CN103232997A - 一种提取银合欢叶片组织中总rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，在提取银合欢叶片组织中总RNA过程中，通过加入了0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末全面去除多糖、蛋白质和粘稠透明不溶物；该方法所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0，所得RNA的纯度及产量较高，同时该方法获得的RNA提取液经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测时，条带清晰，RNA的完整性好，所提取RNA完全可用于银合欢分子生物学相关研究，对于分析银合欢基因的表达和调控、基因克隆及其功能鉴定、分子标记辅助育种具有重要意义，实用性强，具有较强的推广与应用价值。

Description

一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，尤其涉及一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法。

背景技术

银合欢原产美洲，是一种重要的热带、亚热带木本豆科牧草和速生林树种，可以用于饲料、绿肥、燃料、林木及植物修复、水土保持、培养食用菌、保健和药用等，被联合国粮农组织的饲料专家誉为干旱地区的“  蛋白质仓库”和“奇迹树”  。我国于1957年开始进行银合欢引种栽培研究，并选育“热研1号银合欢”  。目前，银合欢异木虱已成为影响银合欢种植和利用的最主要害虫。银合欢抗异木虱育种已成为急待解决的问题，然而，作为热带豆科木本牧草的银合欢育种时间长，特别是仅凭表现型选择亲本具有不确定性。应用分子标记辅助育种，可以合理筛选亲本、加速育种进程。

从生物组织中提取高质量的总RNA对于分析基因的表达和调控、基因克隆及其功能鉴定、分子标记辅助育种等具有重要意义。不同生物组织，特别是高等植物，常常由于富含多酚氧化物、多糖、蛋白质等，使得其总RNA提取十分困难。银合欢植物叶片中粗蛋白质含量为22％～29％、含羞草素2％～5％，其总RNA提取更加困难。本发明人查阅了大量的文献，均未发现银合欢叶片总RNA的提取报道。

发明内容

本发明提供了一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，旨在解决目前无法从银合欢叶片提取总RNA的问题。

本发明的目的在于提供一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液充分摇匀，取15mL提取液于50mL离心管中，并在65℃水浴中预热；

步骤二，取2.0～3.0g银合欢叶片在液氮中磨成细粉末，转入盛有预热的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液的离心管中，并向离心管中加入0.8mL的β-巯基乙醇、0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋涡混匀10min；

步骤三，在65℃下对离心管水浴20min，每5min上下振荡离心管1次；

步骤四，加入15mL配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀10min，冰浴5min；

步骤五，加冰冷的5mol/L、pH为4.8的醋酸钾(KAc)7mL，轻轻摇动离心管，使上面的液体混匀，冰浴30min；

步骤六，在4℃、18000r/min条件下离心15min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤七，向盛有上清液的离心管中加入等体积的配比为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇混合液，旋涡混匀10min；

步骤八，在4℃、12000r/min条件下，离心10min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤九，加入等体积的配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀5min；

步骤十，在4℃、12000r/min条件下离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中，加入0.3mL的β-巯基乙醇，再加入相当于上清液体积1/3的8mol/L的LiCl溶液，在-30℃下放置8h；

步骤十一，将离心管置于冰上解冻，在4℃、18000r/min条件下离心10min，弃上清液；

步骤十二，将沉淀用1mL75％的乙醇冲洗，转入1.5mL离心管中，在4℃、15000r/m条件下离心15min，弃上清液；

步骤十三，用0.8mL75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃、13000r/min条件下离心5min，弃上清液；

步骤十四，将试管置于超净工作台上，并倒放在灭菌滤纸上，凉干5～10min；

步骤十五，加入50μL经1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子双蒸水，将沉淀溶解后置-80℃保存备用。

进一步，该方法所用到的塑料离心管、移液抢头均用1g/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌，烘干备用；研钵及金属药匙用锡箔纸包好，并在180℃烘箱中烘烤8h。

进一步，采用紫外分光光度计分别测定样品在260nm、280n  h处的OD值，通过计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值可对RNA质量进行检测。

进一步，纯净的RNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值应在1.7-2.0之间，否则表明样品中有蛋白质或酚试剂的污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值大于2.0则表明样品中有小分子、盐和DNA的污染；

该方法所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0；RNA的浓度在9.0～11.0μg/μL，2.0～3.0g的银合欢叶片可得到400～600μg的总RNA。

进一步，取部分RNA提取液进行1.5％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测，通过分析带型可判断所提取RNA的完整性。

进一步，该方法获得的RNA提取液经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测条带清晰，且28S亮度为18S的1.9～2.1倍，完全可用于银合欢分子生物学相关研究。

进一步，该方法所选用的银合欢植株的叶片为2～3月龄。

进一步，该方法提取银合欢叶片组织中总RNA时，采用UNIVERSAL32R型高速冷冻离心机进行离心处理。

本发明提供的提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，在提取银合欢叶片组织中总RNA过程中，通过加入了0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末全面去除多糖、蛋白质和粘稠透明不溶物；该方法所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0，所得RNA的纯度及产量较高，同时该方法获得的RNA提取液经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测时，条带清晰，RNA的完整性好，所提取RNA完全可用于银合欢分子生物学相关研究，对于分析银合欢基因的表达和调控、基因克隆及其功能鉴定、分子标记辅助育种具有重要意义，实用性强，具有较强的推广与应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例提供的提取银合欢叶片组织中总RNA的方法的实现流程图；

