环病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪圆环病毒2型多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达。猪圆环病毒多肽、蛋白质以及所述多肽和蛋白质的免疫原性片段均可用本领域公知技术合成或重组制备。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒亚单位抗原包括一个或多个猪圆环病毒2型Cap蛋白。在本发明的一个优选的实施方式中，所述编码猪圆环病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪圆环病毒2型Cap蛋白，和/或所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达。术语“猪圆环病毒2型Cap蛋白”是指病毒的结构蛋白，即核衣壳蛋白，是PCV2的主要免疫原性蛋白，由234个氨基酸组成(LiuQ,TikooSK,Babiuk LA.Nuclear localization of the ORF2proteinencoded by porcine circovirus type 2.Virology,2001,285(1):91-99)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒亚单位抗原为一个或多个猪流感病毒的多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段。在本发明的一个优选的实施方式中，所述编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪流感病毒多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达。猪流感病毒多肽、蛋白质以及所述多肽和蛋白质的免疫原性片段均可用本领域公知技术合成或重组制备。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒亚单位抗原包括一个或多个猪流感病毒HA2蛋白，在本发明的一个优选的实施方式中，所述编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪流感病毒HA2蛋白，和/或所述猪流感病毒HA2蛋白的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达。

术语“猪流感病毒”是指来自引起猪流感的正黏病毒科的A型或C型流感病毒。在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒为包括但不仅限于H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H9N2和/或H5N1亚型等，优选为H1N1亚型和/或H3N2亚型。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒亚单位抗原含有猪圆环病毒2型Cap蛋白，并且所述猪流感病毒亚单位抗原含有猪流感病毒HA2蛋白。由于猪流感病毒的HA2亚基N端有一段高度疏水的区域，其在杆状病毒/昆虫病毒表达系统中很难获得可溶性的HA2蛋白，影响了其在制备疫苗的应用中的效果。然而，本发明通过基因工程手段将猪圆环病毒的免疫原性多肽、蛋白或其片段与猪流感病毒HA2相融合而制成融合蛋白，利用猪圆环病毒2型Cap蛋白的亲水区域，解决了在杆状病毒表达系统中难获得可溶性HA2蛋白的问题，从而不仅获得能够有效治疗和/或预防猪圆环病毒病和/或猪流感的疫苗，还能够相对于单一的猪圆环病毒病疫苗和/或单一的猪流感病毒，改善了疫苗的效果，尤其是疫苗在预防和/或治疗猪流感方面的效果。具体地说，本发明的疫苗组合物相对于目前常规单一猪流感疫苗，在预防和/或治疗猪流感方面，具有更好的效果。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒为从猪分离的流感病毒，优选地猪流感病毒为野生型猪流感病毒，和/或来源于野生型猪流感病毒的重组和/或嵌合型流感病毒。

术语“野生型猪流感病毒”是指流行的、天然传播的并引起典型的疾病暴发的猪病毒类型。在本发明的一个优选的实施方式中，示例性的所述野生型猪流感病毒的多核苷酸序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号(NCBI的GenBank数据库，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank，下同)的多核苷酸序列和/或氨基酸序列：

A/swine/Saskatchewan/18789/02、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/NorthCarolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和/或A/Swine/Wisconsin/14094/99。

术语“猪流感病毒HA2蛋白”是指猪流感病毒的免疫原性蛋白，感染宿主后可诱导产生中和抗体，也是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，由222个氨基酸组成(SuarezDL,Schultz-Cherry S.Immunology of avian influenza virus:areview.Developmentand Comparative Immunology,2000,24(2-3):269-283)。所述猪流感病毒HA2蛋白的基因为从猪流感病毒分离出的HA基因的免疫原性片段，如来自任何上述病毒株HA2蛋白的基因。在本发明的一个优选的实施方式中，示例性的所述来自H1N1的猪流感病毒HA2蛋白的多核苷酸序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列和/或氨基酸序列：

