CN105699144B - 一种黄颡鱼组织中n4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄颡鱼组织中N4‑乙酰基‑磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，步骤是：A、选取已确认不含磺胺甲噁唑和N4‑乙酰基‑磺胺甲噁唑的雌性黄颡鱼；B、将磺胺甲噁唑用二甲基甲酰胺溶解，再用水稀释，配制成磺胺甲噁唑溶液；C、按60mg/kg黄颡鱼体重的剂量口灌磺胺甲噁唑溶液，将口灌磺胺甲噁唑后的黄颡鱼放在水中观察；D、选择没有回吐的黄颡鱼制备N4‑乙酰基‑磺胺甲噁唑残留标准物质，采集黄颡鱼背部肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢分别匀质，制备出黄颡鱼组织中N4‑乙酰基‑磺胺甲噁唑残留标准物质，冷冻保存。方法易行，操作简便，并对制备出的标准物质进行定值，均匀性和稳定性检验。

Description

一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制 备方法
技术领域
本发明属于水产品安全检测技术领域，更具体涉及一种黄颡鱼组织中磺胺甲噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，适用于黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中磺胺甲噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备。
背景技术
磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)，属于广谱抗菌药物，是全球范围内销售量和使用量最大的药物之一，广泛用于畜禽及水产养殖业疾病的防治。人体长期摄入含有磺胺类药物残留的动物性食品容易导致药物在体内蓄积，易导致细菌耐药性的产生，对人类的身体健康产生很大的危害。近年来，磺胺甲噁唑在体内主要被N-乙酰基转移酶代谢为N4-乙酰磺胺甲噁唑，而且磺胺甲噁唑的毒性与体内的代谢产物有关。摄入含磺胺类药物残留的食物后会在人体内蓄积，当药物蓄积到一定浓度时会对人体机能产生损害，可产生过敏、尿结晶、造血紊乱和致癌等毒性反应，因此，磺胺类药物在动物源性食品中的残留越来越受到重视。
为保障水产品质量安全，进而保护人类的健康，提供一种可靠的定性、定量方法分析水产品中磺胺甲噁唑的代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑是非常必要的，但目前的分析方法主要采用在水产品中添加的方式来判断水产品中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑分析方法的准确度、精密度以及对其进行定量。但通过直接添加N4- 乙酰基-磺胺甲噁唑的方式与磺胺甲噁唑在水产动物体内代谢产生N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的方式不同，磺胺甲噁唑在水产动物体内代谢过程复杂，与水产动物体结合形式多样，在提取方式、提取剂的使用、检测结果的准确性等均同人为添加药物残留的检测不同，因此，有必要制备一种水产动物组织中磺胺甲噁唑的代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质用于分析水产品中磺胺甲噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的残留量，本发明发明了一种黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中磺胺甲噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法。
目前，国内外未见有黄颡鱼组织中磺胺甲噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法的报道或申请专利。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中磺胺甲噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，制备的N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质是采用给黄颡鱼口灌磺胺甲噁唑，进入黄颡鱼体内的磺胺甲噁唑被黄颡鱼代谢为N4-乙酰基-磺胺甲噁唑，从而在黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中形成一定浓度的N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留，在给药后合适的时间(黄颡鱼的组织中只有N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留，没有磺胺甲噁唑残留)取黄颡鱼的肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织，制备出黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，方法易行，操作简便，并对黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4- 乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的浓度进行定值，并进行均匀性和稳定性检验。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