图2是本发明实施例提供的所提取叶片总RNA经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测的结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

图1示出了本发明实施例提供的提取银合欢叶片组织中总RNA的方法的实现流程。

该方法包括以下步骤：

在步骤S101中，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液充分摇匀，取15mL提取液于50mL离心管中，并在65℃水浴中预热；

在步骤S102中，取2.0～3.0g银合欢叶片在液氮中磨成细粉末，转入盛有预热的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液的离心管中，并向离心管中加入0.8mL的β-巯基乙醇、0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋涡混匀10min；

在步骤S103中，在65℃下对离心管水浴20min，每5min上下振荡离心管1次；

在步骤S104中，加入15mL配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀10min，冰浴5min；

在步骤S105中，加冰冷的5mol/L、pH为4.8的醋酸钾(KAc)7mL，轻轻摇动离心管，使上面的液体混匀，冰浴30min；

在步骤S106中，在4℃、18000r/min条件下离心15min，将上清液转入另一支50mL的离心管中；

在步骤S107中，向盛有上清液的离心管中加入等体积的配比为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇混合液，旋涡混匀10min；

在步骤S108中，在4℃、12000r/min条件下，离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中；

在步骤S109中，加入等体积的配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀5min；

在步骤S110中，在4℃、12000r/min条件下离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中，加入0.3mL的β-巯基乙醇，再加入相当于上清液体积1/3的8mol/L的LiCl溶液，在-30℃下放置8h；

在步骤S111中，将离心管置于冰上解冻，在4℃、18000r/min条件下离心10min，弃上清液；

在步骤S112中，将沉淀用1mL75％的乙醇冲洗，转入1.5mL离心管中，在4℃、15000r/m条件下离心15min，弃上清液；

在步骤S113中，用0.8mL75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃、13000r/min条件下离心5min，弃上清液；

在步骤S114中，将试管置于超净工作台上，并倒放在灭菌滤纸上，凉干5～10min；

在步骤S115中，加入50μL经1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子双蒸水，将沉淀溶解后置-80℃保存备用。

在本发明实施例中，该方法所用到的塑料离心管、移液抢头均用1g/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌，烘干备用；研钵及金属药匙用锡箔纸包好，并在180℃烘箱中烘烤8h。

在本发明实施例中，采用紫外分光光度计分别测定样品在260n    m、280n  m处的OD值，通过计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值可对RNA质量进行检测。

在本发明实施例中，纯净的RNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值应在1.7～2.0之间，否则表明样品中有蛋白质或酚试剂的污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值大于2.0则表明样品中有小分子、盐和DNA的污染；

该方法所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0；RNA的浓度在9.0～11.0μg/μL，2.0～3.0g的银合欢叶片可得到400～600μg的总RNA。

在本发明实施例中，取部分RNA提取液进行1.5％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测，通过分析带型可判断所提取RNA的完整性。

在本发明实施例中，该方法获得的RNA提取液经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测条带清晰，且28S亮度为18S的1.9～2.1倍，完全可用于银合欢分子生物学相关研究。

在本发明实施例中，该方法所选用的银合欢植株的叶片为2～3月龄。

在本发明实施例中，该方法提取银合欢叶片组织中总RNA时，采用UNIVERSAL32R型高速冷冻离心机进行离心处理。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

用于试验的植物材料：银合欢植株的叶片(2～3月龄)；

化学试剂：液氮、1g/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液、β-巯基乙醇、交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)、5mol/L醋酸钾(KAc)、8mol/L的氯化锂(LiCl)、酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液、氯仿/异戊醇(24∶1)混合液、10×MOPS电极缓冲液、琼脂糖；

仪器设备：超净工作台、UNIVERSAL32R型高速冷冻离心机、紫外分光光度计(3300)、微量移液枪、DDY-6C型电泳仪、Alphalmager2200型凝胶成像系统。

银合欢叶片组织中总RNA提取的技术方案如下：

第一步：

凡用到的塑料离心管、移液抢头均用1g/L的DEPC水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌，烘干备用；研钵及金属药匙用锡箔纸包好并在180℃烘箱中烘烤8h以上以备用；

第二步：

将CTAB提取液充分摇匀，取15mL提取液于50mL离心管中，65℃水浴中预热；

第三步：

取2.0～3.0g银合欢叶片在液氮中磨成细粉末，转入预热的CTAB提取液中；加入0.8mL的β-巯基乙醇、0.9～1.0g的PVPP粉末，旋涡混匀10min；

第四步：

65℃水浴20min，每5min上下振荡试管1次；

第五步：

加15mL氯仿：异戊醇(24∶1)，旋涡混匀10min，冰浴5min；

第六步：

加冰冷的5mol/L的KAc(pH4.8)7mL，轻轻摇动试管，使上面的液体混匀，冰浴30min；

第七步：

在4℃、18000r/min条件下离心15min，将上清液转入另一支50mL的离心管中；

第八步：

加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，旋涡混匀10min；

第九步：

4℃、12000r/min，离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中；

第十步：

加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀5min；

第十一步：

在4℃、12000r/min条件下离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中，加0.3mLβ-巯基乙醇，再加入相当于上清液体积1/3的8mol/L的LiCl溶液，-30℃条件下放置8h；