AY619961.1；CY089867.1；GQ457549.1；GQ457548.1；GQ457547.1；CY091769.1；CY091745.1；CY091737.1；CY091729.1；GU721143.3；JF820285.1；JF820277.1；JF707784.1；CY087136.1；CY087104.1；CY087096.1；CY087080.1；CY087072.1；CY087064.1；CY087056.1；CY087048.1；CY086863.1；CY086839.1；CY086353.1；CY086006.1；CY085990.1；CY085982.1；CY085974.1；CY085966.1；CY085958.1；CY085950.1；CY085942.1；CY085934.1；CY085926.1；CY085918.1；CY085910.1；CY085902.1；CY085894.1；CY085886.1；CY085878.1；CY085870.1；CY085854.1；CY085846.1；CY085838.1；CY085830.1；CY085822.1；CY085814.1；CY085806.1；CY085798.1；CY085790.1；CY085782.1；CY085774.1；CY085766.1；CY085758.1；CY085742.1；CY085726.1；CY085718.1；CY085710.1；CY085702.1；CY085694.1；CY085686.1；CY085670.1；JF833344.1；JF833343.1；JF833341.1；JF833339.1；JF833338.1；JF833337.1；JF833335.1；JF916682.1；JF812292.1；JF812291.1；JF812290.1；JF812287.1；JF812284.1；JF812281.1；JF812280.1；JF812279.1；JF812278.1；JF812273.1；JF812272.1；JF812271.1；AF091317.1；AF091315.1；和/或AF091314.1。

在本发明的一个优选的实施方式中，示例性的所述来自H3N2的猪流感病毒HA2蛋白的多核苷酸序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列和/或氨基酸序列：

AY377927.2；CY092324.1；AF153233.1；JN105973.1；HQ315643.1；FJ519977.1；FJ519976.1；FJ519975.1；FJ519974.1；FJ519973.1；FJ519972.1；FJ519971.1；GU937743.1；JF833345.1；JF833340.1；JF833336.1；JF833334.1；JF812293.1；JF812289.1；JF812277.1；JF812276.1；JF812275.1；JF812274.1；CY045575.1；CY045567.1；CY045559.1；CY045551.1；HQ825243.1；HQ825235.1；HQ825229.1；HQ825226.1；HQ825223.1；HQ825218.1；HQ825210.1；HQ825210.1；HQ825198.1；HQ825190.1；HQ825182.1；HQ825174.1；HQ825166.1；JF312065.1；JF312064.1；CY086920.1；JF312073.1；JF312072.1；JF312071.1；JF316643.1；JF263536.1；JF263535.1；HQ734204.1；HQ734201.1；HQ734198.1；HQ734195.1；HQ734192.1；HQ734189.1；HQ734186.1；CY077942.1；和/或CY077934.1。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白为SEQ ID No.1编码的蛋白质，或者氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的蛋白质，所述猪流感病毒HA2蛋白为SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.5编码的蛋白质，或者氨基酸序列为SEQ ID No.4和/或SEQID No.6所示的蛋白质。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述疫苗组合物还包括兽医学上可接受的佐剂。

术语“兽医学上可接受的佐剂”包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314和胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。优选地，所述佐剂为油包水乳剂。

术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；和/或支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选为非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯和/或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽和/或Gel佐剂等。

本发明的另一个目的在于，提供一种核酸分子，其包括编码i)猪圆环病毒亚单位抗原以及ii)猪流感病毒亚单位抗原的多核苷酸序列。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒亚单位抗原为一个或多个猪圆环病毒2型的多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段。在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒亚单位抗原为一个或多个猪流感病毒的多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段。

在本发明的一个优选的实施方式中，示例性的所述核酸分子的编码猪流感病毒亚单位抗原的多核苷酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列：

A/swine/Saskatchewan/18789/02、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/NorthCarolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和/或A/Swine/Wisconsin/14094/99；和/或

