CN105706916B - 植物系统性侵染病害药物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物系统性侵染病害药物的筛选方法，该方法可针对植株进行系统性施药，解决系统性病害施药困难的问题。本发明包括植株的培育、传病、药物施用和筛选。本发明以系统感染细菌性病害或病毒性病害的草本寄主为试材，给药方法简便易行，可使药物实现系统扩散，能直观反映和正确评价药物抑制病原物的效果，对系统性病害药物筛选和应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物筛选的方法，具体涉及一种植物系统性侵染病害药物的筛选方法。属于植物保护生物测定技术领域。
背景技术
植物系统性侵染病害是指侵染植物的整个生命系统和维管束组织的病害，这类病害在植物中广泛存在，病原物存活于寄主植株体内，该类病害局部侵染系统传播，遍及全株。引起该类病害的病原主要有细菌、病毒和类病毒。其中种类最多的主要是病毒性病害，细菌性病害大多是尚不能体外人工培养的，危害最重的当属由韧皮部杆菌侵染引起的柑橘黄龙病和马铃薯斑马纹病及由植原体侵染引起的枣疯病和丛枝病等。不论是细菌还是病毒或类病毒侵染引起的系统性病害目前均缺乏可供使用的防治药物。造成药物研发缓慢的最主要限制因素是病原物未暴露在植株体外且不可人工培养，常规药物采用喷施法无法穿透植物细胞抵达病灶杀死或抑制病原物增殖，严重制约了相关病害的防治。
为了缩短药物筛选周期，对木本植物进行药效的生物测定通常先选用草本寄主进行实验，以提高筛选效率。如筛选防治韧皮部杆菌和植原体的药物通常选用长春花进行初步筛选，一些病毒性病害常选用草本寄主茄科植物或豆科植物进行筛选。目前，系统性侵染病害给药的方法通常采用离体组织浸泡药物后进行扦插或嫁接，存活后观察发病情况并检测病原物含量，离体浸药的弊端是不能实现活体系统给药，扦插评测药效的周期较长，扦插苗长势没有实生苗好，存活率较低，且不利于以后田间药物的施用，用药前后的对比也不够直观。
系统性病害施药困难，目前尚不能实现针对植株的系统性施药，现阶段急需一种简单高效的给药方法，使药物实现系统扩散，这样既可以快速完成生物测定，又可以直观看出施用效果，从而正确评价药物抑制病原物的效果，对系统性病害药物筛选和应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种植物系统性侵染病害药物的筛选方法，其通过叶柄或枝条给药从而进行药物筛选。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
植物系统性侵染病害药物的筛选方法，步骤如下：
(1)草本寄主的培育和传病：播种草本寄主植物，待其幼苗高度生长至20～30cm，接种病害，注意观察直至病害症状开始表现，得到感病植株；
(2)微型输液器准备：将注射器去除针头和活塞后作为微型输液器的注射针筒，安装针头的接口部分朝下，将注射针筒竖直放置在比感病植株高的位置，注射针筒的针头接口处紧套一硅胶管，作为微型输液器的输液管；之后选一片成熟的叶片，切去叶片留下叶柄，并将叶柄插入硅胶管的另一端，密封硅胶管与叶柄的连接处；
(3)药物施用：将所选药物溶液加入注射针筒中，用封口膜密封注射针筒顶端开口处，并在封口膜上扎若干个孔，以防感病植株吸收药物溶液时产生真空影响药物施用效果，用一个带针头的注射器在靠近叶柄切口处扎孔抽除输液管内的空气，使得药物溶液流至叶柄切口处，拔掉针头，立即用密封胶封堵扎出的针孔，药物溶液持续处理3～5天后移除；
(4)抗病药物筛选：2～3个月后观察症状，通过实时荧光定量PCR检测植株体内病原物的含量，进而分析所用药物的效果。
步骤(1)中，接种病害的方法为菟丝子传毒，植物汁液摩擦或传病昆虫介体接种。
接种病害方法的选择原则是：细菌性系统侵染病害采用菟丝子传毒，取一段20～30cm长的菟丝子缠绕在幼嫩的感病植株枝条上，待其定植后，牵出一段菟丝子缠绕至健康长春花，定植后病原细菌即可传播至健康植株，或者通过嫁接小枝段使健康长春花感病，快速获得足够的病株以供药物生物测定；病毒性或类病毒病害通过感病叶片汁液用金刚砂摩擦健康草本寄主叶片进行接种；已发现传播介体昆虫的系统性侵染病害采用传病昆虫介体进行接种。
步骤(1)中，接种病害后应当每周观察1次。
步骤(2)中，注射针筒的具体安装方法是：在感病植株主干旁1～2cm处插上一根竹签，将注射针筒用橡皮筋竖直固定在竹签顶端，所述注射针筒的最高处比感病植株高至少3cm。
所述注射器为一次性注射器，根据药物溶液的用量选择注射器大小。
步骤(2)中，硅胶管为透明的，其内径为2～5mm。
步骤(2)中，叶柄至少保留3cm，叶柄插入硅胶管至少1.5cm。
步骤(2)中，硅胶管与叶柄的连接处用中性固化硅酮密封胶(可选用犀利、百得和道康宁等品牌的密封胶)密封，密封后静置5分钟。