第十二步：

离心管置于冰上解冻，在4℃、18000r/min条件下离心10min，弃上清液；

第十三步：

沉淀用1mL75％的乙醇冲洗，转入1.5mL离心管中，在4℃、15000r/m条件下离心15min，去上清液；

第十四步：

用0.8mL75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃、13000r/min条件下离心5min，去上清液；

第十五步：

试管置于超净台上，并倒放在灭菌滤纸上，凉干5～10min；

第十六步：

加  50μL经DEPC处理过的去离子双蒸水(dd H₂O)将沉淀溶解，置-80℃保存备用。

本发明技术方案带来的有益效果

RNA质量的检测：用紫外分光光度计分别测定样品在260n      m、280n  m  处的OD值，计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。纯净的RNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值应在1.7-2.0之间，否则表明样品中有蛋白质或酚试剂的污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值大于2.0则表明样品中有小分子、盐和DNA的污染。本发明所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0；RNA的浓度在9.0～11.0μg/μL，2.0～3.0g的材料可得到400～600μg的总RNA。

同时，取部分RNA提取液进行1.5％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测，分析带型以判断所提RNA的完整性。经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测条带清晰，且28S亮度为18S的1.9～2.1倍(如图2所示)，本方法所提取的RNA质量完全可用于银合欢分子生物学相关研究。

本发明实施例提供的提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，在提取银合欢叶片组织中总RNA过程中，通过加入了0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末全面去除多糖、蛋白质和粘稠透明不溶物；该方法所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0，所得RNA的纯度及产量较高，同时该方法获得的RNA提取液经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测时，条带清晰，RNA的完整性好，所提取RNA完全可用于银合欢分子生物学相关研究，对于分析银合欢基因的表达和调控、基因克隆及其功能鉴定、分子标记辅助育种具有重要意义，实用性强，具有较强的推广与应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液充分摇匀，取15mL提取液于50mL离心管中，并在65℃水浴中预热；

步骤二，取2.0～3.0g银合欢叶片在液氮中磨成细粉末，转入盛有预热的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液的离心管中，并向离心管中加入0.8mL的β-巯基乙醇、0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋涡混匀10min；

步骤三，在65℃下对离心管水浴20min，每5min上下振荡离心管1次；

步骤四，加入15mL配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀10min，冰浴5min；

步骤五，加冰冷的5mol/L、pH为4.8的醋酸钾(KAc)7mL，轻轻摇动离心管，使上面的液体混匀，冰浴30min；

步骤六，在4℃、18000r/min条件下离心15min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤七，向盛有上清液的离心管中加入等体积的配比为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇混合液，旋涡混匀10min；

步骤八，在4℃、12000r/min条件下，离心10min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤九，加入等体积的配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀5min；

步骤十，在4℃、12000r/min条件下离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中，加入0.3mL的β-巯基乙醇，再加入相当于上清液体积1/3的8mol/L的LiCl溶液，在-30℃下放置8h；

步骤十一，将离心管置于冰上解冻，在4℃、18000r/min条件下离心10min，弃上清液；

步骤十二，将沉淀用1mL75％的乙醇冲洗，转入1.5mL离心管中，在4℃、15000r/m条件下离心15min，弃上清液；

步骤十三，用0.8mL75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃、13000r/min条件下离心5min，弃上清液；

步骤十四，将试管置于超净工作台上，并倒放在灭菌滤纸上，凉干5～10min；

步骤十五，加入50μL经1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子双蒸水，将沉淀溶解后置-80℃保存备用。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法所用到的塑料离心管、移液抢头均用1g/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌，烘干备用；研钵及金属药匙用锡箔纸包好，并在180℃烘箱中烘烤8h。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用紫外分光光度计分别测定样品在260n  m  、280nm处的OD值，通过计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值可对RNA质量进行检测。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，纯净的RNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值应在1.7-2.0之间，否则表明样品中有蛋白质或酚试剂的污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值大于2.0则表明样品中有小分子、盐和DNA的污染；

该方法所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0；RNA的浓度在9.0～11.0μg/μL，2.0～3.0g的银合欢叶片可得到400～600μg的总RNA。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，取部分RNA提取液进行1.5％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测，通过分析带型可判断所提取RNA的完整性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法获得的RNA提取液经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测条带清晰，且28S亮度为18S的1.9～2.1倍，完全可用于银合欢分子生物学相关研究。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法所选用的银合欢植株的叶片为2～3月龄。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法提取银合欢叶片组织中总RNA时，采用UNIVERSAL32R型高速冷冻离心机进行离心处理。

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