AY619961.1；CY089867.1；GQ457549.1；GQ457548.1；GQ457547.1；CY091769.1；CY091745.1；CY091737.1；CY091729.1；GU721143.3；JF820285.1；JF820277.1；JF707784.1；CY087136.1；CY087104.1；CY087096.1；CY087080.1；CY087072.1；CY087064.1；CY087056.1；CY087048.1；CY086863.1；CY086839.1；CY086353.1；CY086006.1；CY085990.1；CY085982.1；CY085974.1；CY085966.1；CY085958.1；CY085950.1；CY085942.1；CY085934.1；CY085926.1；CY085918.1；CY085910.1；CY085902.1；CY085894.1；CY085886.1；CY085878.1；CY085870.1；CY085854.1；CY085846.1；CY085838.1；CY085830.1；CY085822.1；CY085814.1；CY085806.1；CY085798.1；CY085790.1；CY085782.1；CY085774.1；CY085766.1；CY085758.1；CY085742.1；CY085726.1；CY085718.1；CY085710.1；CY085702.1；CY085694.1；CY085686.1；CY085670.1；JF833344.1；JF833343.1；JF833341.1；JF833339.1；JF833338.1；JF833337.1；JF833335.1；JF916682.1；JF812292.1；JF812291.1；JF812290.1；JF812287.1；JF812284.1；JF812281.1；JF812280.1；JF812279.1；JF812278.1；JF812273.1；JF812272.1；JF812271.1；AF091317.1；AF091315.1；和/或AF091314.1；和/或

在本发明的一个优选的实施方式中，所述核酸分子的编码猪圆环病毒亚单位抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列，并且所述核酸分子的编码猪流感病毒亚单位抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.5所示的多核苷酸序列。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述核酸分子由于密码子的简并性，与上述的核酸分子的多核苷酸序列不同，但能编码具有相同氨基酸序列的蛋白质和/或肽。

本发明的又一个目的在于，提供一种重组质粒，所述重组质粒包括上述的核酸分子，优选地所述重组质粒为杆状病毒质粒。

本发明的再一个目的在于，提供一种含有上述的重组质粒的宿主细胞，所述宿主细胞优选为微生物细胞和/或昆虫细胞和/或哺乳动物细胞，更优选为大肠杆菌细胞DH5α和/或昆虫细胞Sf-9。

本发明的又一个目的在于，提供一种制备上述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：同时克隆表达所述猪圆环病毒亚单位抗原和所述猪流感病毒亚单位抗原，得到融合抗原。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述方法还包括将所述融合抗原与佐剂按比例混合。

优选地，克隆表达所述猪圆环病毒亚单位抗原为克隆表达所述猪圆环病毒2型Cap蛋白。在本发明的一个优选的实施方式中，克隆表达所述猪圆环病毒亚单位抗原为克隆表达SEQ ID No.2所编码的蛋白。优选地，克隆表达所述猪流感病毒亚单位抗原为克隆表达H1N1亚型猪流感病毒HA2蛋白。在本发明的一个优选的实施方式中，克隆表达所述猪流感病毒亚单位抗原为克隆表达SEQ ID No.4所编码的蛋白。在本发明的另一个优选的实施方式中，克隆表达所述猪流感病毒亚单位抗原为克隆表达H3N2亚型猪流感病毒HA2蛋白。在本发明的另一个优选的实施方式中，克隆表达所述猪流感病毒亚单位抗原为克隆表达SEQ IDNo.6所编码的蛋白。

在本发明的一个更加优选的实施方式中，所述克隆表达使用杆状病毒表达系统来表达。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述方法中使用了上述的核酸分子和/或上述的重组质粒和/或上述的宿主细胞。

本发明的再一个目的在于，提供上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒病和/或猪流感的药物中的应用。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪圆环病毒、猪流感病毒感染时能抑制猪圆环病毒、猪流感病毒的复制与传播，或防止猪圆环病毒、猪流感病毒在其宿主体内定居，以及减轻猪圆环病毒、猪流感病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

本发明的疫苗可以制成任何兽医学上可接受的剂型，以兽医学上可接受的剂量向猪施用。

本发明的疫苗可以以任何兽医学上可接受的方式施用。优选地，所述施用可通过皮下注射或肌肉注射进行使用，进一步优选为肌肉注射。

术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

本发明具有以下突出的优点：

本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，简单方便易行，能够同时有效地预防和/或治疗猪圆环病毒病与猪流感这两种疾病，减少免疫次数，方便猪的养殖，减少养殖的时间成本和经济成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所采用的猪圆环病毒2型攻毒毒株为PCV2-SH株，保藏号为CGMCCNo.2389，保藏日期为2008年3月4日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该毒株已在中国专利CN101240264A中公开；所采用的猪流感病毒攻毒毒株为H1N1亚型ZJS株(Swine influenza virus(H1N1subtype)strain ZJS，其生物保藏号为CCTCCNO.V201233，保藏日期为2012年8月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学，该毒株已在中国专利CN103667196A中公开)和H3N2亚型WX株(Swine influenzavirus(H3N2)subtype strain WX，其生物保藏号为CCTCC NO.V201234，保藏日期为2012年8月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学，该毒株已在中国专利CN103667196A中公开)。