其技术构思是：选取60g～90g的已确认不含磺胺甲噁唑及其代谢产物N4- 乙酰基-磺胺甲噁唑的雌性黄颡鱼在1m3水族箱内暂养一周，淡水养殖条件，水温为25℃～26℃，pH为7.9～8.1，连续充气，溶解氧值≥5.0mg/L。将0.84g 磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再用水稀释定容至100mL，配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液，按60mg/kg黄颡鱼的体重的剂量口灌磺胺甲噁唑溶液，将口灌磺胺甲噁唑后的黄颡鱼暂放在40L的水族箱中(有20L水) 观察有无回吐，选择没有回吐的黄颡鱼用于制备N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，将其放到1m3水族箱中，水族箱中有300L水，采集口灌磺胺甲噁唑后216h的黄颡鱼的肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢等组织。采集黄颡鱼的背部肌肉，去皮后切成小块，用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的肌肉匀质，制备出肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月。打开黄颡鱼的鳃盖，采集黄颡鱼的鳃弓和鳃丝于10mL 离心管中，用小剪刀将其剪碎后，用高速匀浆机(S-10手持式高速匀浆机)将其匀质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；采集黄颡鱼的卵巢组织于50mL离心管中用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAX T18basic)将黄颡鱼的卵巢匀浆，制备出卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3 个月；采集黄颡鱼的肝脏、肾脏组织分别放于小塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏和肾脏组织碾碎，分别制备出肝脏和肾脏中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月。
一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，其步骤是：
A、选取60g～90g已确认不含磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的雌性黄颡鱼，在1m3水族箱内暂养一周，用于制备黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质。淡水养殖条件，水温为25℃～26℃，pH为7.9～8.1，连续充气，溶解氧值≥5.0mg/L；
B、称取0.84g磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再用水稀释定容至100mL，配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液；
C、按60mg/kg黄颡鱼的体重的剂量口灌磺胺甲噁唑溶液，将口灌磺胺甲噁唑后的黄颡鱼暂放在40L的水族箱中(有20L水)观察有无回吐，选择没有回吐的黄颡鱼用于制备N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质；
D、将没有回吐的黄颡鱼放入另一水族箱中(有300L水的1m3水族箱中)，养殖过程中不饲喂任何饲料；
E、从水族箱中取5尾养殖192h-240h后的黄颡鱼，分别采集新鲜黄颡鱼的背部肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢等组织，将相同组织合并。
F、将采集新鲜黄颡鱼的背部肌肉，去皮后切成小块，用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的肌肉匀质，制备出肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月。
G、打开黄颡鱼的鳃盖，用采集新鲜黄颡鱼的鳃弓和鳃丝于10mL离心管中，用小剪刀将其剪碎后，用高速匀浆机(S-10手持式高速匀浆机)将其匀质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；
H、采集新鲜黄颡鱼的卵巢组织于50mL离心管中用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAXT18 basic)将黄颡鱼的卵巢匀浆，制备出卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；
I、采集新鲜黄颡鱼的肝脏、肾脏组织分别放于小塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏和肾脏组织碾碎，分别制备出肝脏和肾脏中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；
黄颡鱼各组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑定量分析方法：
