CN106497790A - 一种组织保存液及其制备和保存野外采样分离水生生物细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织保存液，包括混合均匀的生理盐水和甘油；生理盐水与甘油的体积比为1：0.5~1。本发明还提供该组织保存液的制备方法和保存野外采样分离水生生物细菌的方法。本发明提供一种用于保存患病水生生物组织样的组织保存液，在0~‑20℃保存时间达2个月后，采取平板涂布方法分离病原菌，仍可以分离到水生生物病原菌。本发明适合没有‑80℃冷冻保存措施情况下的长期野外采样工作，本发明有效解决了水生生物病原采样分离过程中的常见的平板污染及细菌失活的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物体外组织保存试剂技术领域，具体涉及一种便于野外采样分离水生生物细菌的组织保存液。本发明还涉及该组织保存液保存野外采样组织分离水生生物细菌的方法。
背景技术
科研工作者进行水生生物细菌病病害防治工作时，特别是进行流行病学调查时，经常要到野外、养殖池塘边进行现场采集细菌病原样。以往的方法往往是携带配制好的培养基平板，现场分离病原菌，并于当天或隔天把平板送到实验室进行病原菌的分离纯化；或采集水生生物组织样，直接用采样箱低温保存，当天送到实验室尽快进行细菌病原分离。该类方法均要求样品在短时间内分析，而且在保存过程中还存在平板污染或样品污染的风险，大大限制了水生生物细菌病原的采样分离工作。在进行水生生物病原调查时，理想状况是能够围绕一个特定的范围一次出差十几天甚至一两个月集中采集样品，然后带回实验室有充足的时间进行分析，但是样品如果没有妥善保存的话，又很容易出现样品污染或失活的情况。如何克服长时间的野外采样样品污染及失去活性的问题已成为水生生物病原调查的难点问题。在野外条件下，一般无法提供常规菌种保存的-80℃条件，但是在借用渔民、居民的家用冰箱，或旅馆的冰箱时，通常能够达到-20~0℃的保存条件。因此，如何利用现有的野外采样条件，达到长时间（1~2个月）有效保存样品，是解决现有水生生物病原调查的难点问题的一个办法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种便于野外采样分离水生生物细菌的组织保存液，可以在-20~0℃状态下保存样品1~2月，并保持样品有效活性。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
一种组织保存液，其特征在于，
包括混合均匀的生理盐水和甘油；
生理盐水与甘油的体积比为1：0.5~1。
为了获得更好的技术效果，生理盐水与甘油的体积比为1：1；
为了获得更好的技术效果，所述生理盐水的质量浓度为0.85%；
为了获得更好的技术效果，所述甘油的质量浓度不低于99.5%；
为了获得更好的技术效果，所述保存液需经高温高压灭菌，灭菌条件为0.10~0.12MPa，温度121～126℃，维持20～30 min。
本发明还提供该组织保存液的制备方法和保存野外采样分离水生生物细菌的方法，
一种组织保存液的制备方法，其步骤为，
（1）称取0.85 g NaCl，搅拌溶解于100 ml 双蒸水中，配制质量浓度0.85% 的生理盐水溶液100 ml；
（2）量取甘油50-100 ml；
（3）将上述两种溶液等体积混合在一起，充分搅拌均匀，得到混合液；
（4）将上述混合液高温高压灭菌，灭菌条件为0.10~0.12MPa，温度121～126℃，维持20～30 min，冷却后，即得到本发明组织保存液。
一种组织保存液保存野外采样分离水生生物细菌的方法，其步骤为，
（1）在酒精灯火焰下，解剖病鱼或其他水生生物，用剪刀和小镊子剪取病灶组织或内脏器官组织的组织样100~200 mg，置于灭菌的1.5 ml EP管中；
（2）用移液枪吸取0.5 ml配制好的组织保存液，置于步骤（1）所述EP管中，淹没组织样；
（3）使步骤（1）所述EP管中的组织样成匀浆状；
（4）用移液枪吸取0.5ml组织保存液于步骤（1）所述EP管中，移液枪吸打混合均匀；
（5）用封口膜密封含有保存液及组织匀浆的EP管，做好标记；
（6）将上述标记好的EP管置于采样箱中。
作为优化，步骤（6）所述采样箱中预先放置足量的-20℃冰冻过夜的冰袋，所述EP管放到采样箱底层；