本发明实施例中所用的PBS液的pH值为7.4，具体配方为：1000mL蒸馏水中加入NaCl 9g、Na₂HPO₄·12H₂O 6g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.4g。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明实施例以体积比为54％的矿物油佐剂(属于油包水乳剂)制备猪圆环病毒、猪流感病毒疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中猪圆环病毒的发病标准以仔猪免疫攻毒法为例进行，攻毒后需满足的条件：攻毒对照组应至少4头发病，免疫组应至少4头保护。根据体温、相对日增重和病毒抗原检验结果对猪圆环病毒的发病进行判定，详情如下：

(1)体温标准，体温升高(≥40℃)(每日上午10点左右测定仔猪体温一次)，至少持续3日；

(2)相对日增重标准，根据每头猪的个体相对日增重计算每组猪的平均相对日增重，并将各组的平均相对日增重与空白对照组的平均相对日增重进行比较。当平均相对日增重显著低于空白对照组(P<0.05)时，判定该组所有猪有临床症状，其中，按照以下公式计算个体相对日增重：

P值的计算可采用相关生物统计软件(如SPSS)进行；

(3)病毒抗原检测，用免疫组化方法检测淋巴结组织，应检测到PCV2抗原。

符合以上任意两项，即可判为发病。

本发明实施例中猪流感病毒的发病标准：

(1)仔猪体温结果判定标准：根据仔猪体温超过40.5℃的天数赋分，0-1天赋值0分，2-3天赋值1分，3天以上赋值2分；

(2)仔猪临床症状结果判定标准：仔猪无临床症状赋值0分，无明显临床症状赋值1分，出现明显的临床症状赋值2分。无明显临床症状表现为精神稍沉郁，但食欲没有明显变化，2-3天内恢复正常；明显的临床症状表现为精神沉郁，食欲下降，出现扎推、喜卧、呼吸急促等明显的临床症状，持续3日以上；

(3)仔猪肺部病变结果判定标准：仔猪肺部无病变赋值0分，肺部有小部分病变赋值1分，肺部存在大面积病变赋值2分。

根据赋值情况，比较攻毒对照组和免疫组之间的P值。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1猪圆环病毒、猪流感病毒H1N1融合抗原的制备、鉴定及纯化

1.1PCV2Cap基因的PCR扩增

以GeneBank中PCV2-SH株(登录号：HM038027)毒株基因序列(详情见序列表SEQ IDNo.1)为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物(702bp,233AA)，用于扩增PCV2-Cap基因，其两端分别加入BamH I和Pst I酶切位点，位于(PH)启动子下，引物序列如下:

PCV2-Cap-BamH I：CGGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC

PCV2-Cap-Pst I：AACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGTGGGGGC

PCR反应参数为：94℃预变性5min,94℃变性50s,54.3℃退火30s,72℃延伸45s,35个循环后,72℃延伸5min；反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,用DNA片段纯化试剂盒(DNA Fragment Purification Kit)回收和纯化PCV2-Cap基因DNA,于-20℃保存备用。

1.2H1N1-HA2基因的PCR扩增

以GeneBank中(登录号：CY089867.1)基因序列(详情见序列表SEQ ID No.3)为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物(666bp,222AA)，用于扩增H1N1-HA2基因，其两端分别加入Sma I和Kpn I酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下:

H1N1-HA2-Sma I上游：

CCCCCGGGGGCCTGTTTGGAGCTATTGCTGGCT

H1N1-HA2-Kpn I下游：GGGGTACC

AATACATATTCTGCACTGTAAAGAC

PCR反应参数为:94℃预变性5min,94℃变性50s,50.6℃退火40s,72℃延伸40s,35个循环后,72℃延伸5min；反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,用DNA片段纯化试剂盒(DNA Fragment Purification Kit)回收和纯化H1N1-HA2基因DNA,于-20℃保存备用。