J、将黄颡鱼肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织的样品进行处理：从采集新鲜黄颡鱼的肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中，分别称取1g肝脏、肾脏、鳃、卵巢和2g肌肉组织样品，分别放到10mL离心管中，加入50μL 1μg/mL的磺胺甲噁唑同位素内标(磺胺甲噁唑-d4)，再加入5mL乙腈，振荡30s左右，超声 3min，再加入1g无水硫酸钠，振荡30s左右，8000r/min离心4－6min，转移上层液体到10mL离心管中，再向残渣中加入4mL乙腈，振荡30s左右，8000r/min离心4－6min，合并两次乙腈提取液于同一10mL离心管中，置49－51℃氮吹仪上氮吹至干，加入1mL定容溶液溶解残渣，振荡30s左右，加入试剂A，振荡30s左右，8000r/min，离心4－6min，弃去上层液体，下层液体过0.22μm 聚醚砜水系滤头过滤，获得从肝脏、肾脏、鳃、卵巢组织中提取、净化后含N4- 乙酰基-磺胺甲噁唑可供HPLC-MS/MS分析的液体。
K、HPLC-MS/MS的分析条件：色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱(150mm×2.1 mm,5μm)；柱温：34－36℃，流速：0.2mL/min；流动相：有机相为试剂B，水相为试剂C和试剂D的水溶液。梯度洗脱程序：有机相与水相初始的体积比为 20:80，维持1min；从1min到3min，有机相与水相的体积比由20:80均匀变为45:55；从3.0min到7.5min，有机相与水相的体积比45:55维持不变；再从 7.5min到7.6min，有机相与水相的体积比由45:55均匀变为20:80；7.6min 到8.5min，有机相与水相的体积比维持20:80不变；进样量10μL。
L、离子化模式：大气压电喷雾离子源(ESΙ)，正离子模式；检测方式采用选择反应监测(SRM)模式；喷雾电压：3500V；蒸发气温度：48－52℃；鞘气压力35arb；辅助气压力5arb；碰撞气及压力：氩气(纯度≥99.999)，1.5m Torr；离子传输毛细管温度：348－352℃；Q1 PW 0.7，Q3 PW 0.7。母离子、定性离子对、定量离子对、碰撞能量见表1。
表1磺胺甲噁唑、磺胺甲噁唑-d4、N4-乙酰基-磺胺甲噁唑质谱条件
*离子为定量离子
所述的试剂A是甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、环己烷试剂中的任意一种；
所述的试剂B是乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸、甲酸试剂中的任意一种；
所述的定容溶液为试剂B与蒸馏水按一定体积比混合配制而成，试剂B与蒸馏水的体积比为10:90-30:70；
所述的试剂C是乙酸、甲酸、氢氟酸、氨水中的任意一种；
所述的试剂D是磷酸二氢铵、乙酸铵、甲酸铵、磷酸氢二铵中的任意一种；
所述的试剂C和试剂D的水溶液是蒸馏水中加入试剂C和试剂D，试剂C 在蒸馏水中的体积比为0.05％-0.5％，试剂D在蒸馏水中的质量比为5mM-20mM；
所述的试剂C和试剂D的水溶液的配制方法：移取50μL-5000μL试剂C，称取0.38g-1.54g试剂D加入1L蒸馏水中混匀后配制而成；
所述的定容溶液的配制方法：移取10mL-30mL试剂B加入90mL-70mL蒸馏水混匀配制成定容溶液。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
(1)本发明通过给黄颡鱼口灌磺胺甲噁唑，黄颡鱼将磺胺甲噁唑代谢产生N4-乙酰基-磺胺甲噁唑，并残留在黄颡鱼的肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中，制备成黄颡鱼肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中N4-乙酰基- 磺胺甲噁唑残留标准物质。
(2)本发明通过黄颡鱼作为将产生N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的生物反应器，反映出磺胺甲噁唑在黄颡鱼体内真实的吸收、分布和残留规律，制备出的黄颡鱼肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，更接近N4-乙酰基-磺胺甲噁唑在黄颡鱼各组织中的实际存在状态，与实际检测样品一致。
(3)本发明制备的黄颡鱼肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中N4-乙酰基 -磺胺甲噁唑的残留标准物质可用于定量研究N4-乙酰基-磺胺甲噁唑在黄颡鱼组中的分布规律。
(4)本发明的分析方法对黄颡鱼的肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中 N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的残留量定量准确度和精密度高，结果见表2。
表2黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑(每个浓度测定5个平行样品)
附图说明
图1为一种磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑标准溶液HPLC-MS/MS色谱图。
1-N4-乙酰基-磺胺甲噁唑色谱峰，2-磺胺甲噁唑色谱峰，A-质荷比(m/z)254的总离子流图，B-质荷比(m/z)296的总离子流图。
图2为一种实施例1中黄颡鱼肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的HPLC-MS/MS色谱图。
1-N4-乙酰基-磺胺甲噁唑色谱峰，2-无磺胺甲噁唑色谱峰，A-质荷比(m/z)254的总离子流图，B-质荷比(m/z)296的总离子流图。
图3为一种实施例1中黄颡鱼肝脏中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的HPLC-MS/MS色谱图。