作为优化，步骤（6）后，回到驻地后把冰袋和标记好的EP管转移到-20℃冰箱冰冻保存。
本发明提供一种用于保存患病水生生物组织样的组织保存液，在0~-20℃保存时间达2个月后，采取平板涂布方法分离病原菌，仍可以分离到水生生物病原菌。本发明适合没有-80℃冷冻保存措施情况下的长期野外采样工作，本发明有效解决了水生生物病原采样分离过程中的常见的平板污染及细菌失活的问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
一种组织保存液，
包括生理盐水和甘油；
所述生理盐水的质量浓度为0.85%；所述甘油的质量浓度不低于99.5%；
各组份的体积份数的组成为：
生理盐水1份；
甘油0.5-1份；
所述保存液经121～126 ℃，0.10~0.12MPa高温高压灭菌20～30 min。
实施例2
实施例1所述组织保存液的制备方法，其步骤为，
（1）称取0.85 g NaCl，搅拌溶解于100 ml 双蒸水中，配制质量浓度0.85% 的生理盐水溶液100ml；
（2）量取甘油50-100ml；
（3）将上述两种溶液等体积混合在一起，充分搅拌均匀，得到混合液；
（4）将上述混合液高温高压灭菌，灭菌条件为0.10~0.12MPa，温度121～126℃，维持20～30 min，冷却后，得到本发明实施例1所述组织保存液。
实施例3
一种组织保存液保存野外采样分离水生生物细菌的方法，其步骤为，
（1）在酒精灯火焰下，解剖病鱼或其他水生生物，用剪刀和小镊子剪取病灶组织或内脏器官组织的组织样100~200 mg，置于灭菌的1.5 ml EP管中；
（2）用移液枪吸取0.5 ml配制好的组织保存液，置于步骤（1）所述EP管中，淹没组织样；
（3）用手动或电动研磨棒研磨组织样，使步骤（1）所述EP管中的组织样成匀浆状；
（4）用移液枪吸取0.5ml组织保存液于步骤（1）所述EP管中，移液枪吸打混合均匀；
（5）用封口膜密封含有保存液及组织匀浆的EP管，做好标记；
（6）将上述标记好的EP管置于放满-20℃冰冻过夜的冰袋的采样箱底层；
（7）12h内把含有组织样的EP管，转移到-20℃冰箱冰冻保存2个月。
实施例4
一种野外采样分离水生生物细菌的检测方法，其步骤为，
（1）将实施例3所述在组织保存液中保存2个月的组织样进行检测，取出EP管，解冻后，振荡摇匀，取200 μl保存的组织样浆液涂布营养琼脂培养板；
（2）28℃恒温培养24~48 h，观察培养板，培养板长有数百个菌落，挑取大小均一的优势菌株，进行纯化培养；
（3）感染实验证实该优势菌为草鱼病原菌；
（4）该草鱼病原菌经16S rRNA序列测序， Genbank中Blast比对证实为气单胞菌属细菌。
实施例5
本发明组织保存液保存野外采样分离水生生物细菌的方法与现有水生生物病原菌采样方法比较，
实验组：使用实施例3方法保存组织样2个月后进行细菌分离；
对照组1：现场用培养基平板进行细菌分离；
对照组2：使用采样箱直接保存的组织样品，当天带回实验室进行细菌分离；
三种采样方法采集同一尾患病草鱼肝脏组织中的病原菌，每种方法平行采集两份样品，分离平板菌落情况见表1。
。
由表1可知三种方法分离的菌株形态及数量没有显著差异，且经鉴定优势菌株均为嗜水气单胞菌。在分离质量上，实验组和对照组一较对照组二为优，均能得到较纯的优势菌落。由此可知本发明能够在野外条件下使水生生物样品能够保存至少2个月之久而不影响其细菌分离效果，解决了长期的野外水生生物病原采样分离过程中的常见的平板污染及细菌失活的问题。
实施例6
在实验室模拟野外采样环境——保存温度变化的情况下样品的保存时间对细菌分离效果的影响，
设置20℃、10℃、4℃、0℃、-4℃、-10℃及-20℃7个温度梯度；
实验组使用本发明方法实施例1组织保存液，按照本发明实施例3的步骤（1）~步骤（5）方法采集同一尾发病草鱼肝脏样品共14份，分别在20℃、10℃、4℃、0℃、-4℃、-10℃及-20℃温度条件下储存1d、10d、30d、60d（每个温度下各平行储存两份样品）后，按照本发明实施例4方法进行细菌分离；
对照组1采用平板分离上述本实例中同一尾发病草鱼肝脏细菌共14份，分别在20℃、10℃、4℃、0℃、-4℃、-10℃及-20℃温度条件下储存1d、10d、30d、60d（每个温度下各平行储存两份样品）后，按照本发明实施例4方法进行细菌分离，评价细菌平板放置于设定温度梯度下的效果；