1.3构建H1N1-HA2-PCV2-Cap-pFastBac^TMDual重组质粒

将昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac^TMDual和纯化PCV2-Cap基因DNA经过限制性内切酶BamH I和Pst I进行双酶切，在T4DNA连接酶的作用下，将PCV2-Cap基因DNA片段插入到pFastBac^TMDual质粒PH启动子的下方，转化DH5α感受态细胞，构建重组质粒pFastBac^TMDual-Cap。将构建成功的重组质粒pFastBac^TMDual-PCV2-Cap和H1N1-HA2基因DNA经过限制性内切酶Sma I和Kpn I进行双酶切，将H1N1-HA2基因片段插入到并将其插入到重组质粒pFastBac^TMDual-PCV2-Cap的另一个启动子P10的下方，转化DH5α感受态细胞。最后筛选出所需的重组昆虫杆状病毒重组表达载体H1N1-HA2-PCV2-Cap-pFastBac^TMDual。

1.4重组Bacmid DNA的获得

取重组表达载体H1N1-HA2-PCV2-Cap-pFastBac^TMDual转化DH10Bac感受态细胞，进行蓝白斑菌落筛选，白斑应为阳性。挑取单个白斑菌落于LB液体培养基进行培养，按照

Baculovirus Expression Systems CAT说明书的方法提取重组Bacmid DNA，并进行PCR鉴定，获得重组阳性杆粒Bacmid-H1N1-HA2-PCV2-Cap。

1.5重组阳性杆粒Bacmid-H1N1-HA2-PCV2-Cap转染Sf-9细胞

按照脂质体转染的方法进行转染昆虫细胞Sf-9，27℃培养箱中孵育72h，观察细胞出现病毒感染迹象。72h细胞出现病变，收集上清液，这时的病毒称为P1代。通过提取病毒DNA，进行PCR鉴定表明，转染成功。

1.6H1N1-HA2-PCV2-Cap融合蛋白的获得

取P1代接种Sf-9细胞，培养3天后收获P2代。P2代冻融一次后，弃去培养上清液，用pH7.4的PBS液冲洗，将细胞完全冲洗下来，超声裂解后，即获得存在于细胞中的H1N1-HA2-PCV2-Cap融合蛋白。

1.7H1N1-HA2-PCV2-Cap融合蛋白的纯化及含量测定

将获得培养物经10000g离心20分钟，分离沉淀和上清液，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，然后通过超滤浓缩纯化，纯化后的样品溶液经7mM二乙烯亚胺(BEI)灭活重组杆状病毒载体，36-48小时，加入等量的硫代硫酸钠中和。然后通过BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白含量测定。测定纯化后H1N1-HA2-PCV2-Cap融合蛋白的浓度为3.56mg/ml，能够满足疫苗生产需求。

1.8H1N1-HA2-PCV2-Cap融合蛋白纯化后鉴定

将上述纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印到硝纤膜上后，10％脱脂乳封闭过夜；加入抗血清室温作用2h；洗涤3次，加入1:1000稀释的HRP标记二抗进行免疫印迹检测。显色之后可以在目的条带所处位置出现特异性棕红色印迹。证明纯化后融合蛋白非常特异。

实施例2猪圆环病毒、猪流感病毒H3N2融合抗原的制备、鉴定及纯化

2.1序列选择及引物设定

以GeneBank中(登录号：CY107035.1)基因序列(详情见序列表SEQ ID No.5)为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物(663bp,221AA)，用于扩增H3N2-HA2基因，其两端分别加入Sma I和Kpn I酶切位点，位于P10启动子下，引物序列如下:

H3N2-HA2-Sma I上游：

CCCCCGGGGGCATATTCGGCGCAATCGCAGGT

H3N2-HA2-Kpn I下游：

GGGGTACCAATGCAAATGTTGCATCTAATGTTG

PCR反应参数为：94℃预变性5min,94℃变性50s,53.8℃退火45s,72℃延伸40s,35个循环后,72℃延伸5min；反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,用DNA片段纯化试剂盒(DNA Fragment Purification Kit)回收和纯化DNA,于-20℃保存备用。