1-N4-乙酰基-磺胺甲噁唑色谱峰，2-无磺胺甲噁唑色谱峰，A-质荷比(m/z)254的总离子流图，B-质荷比(m/z)296的总离子流图。
图4为一种实施例1中黄颡鱼肾脏中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的HPLC-MS/MS色谱图。
1-N4-乙酰基-磺胺甲噁唑色谱峰，2-无磺胺甲噁唑色谱峰，A-质荷比(m/z)254的总离子流图，B-质荷比(m/z)296的总离子流图。
图5为一种实施例1中黄颡鱼鳃中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的HPLC-MS/MS色谱图。
1-N4-乙酰基-磺胺甲噁唑色谱峰，2-无磺胺甲噁唑色谱峰，A-质荷比(m/z)254的总离子流图，B-质荷比(m/z)296的总离子流图。
图6为一种实施例1中黄颡鱼卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的HPLC-MS/MS色谱图。
1-N4-乙酰基-磺胺甲噁唑色谱峰，2-无磺胺甲噁唑色谱峰，A-质荷比(m/z)254的总离子流图，B-质荷比(m/z)296的总离子流图。
具体实施方式
实施例1：
一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，其步骤是：
A、选取60g或80或90g已确认不含磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的雌性黄颡鱼，在1m3水族箱内暂养一周，用于制备黄颡鱼组织中N4-乙酰基- 磺胺甲噁唑残留标准物质。淡水养殖条件，水温为25或26℃，pH为7.9或8或 8.1，连续充气，溶解氧值≥5.0mg/L；
B、称取0.84g磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再用水稀释定容至100mL，配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液；
C、按60mg/kg黄颡鱼的体重的剂量口灌磺胺甲噁唑溶液，将口灌磺胺甲噁唑后的黄颡鱼暂放在40L的水族箱中(有20L水)观察有无回吐，选择没有回吐的黄颡鱼用于制备N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质；
D、将没有回吐的黄颡鱼放入有300L水的1m3水族箱中(另一水族箱)，养殖过程中不饲喂任何饲料；
E、从水族箱中取5尾养殖168h或216h或240h后的黄颡鱼，分别采集新鲜黄颡鱼的背部肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢等组织，将相同组织合并。
F、将采集新鲜黄颡鱼的背部肌肉，去皮后切成小块，用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的肌肉匀质，制备出肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月。
G、打开黄颡鱼的鳃盖，采集新鲜黄颡鱼的鳃弓和鳃丝于10mL离心管中，用小剪刀将其剪碎后，用高速匀浆机(S-10手持式高速匀浆机)将其匀质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；
H、采集新鲜黄颡鱼的卵巢组织于50mL离心管中用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAXT18 basic)将黄颡鱼的卵巢匀浆，制备出卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；
I、采集新鲜黄颡鱼的肝脏、肾脏组织分别放于小塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏和肾脏组织碾碎，分别制备出肝脏和肾脏中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；
黄颡鱼各组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑定量分析方法
J、将新鲜黄颡鱼肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织的样品进行处理：从采集新鲜黄颡鱼的肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中，分别称取1g肝脏、肾脏、鳃、卵巢和2g肌肉组织样品，分别放到10mL离心管中，加入50μL 1μg/mL 的磺胺甲噁唑同位素内标(磺胺甲噁唑-d4)，再加入5mL乙腈，振荡30s，超声3min，再加入1g无水硫酸钠，振荡30s，8000r/min离心5min，转移上层液体到10mL离心管中，再向残渣中加入4mL乙腈，振荡30s，8000r/min离心5min，合并两次乙腈提取液于同一10mL离心管中，置50℃氮吹仪上氮吹至干，加入1mL定容溶液溶解残渣，振荡30s，加入试剂A，振荡30s，8000r/min，离心5min，弃去上层液体，下层液体过0.22μm聚醚砜水系滤头过滤，获得从肝脏、肾脏、鳃、卵巢组织中提取、净化后含N4-乙酰基-磺胺甲噁唑可供 HPLC-MS/MS分析的液体。
K、HPLC-MS/MS的分析条件：色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱(150mm×2.1 mm,5μm)；柱温：35℃，流速：0.2mL/min；流动相：有机相为试剂B，水相为试剂C和试剂D的水溶液。梯度洗脱程序：有机相与水相初始的体积比为20: 80，维持1min；从1min到3min，有机相与水相的体积比由20:80均匀变为 45:55；从3.0min到7.5min，有机相与水相的体积比45:55维持不变；再从7.5 min到7.6min，有机相与水相的体积比由45:55均匀变为20:80；7.6min到8.5 min，有机相与水相的体积比维持20:80不变；进样量10μL。