对照组2 采集本实例中同一尾草鱼肝脏组织样不经发明保存液处理，分别直接放置在20℃、10℃、4℃、0℃、-4℃、-10℃及-20℃温度条件下储存1d、10d、30d、60d（每个温度下各平行储存两份样品）后，按照本发明实施例4方法进行细菌分离，评价设定温度梯度下的效果。
细菌分离结果见表2，由表2可知使用本发明保存液在20℃时样品能保存1d，10℃时能保存1~10d，10d时效果不稳定；4℃时能够稳定保存1~10d，10~30d也有效果，但不稳定；0℃时可以较稳定的保存30d，30~60d也有效果，但稳定性不太好；在0℃以下，样品保存60d内均能取得很好的结果，不过温度越低的话，细菌分离效果会越好（见表2实验组）。
对照组1中的细菌平板在20℃、10℃和4℃条件下可保存1d，1d后平板会出现污染；在0℃以下细菌因冻伤或冻死，失去活性。
对照组2方法采样分离细菌仅在4℃时保存1d组织能用于细菌分离，在20℃、10℃保存组织样品会出现样品严重污染腐烂发臭，无法采样；在0℃以下到组织样冻结，组织中的细菌因冻伤或冻死，失去活性，无法采集到细菌。
本实验表明在0℃以下，用本发明保存液保存水生生物组织样，保存时间可以达2个月之久。
。
说明： “++”表示分离效果好，菌落纯，优势菌明显，菌落数量多；“+”表示分离效果较好，菌落较纯，优势菌较明显，菌落数量较多； “+/-”表示效果不稳定，有时能分离到菌，有时分离不到；“-”表示分离不到细菌或分离到霉菌杂菌。“--”表示平板污染，长有大量的霉菌或杂菌。“*”表示细菌冻伤或冻死，不生长。“/”表示因平板污染或细菌及死亡实验终止。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其配比、工艺所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
虽然本发明已以实施例公开如上，但并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种组织保存液，其特征在于，
包括混合均匀的生理盐水和甘油；
生理盐水与甘油的体积比为1：0.5~1。
2.如权利要求1所述组织保存液，其特征在于，所述生理盐水与甘油的体积比为1：1。
3.如权利要求1或2所述组织保存液，其特征在于，所述生理盐水的质量浓度为0.85%。
4.如权利要求1或2所述组织保存液，其特征在于，所述甘油的质量浓度不低于99.5%。
5.如权利要求1所述组织保存液，其特征在于，所述保存液需经高温高压灭菌，灭菌条件为0.10~0.12MPa，温度121～126℃，维持20～30 min。
6.权利要求1-5所述组织保存液的制备方法，其步骤为，
（1）称取0.85 g NaCl，搅拌溶解于100 ml 双蒸水中，配制质量浓度0.85% 的生理盐水溶液100 ml；
（2）量取甘油50-100 ml；
（3）将上述两种溶液等体积混合在一起，充分搅拌均匀，得到混合液；
（4）将上述混合液高温高压灭菌，灭菌条件为0.10~0.12MPa，温度121～126℃，维持20～30 min，冷却后，即得到本发明组织保存液。
7.权利要求1-5所述组织保存液保存野外采样分离水生生物细菌的方法，其步骤为，
（1）在酒精灯火焰下，解剖病鱼或其他水生生物，用剪刀和小镊子剪取病灶组织或内脏器官组织的组织样100~200 mg，置于灭菌的1.5 ml EP管中；
（2）用移液枪吸取0.5 ml配制好的组织保存液，置于步骤（1）所述EP管中，淹没组织样；
（3）使步骤（1）所述EP管中的组织样成匀浆状；
（4）用移液枪吸取0.5ml组织保存液于步骤（1）所述EP管中，移液枪吸打混合均匀；
（5）用封口膜密封含有保存液及组织匀浆的EP管，做好标记；
（6）将上述标记好的EP管置于采样箱中。
8.如权利要求7所述所述组织保存液保存野外采样分离水生生物细菌的方法，其特征在于，步骤（6）所述采样箱中预先放置足量的冰袋，所述EP管放到采样箱底层。
9.如权利要求7所述所述组织保存液保存野外采样分离水生生物细菌的方法，其特征在于，步骤（6）后，回到驻地后把冰袋和标记好的EP管转移到冰箱冰冻保存。
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