2.2构建H3N2-HA2-PCV2-Cap-pFastBac^TMDual重组质粒

将1.3中将构建成功的重组质粒pFastBac^TMDual-PCV2-Cap和H3N2-HA2基因DNA经过限制性内切酶Sma I和Kpn I进行双酶切，将H3N2-HA2基因片段插入到并将其插入到重组质粒pFastBac^TMDual-Cap的另一个启动子P10的下方，转化DH5α感受态细胞。最后筛选出所需的重组昆虫杆状病毒重组表达载体H3N2-HA2-PCV2-Cap-pFastBac^TMDual。

按照实例1中1.4-1.8所述的方法获得H3N2-HA2-PCV2-Cap融合蛋白，并对其进行纯化、定量及鉴定，测定纯化后H3N2-HA2-PCV2-Cap融合蛋白的浓度为3.32mg/ml，能够满足疫苗生产需求。

实施例3猪圆环病毒、猪流感病毒疫苗组合物的制备

将实施例1-2制备的猪圆环病毒、猪流感病毒融合抗原分别用pH7.4的PBS溶液稀释，并将分别稀释后的融合抗原与矿物油佐剂按表1所示制备，以500-800r/min的转速搅拌10-15 min，在终止搅拌前加入体积比为1％的硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀，即为疫苗组合物1、疫苗组合物2。将其分装后于2-8℃保存备用。

表1猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物配比

实施例4猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物免疫后猪圆环病毒攻毒保护效果比较

4.1材料

猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物选用实例3中的疫苗组合物1、疫苗组合物2。

4.2动物实验设计

选用14-21日龄猪流感病毒、猪圆环病毒抗原、抗体阴性仔猪25只，每组5头，第1组每头颈部肌肉注射疫苗组合物1，2ml/头；第2组每头颈部肌肉注射疫苗组合物2，2ml/头；第3组每头颈部肌肉注射猪圆环病毒疫苗单苗(即FLFX系列茵格发

Ingelvac

猪圆环病毒疫苗，购自勃林格殷格翰公司)，1头份；第4组为攻毒对照组，第5组为健康对照组。免疫28日，观察临床症状，每周采血，分离血清，用中和试验法检测血清中的圆环病毒中。免疫后28日对所有猪称重，第1、2、3、4组仔猪各用PCV2 SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第4组为健康对照组，各组隔离饲养，攻毒后连续观察25日，于第25日称重后扑杀，剖检。用免疫组化检测脏器PCV2抗原，根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。

4.3试验结果

各试验组猪圆环病毒中和抗体结果见表2。

表2猪圆环病毒中和抗体动态变化

由表2可知：疫苗组合物1、疫苗组合物2免疫28天后，与猪圆环病毒单苗免疫抗体水平基本持平；免疫后第14天，猪圆环病毒中和抗体水平逐渐升高；免疫后第28天，多数达到1:25的以上。各试验组攻毒保护效果见表3。

表3各疫苗免疫后攻毒保护效果

由表3可知：猪圆环病毒单苗免疫组中11#仔猪体温连续3天以上超过40℃，攻毒对照组中16#、17#、19#仔猪体温连续3天以上超过40℃；攻毒对照组的平均相对日增重与空白对照组的平均相对日增重相比，显著低于空白对照组(P<0.05)，判定该组所有猪有临床症状，其他组别与空白对照组体重无显著差异；免疫组化检测结果显示猪圆环病毒单苗免疫组中11#仔猪呈阳性，攻毒对照组16#、18#、19#、20#仔猪呈阳性，其他组别仔猪均为阴性。从攻毒保护效果可以看出，疫苗组合物1免疫组5/5保护，疫苗组合物2免疫组5/5保护，猪圆环病毒单苗4/5保护，而攻毒对照组4/5发病。

总而言之，猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物和猪圆环病毒单苗的保护效果相当，可以预防猪圆环病毒临床发病的产生。

实施例5猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物免疫后猪流感病毒攻毒保护效果比较

5.1材料

猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物选用实例3中的疫苗组合物1、疫苗组合物2，猪流感H1N1单苗，猪流感H3N2单苗；