L、离子化模式：大气压电喷雾离子源(ESΙ)，正离子模式；检测方式采用选择反应监测(SRM)模式；喷雾电压：3500V；蒸发气温度：50℃；鞘气压力35arb；辅助气压力5arb；碰撞气及压力：氩气(纯度≥99.999)，1.5m Torr；离子传输毛细管温度：350℃；Q1 PW 0.7，Q3PW 0.7。获得黄颡鱼组织中磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的HPLC-MS/MS色谱图。
实施例2：
使用实施例1中方法口灌黄颡鱼磺胺甲噁唑后24h、72h、96h、120h、 144h、168h、192h、216h所采集新鲜的黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢中磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留浓度如表3所示。
表3不同时间黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢中磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的浓度
注：ND为未检出
其它实施步骤与实施例1相同。
实施例3：
制备的黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑标准物质均匀性检验
使用实施例1中的方法口灌磺胺甲噁唑后第216h采集5尾黄颡鱼的肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢，每尾采集黄颡鱼的背部肌肉，去皮后切成小块，用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的肌肉匀质，制备出肌肉中 N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月。打开黄颡鱼的鳃盖，采集黄颡鱼的鳃弓和鳃丝于10mL离心管中，用小剪刀将其剪碎后，用高速匀浆机(S-10手持式高速匀浆机)将其匀质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；采集黄颡鱼的卵巢组织于50mL离心管中用高速匀质机(IKAULTRA-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的卵巢匀浆，制备出卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；采集黄颡鱼的肝脏、肾脏组织分别放于小塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏和肾脏组织碾碎，分别制备出肝脏和肾脏中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月。黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢样品前处理和样品中的检测N4-乙酰基-磺胺甲噁唑按照实施例1的方法进行，检测结果见表4。
表4黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质均匀性检测结果
其它实施步骤与实施例1相同。
实施例4：
将采集的黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢样品在-20℃条件下储存10d、 30d、60d、90d后，肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢中的N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的检测按照实施例1的方法进行，检测结果见表5和表6。
表5黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质稳定性检测结果
表6黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢，-20℃保存90d后的N4-乙酰基-磺胺甲噁唑检测值与进行均匀性检测获得的N4-乙酰基-磺胺甲噁唑平均初始值的变化率
样品名称 -20℃保存90d组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑变化率
肌肉 (134.67-133.32)÷134.67＝1.00％
鳃 (117.89-116.28)÷117.89＝1.37％
肝脏 (6649.89-6638.19)÷6649.89＝0.18％
肾脏 (106.92-105.16)÷106.92＝1.65％
卵巢 (839.41-835.92)÷839.41＝0.42％
其它实施步骤与实施例1相同。

Claims (5)

1.一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，其步骤是：
A、选取60g～90g已确认不含磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的雌性黄颡鱼，在水族箱内养一周，用于制备黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，淡水养殖条件，水温为25℃～26℃，pH为7.9～8.1，连续充气，溶解氧值≥5.0mg/L；