步骤(3)中，所述密封胶为中性固化硅酮密封胶(可选用犀利、百得和道康宁等品牌的密封胶)。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用微型输液的方式给感病寄主施药，药物可以系统扩散至全株，解决了目前系统侵染病害药物筛选时施药困难的问题；
(2)本发明药物筛选对象主要针对草本寄主，一定程度上解决了木本植物实验周期长，药物筛选的进程缓慢的问题；
(3)本发明可用于抗生素、杀菌剂、干扰RNA、多肽类药物和激素类药物等的生物测定，操作简单易行，筛选方法快速，可以直观准确的评价药物的防控效果。
附图说明
图1是本发明用于药物筛选的微型输液器示意图。
图2是实施例1中不同药物处理后韧皮部杆菌相对含量变化。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1柑橘黄龙病抗生素药物筛选
(1)网室中已萌发嫩芽的感病纽荷尔脐橙，待芽长至5cm时，取一段30cm长的草地菟丝子将一段缠绕至脐橙嫩芽上，套上透明塑料袋保湿，避免阳光直射，约2周菟丝子开始定植产生吸器；
(2)与此同时，将长春花(Catharanthus roseus(L.)G.Don)种子用自来水浸泡过夜后，清洗3次，播种于育苗盆，待苗子长至2片真叶时移栽至盆中，株高20cm时去除顶芽使其分枝生长，待新芽长至15cm时再去除顶芽。侧芽萌发长至5cm时将生长至感病脐橙上的菟丝子一端缠绕至长春花芽上，定植后2周移除菟丝子，每周观察1次，直至病害症状开始表现，感病的长春花可以通过嫁接顶芽或枝段侵染健康植株，快速大量获得感病长春花植株；
(3)在感病长春花植株主干旁2cm的位置插一根长竹签，将一个去除针头部分和活塞部分的5mL注射器用橡皮筋垂直固定在竹签顶端，注射器底端高过植株3cm，安装针头的接口部分朝下，小接口用内径2mm的透明硅胶管连接，然后选一片成熟的叶片切去叶片留叶柄，叶柄部分至少留3cm，将切好的叶柄插入输液管另一端，至少1.5cm深，开口处用中性固化硅酮密封胶密封，静置5min；
(4)将空白对照(水)，50、100μg/mL的羧苄青霉素水溶液、50、100μg/mL的四环素水溶液和50、100μg/mL的硫酸链霉素水溶液分别加到做好标记的微型输液器的5mL注射器中，用封口膜密封注射器开口处，在膜上扎几个孔，立即用一个带针头的注射器在靠近叶柄切口处扎口抽除输液管的空气，使药物流至叶柄切口处，拔掉针头，立即用密封胶封堵针孔，药物持续处理3天后移除；
(5)3个月后取0.2g叶片中脉提取DNA，用Nanodrop测OD值将DNA稀释至相同浓度，用韧皮部杆菌亚洲种特异性引物f-rplLAs(5’-CGCCCGTTTCCGTTGT-3’)和r-rplLAs(5’-AGCCTCTTTAAGCCCTAAATCAG-3’)(参考文献：Teixeira D C,Saillard C,Couture C,Martins E C,WulffN A,Eveillard-Jagoueix S,Yamamoto P T,Ayres A J,Bove JM.Distributionand quantification of Candidatus Liberibacter americanus,agentofhuanglongbing disease of citrusin Paulo State,Brazil,in leaves of anaffected sweet orange tree as determined by PCR[J].Molecular and CellularProbes,2008,22(3):139-150.)，以及内参基因18SF(5’-AATTGTTGGTCTTCAACGAGGAA-3’)和18SR(5’-AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA-3’)(参考文献：Brunner A,Yakovlev I,StraussS.Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies[J].BMC plant biology,2004,4(1):14.)通过实时荧光定量PCR检测植株体内病原物的含量，检测体系均为25μL， Premix Ex TaqTM II 12.5μL，10μM上下游引物各加0.8μL，DNA模板1μL，反应程序在Bio-rad实时荧光定量PCR仪上进行，95℃预变性30s；然后95℃变性5s，63℃延伸30s并采集荧光，共40个循环。通过使用Bio-rad荧光定量PCR软件IQ5计算相对含量比较分析所用药物的效果，试验结果见图2。
实施例2大豆花叶病毒siRNA的施用