5.2动物实验设计

选用14-21日龄猪流感病毒、猪圆环病毒抗原、抗体阴性仔猪30只，每组5头，第1组每头颈部肌肉注射疫苗组合物1，2ml/头；第2组每头颈部肌肉注射疫苗组合物2，2ml/头；第3组每头颈部肌肉注射猪流感H1N1单苗，2ml/头；第4组每头颈部肌肉注射猪流感H3N2单苗，2ml/头；第5、6组为攻毒对照组。免疫28日，观察临床症状，每周采血，分离血清，用中和试验法检测血清中的圆环病毒中。免疫后28日，第1、3、5组仔猪以10^8.0TCID₅₀/头攻击猪流感H1N1亚型ZJS株，第2、4、6组仔猪以10^8.0TCID₅₀/头攻击猪流感H3N2亚型WX株，各组隔离饲养，连续观察14日，测量仔猪体温和观察仔猪临床症状；攻毒后14日剖杀，根据赋值情况，比较攻毒对照组和免疫组之间的P值。

5.3试验结果

5.3.1猪流感病毒HI抗体

猪流感病毒HI抗体水平在免疫后第28天，疫苗组合物1免疫组猪流感病毒H1N1亚型HI抗体基本相当均能够达到1:300以上，与猪流感H1N1单苗基本持平(表4)；疫苗组合物2免疫组猪流感病毒H3N2亚型HI抗体能够达到1:260以上，与猪流感H3N2单苗效果相当(表5)。表明：猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物免疫后能维持在一个较高的水平，说明能够充分抵猪流感病毒的攻击。

表4猪流感病毒H1N1亚型HI抗体动态变化

表5猪流感病毒H3N2亚型HI抗体动态变化

5.3.2猪流感病毒攻毒结果

从表6和表7可以看出，通过t-test检验显示，疫苗组合物1免疫组、猪流感H1N1单苗和攻毒对照组之间存在明显差异(P＜0.0001)；疫苗疫苗组合物2、猪流感H3N2单苗和攻毒对照组之间存在明显差异(P＜0.001)。试验结果表明：猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物免疫保护效果良好，能够有效保护仔猪抵御猪流感病毒的感染。

表6猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物免疫后H1N1亚型ZJS株攻毒保护

效果

表7猪流感病毒、猪圆环病毒疫苗组合物免疫后H3N2亚型WX株攻毒保护效果

Claims

1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括i)猪圆环病毒亚单位抗原或者编码猪圆环病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸，

以及ii)猪流感病毒亚单位抗原或者编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸；

其中，所述猪圆环病毒亚单位抗原包括一个或多个猪圆环病毒2型Cap蛋白，

和/或所述编码猪圆环病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪圆环病毒2型Cap蛋白，和/或所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达；

并且，所述猪流感病毒亚单位抗原为一个或多个猪流感病毒HA2蛋白，

和/或所述编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪流感病毒HA2蛋白，和/或所述猪流感病毒HA2蛋白的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达；

所述猪流感病毒HA2蛋白通过基因工程手段与猪圆环病毒2型Cap蛋白相融合而制成融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流感病毒亚单位抗原中的猪流感病毒为来自引起猪流感的正黏病毒科的A型或C型流感病毒。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流感病毒亚单位抗原中的猪流感病毒为来自引起猪流感的正黏病毒科的H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H9N2和/或H5N1亚型流感病毒。

4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流感病毒亚单位抗原中的猪流感病毒为来自引起猪流感的正黏病毒科的H1N1亚型和/或H3N2亚型流感病毒。

5.根据权利要求2-4中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于，来自H1N1的猪流感病毒HA2蛋白的多核苷酸序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列和/或氨基酸序列：