B、称取0.84g磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再用水稀释定容至100mL，配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液；
C、按60mg/kg黄颡鱼体重的剂量口灌磺胺甲噁唑溶液，将口灌磺胺甲噁唑后的黄颡鱼放在水族箱中观察有无回吐，选择没有回吐的黄颡鱼用于制备N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质；
D、将没有回吐的黄颡鱼放入另一水族箱中，养殖过程中不饲喂任何饲料；
E、从水族箱中取养殖192h-240h后的黄颡鱼，分别采集新鲜黄颡鱼的背部肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织，将相同组织合并；
F、将采集新鲜黄颡鱼的背部肌肉，去皮后切成块，用高速匀质机将黄颡鱼的肌肉匀质，制备出肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存；
G、打开黄颡鱼的鳃盖，用采集新鲜黄颡鱼的鳃弓和鳃丝于离心管中，将其剪碎后，用高速匀浆机将其匀质，-20℃冷冻保存；
H、采集新鲜黄颡鱼的卵巢组织于离心管中用高速匀质机将黄颡鱼的卵巢匀浆，制备出卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存；
I、采集新鲜黄颡鱼的肝脏、肾脏组织分别放于塑料封口袋中，将袋内肝脏和肾脏组织碾碎，分别制备出肝脏和肾脏中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质，-20℃冷冻保存；黄颡鱼各组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑定量分析方法如下：
J、将黄颡鱼肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉标准物质样品进行处理：分别称取步骤F-I得到的肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉标准物质样品，分别放到离心管中，加入50μL 1μg/mL的磺胺甲噁唑同位素内标：磺胺甲噁唑-d4，再加入5mL乙腈，振荡30s，超声2－4min，再加入1g无水硫酸钠，振荡30s，8000r/min离心4－6min，转移上层液体到离心管中，再向残渣中加入4mL乙腈，振荡30s，8000r/min离心4－6min，合并两次乙腈提取液于同一离心管中，置49－51℃氮吹仪上氮吹至干，加入1mL定容溶液溶解残渣，振荡30s，加入试剂A，振荡30s，8000r/min，离心4－6min，弃去上层液体，下层液体过0.22μm聚醚砜水系滤头过滤，获得从肝脏、肾脏、鳃、卵巢组织中提取、净化后含N4-乙酰基-磺胺甲噁唑供HPLC-MS/MS分析的液体；
K、HPLC-MS/MS的分析条件：色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱；柱温：34－36℃，流速：0.2mL/min；流动相：有机相为试剂B，水相为试剂C和试剂D的水溶液，梯度洗脱程序：有机相与水相初始的体积比为20:80，维持1min；从1min到3min，有机相与水相的体积比由20:80均匀变为45:55；从3.0min到7.5min，有机相与水相的体积比45:55不变；再从7.5min到7.6min，有机相与水相的体积比由45:55均匀变为20:80；7.6min到8.5min，有机相与水相的体积比维持20:80不变；进样量10μL；
所述的试剂A是甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、环己烷试剂中的任意一种；
所述的试剂B是乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸、甲酸试剂中的任意一种；
所述的试剂C是乙酸、甲酸、氢氟酸、氨水中的任意一种；
所述的试剂D是磷酸二氢铵、乙酸铵、甲酸铵、磷酸氢二铵中的任意一种；
L、离子化模式：大气压电喷雾离子源，正离子模式；检测方式采用选择反应监测模式；
喷雾电压：3500V；蒸发气温度：48－52℃；鞘气压力35arb；辅助气压力5arb；碰撞气及压力：氩气纯度≥99.999，1.5m Torr；离子传输毛细管温度：348－352℃；Q1PW0.7，Q3PW0.7。
2.根据权利要求1所述一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，其特征在于：所述的定容溶液为试剂B与蒸馏水按一定体积比混合配制而成，试剂B与蒸馏水的体积比为10:90-30:70。
3.根据权利要求1所述一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，其特征在于：所述的试剂C和试剂D的水溶液是蒸馏水中加入试剂C和试剂D配制而成，试剂C在蒸馏水中的体积比为0.05％-0.5％，试剂D在蒸馏水中的摩尔浓度为5mM-20mM。
4.根据权利要求1所述一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，其特征在于：所述的试剂C和试剂D的水溶液的配制为：移取50μL-5000μL试剂C，称取0.38g-1.54g试剂D加入1L蒸馏水中混匀后配制而成。
5.根据权利要求1所述一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法，其特征在于：所述的定容溶液的配制为：移取10mL-30mL试剂B加入90mL-70mL蒸馏水混匀配制成定容溶液。
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