(1)网室中播种野生型大豆(Glycine max[L.]Merr.cv.Bragg)，每盆播种2颗，出芽后留取一株健壮苗，2周后用取两片感染大豆花叶病毒(SMV)的叶片，用pH 7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液(每克叶片加10mL磷酸缓冲液)加少量600目金刚砂研磨均匀作为接种液，用棉签蘸取接种液在成熟健康植株叶片上沿中脉摩擦接种，然后用自来水冲洗干净，3周后观察发病情况；
(2)在感病大豆植株主干旁2cm的位置插一根长竹签，将一个去除针头部分和活塞部分的5mL注射器用橡皮筋垂直固定在竹签顶端，注射器底端至少高过植株3cm，安装针头的接口部分朝下，针头接口用内径2mm的透明硅胶管连接，然后选一片成熟的叶片切去叶片留叶柄，叶柄部分至少留3cm，将切好的叶柄插入输液管另一端，至少1.5cm深，开口处用中性固化硅酮密封胶密封，静置5min；
(3)将大豆花叶病毒外壳蛋白片段616bp的siRNA水溶液(参考文献：章洁琼,李红艳,胡小南,等.农杆菌介导的RNAi CP基因在大豆中的转化[J].作物学报,2013,39(9):1594-1601.)分别加到微型输液器的10mL注射器中，用封口膜密封注射器开口处，在膜上扎几个孔，立即用一个带针头的注射器在靠近叶柄切口处扎孔抽除输液管的空气，使药物流至叶柄切口处，拔掉针头，立即用密封胶封堵针孔，药物持续处理2周后，观察大豆新长出叶片症状的表现。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.植物系统性侵染病害药物的筛选方法，其特征在于，步骤如下：
(1)草本寄主的培育和传病：播种草本寄主植物，待其幼苗高度生长至20～30cm，接种病害，注意观察直至病害症状开始表现，得到感病植株；
(2)微型输液器准备：将注射器去除针头和活塞后作为微型输液器的注射针筒，安装针头的接口部分朝下，将注射针筒竖直放置在比感病植株高的位置，注射针筒的针头接口处紧套一硅胶管，作为微型输液器的输液管；之后选一片成熟的叶片，切去叶片留下叶柄，并将叶柄插入硅胶管的另一端，密封硅胶管与叶柄的连接处；
(3)药物施用：将所选药物溶液加入注射针筒中，用封口膜密封注射针筒顶端开口处，并在封口膜上扎若干个孔，以防感病植株吸收药物溶液时产生真空影响药物施用效果，用一个带针头的注射器在靠近叶柄切口处扎孔抽除输液管内的空气，使得药物溶液流至叶柄切口处，拔掉针头，立即用密封胶封堵扎出的针孔，药物溶液持续处理3～5天后移除；
(4)抗病药物筛选：2～3个月后观察症状，通过实时荧光定量PCR检测植株体内病原物的含量，进而分析所用药物的效果。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，接种病害的方法为菟丝子传毒，植物汁液摩擦或传病昆虫介体接种。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，接种病害方法的选择原则是：细菌性系统侵染病害采用菟丝子传毒，取一段20～30cm长的菟丝子缠绕在幼嫩的感病植株枝条上，待其定植后，牵出一段菟丝子缠绕至健康长春花，定植后病原细菌即可传播至健康植株，或者通过嫁接小枝段使健康长春花感病，快速获得足够的病株以供药物生物测定；病毒性或类病毒病害通过感病叶片汁液用金刚砂摩擦健康草本寄主叶片进行接种；已发现传播介体昆虫的系统性侵染病害采用传病昆虫介体进行接种。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，接种病害后应当每周观察1次。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，注射针筒的具体安装方法是：在感病植株主干旁1～2cm处插上一根竹签，将注射针筒用橡皮筋竖直固定在竹签顶端，所述注射针筒的最高处比感病植株高至少3cm。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述注射器为一次性注射器，根据药物溶液的用量选择注射器大小。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，硅胶管为透明的，其内径为2～5mm。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，叶柄至少保留3cm，叶柄插入硅胶管至少1.5cm。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，硅胶管与叶柄的连接处用中性固化硅酮密封胶密封，密封后静置5分钟。
10.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，所述密封胶为中性固化硅酮密封胶。
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