AY619961.1；CY089867.1；GQ457549.1；GQ457548.1；GQ457547.1；CY091769.1；CY091745.1；CY091737.1；CY091729.1；GU721143.3；JF820285.1；JF820277.1；JF707784.1；CY087136.1；CY087104.1；CY087096.1；CY087080.1；CY087072.1；CY087064.1；CY087056.1；CY087048.1；CY086863.1；CY086839.1；CY086353.1；CY086006.1；CY085990.1；CY085982.1；CY085974.1；CY085966.1；CY085958.1；CY085950.1；CY085942.1；CY085934.1；CY085926.1；CY085918.1；CY085910.1；CY085902.1；CY085894.1；CY085886.1；CY085878.1；CY085870.1；CY085854.1；CY085846.1；CY085838.1；CY085830.1；CY085822.1；CY085814.1；CY085806.1；CY085798.1；CY085790.1；CY085782.1；CY085774.1；CY085766.1；CY085758.1；CY085742.1；CY085726.1；CY085718.1；CY085710.1；CY085702.1；CY085694.1；CY085686.1；CY085670.1；JF833344.1；JF833343.1；JF833341.1；JF833339.1；JF833338.1；JF833337.1；JF833335.1；JF916682.1；JF812292.1；JF812291.1；JF812290.1；JF812287.1；JF812284.1；JF812281.1；JF812280.1；JF812279.1；JF812278.1；JF812273.1；JF812272.1；JF812271.1；AF091317.1；AF091315.1；和/或AF091314.1；

并且，来自H3N2的猪流感病毒HA2蛋白的多核苷酸序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列和/或氨基酸序列：

6.根据权利要求1至4中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪圆环病毒亚单位抗原含有猪圆环病毒2型Cap蛋白，并且所述猪流感病毒亚单位抗原含有猪流感病毒HA2蛋白。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白为SEQID No.1编码的蛋白质，或者氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的蛋白质，所述猪流感病毒HA2蛋白为SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.5编码的蛋白质，或者氨基酸序列为SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.6所示的蛋白质。

8.根据权利要求1至4中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流感病毒为从猪分离的流感病毒。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流感病毒为野生型猪流感病毒，和/或来源于野生型猪流感病毒的重组和/或嵌合型流感病毒。

10.根据权利要求8或9所述的疫苗组合物，其特征在于，野生型猪流感病毒的多核苷酸序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列和/或氨基酸序列：

A/swine/Saskatchewan/18789/02、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/NorthCarolina/16497/99、A/Swine/NorthCarolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/NorthCarolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和/或A/Swine/Wisconsin/14094/99。

11.根据权利要求1至4中任意一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包括兽医学上可接受的佐剂。

12.一种核酸分子，其包括编码i)猪圆环病毒亚单位抗原以及ii)猪流感病毒亚单位抗原的多核苷酸序列，其中，

所述猪圆环病毒亚单位抗原包括一个或多个猪圆环病毒2型Cap蛋白，

13.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的编码猪流感病毒亚单位抗原的多核苷酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列：

A/swine/Saskatchewan/18789/02、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/NorthCarolina/16497/99、A/Swine/NorthCarolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/NorthCarolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和/或A/Swine/Wisconsin/14094/99；和/或

14.根据权利要求12或13所述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的编码猪圆环病毒亚单位抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列，并且

所述核酸分子的编码猪流感病毒亚单位抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.3和/或SEQID No.5所示的多核苷酸序列。

15.根据权利要求12或13所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子由于密码子的简并性，与根据权利要求12或13所述的核酸分子的多核苷酸序列不同，但能编码具有相同氨基酸序列的蛋白质和/或肽。

16.一种重组质粒，其特征在于，包括根据权利要求12-15中任意一项所述的核酸分子。

17.根据权利要求16所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为杆状病毒质粒。

18.一种含有根据权利要求16所述的重组质粒的宿主细胞。

19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为微生物细胞和/或昆虫细胞和/或哺乳动物细胞。

20.根据权利要求18所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞DH5α和/或昆虫细胞Sf-9。

21.一种制备根据权利要求1至11中任意一项所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：同时克隆表达所述猪圆环病毒亚单位抗原和所述猪流感病毒亚单位抗原，得到融合抗原。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述融合抗原与佐剂按比例混合。

23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述克隆表达使用杆状病毒表达系统来表达。

24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法中使用了根据权利要求12-15中任意一项所述的核酸分子和/或根据权利要求16或17所述的重组质粒和/或根据权利要求18-20中任意一项所述的宿主细胞。