CN105695498A - 高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法 - Google Patents

高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法 Download PDF

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Abstract

高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，涉及一种副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法。本发明是要解决现有副干酪乳杆菌的细菌素产量低的问题。方法：一、从副干酪乳杆菌HD1.7中扩增prcR基因；二、构建质粒pMD18-T-prcR；三、构建重组过表达载体pRSFDuet-1-prcR；四、构建重组过表达载体pRR-tet；五、将过表达载体pRR-tet电转化副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞；六、prcR基因过表达突变株的筛选和鉴定。该基因工程菌株的抑菌能力比原始菌株提高了20.69％。传代后发酵液细菌素效价2430.45±39.04AU/mL，传代后效价比较稳定。本发明用于产细菌素。

Description

高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法
技术领域
本发明涉及一种副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法。
背景技术
副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7细菌素的产生与群体相应密切相关，该效应系统受三组分调节系统体系(3CRS)的调控，包括自诱导肽(AIP)、组氨酸蛋白激酶(HPK)和反应调节因子(RR)组成。其中prcR基因编码的产物与反应调节因子(RR)具有同源性。因此过表达该基因对提高副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)细菌素产量会起到一定的促进作用。然而目前针对L.paracasei基因过表达的研究鲜有报道，利用过表达技术研究副干酪乳杆菌群体效应相关基因功能方面还是一片空白。
发明内容
本发明是要解决现有副干酪乳杆菌的细菌素产量低的问题，提供一种高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法。
本发明通过过表达L.paracaseiHD1.7群体效应相关基因(prcR)，来提高L.paracaseiHD1.7产细菌素的能力。插入tet基因用于筛选prcR基因过表达突变株。
本发明高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、从副干酪乳杆菌HD1.7中扩增prcR基因；
二、将prcR基因与pMD18-T载体连接构建质粒pMD18-T-prcR；
三、以表达质粒pRSFDuet-1为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因prcR，构建重组过表达载体pRSFDuet-1-prcR；
四、以表达质粒pRSFDuet-1-prcR为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因tet，构建重组过表达载体pRR-tet；
五、将过表达载体pRR-tet电转化副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞；
六、prcR基因过表达突变株的筛选和鉴定。
本发明的有益效果：
本发明构建了prcR基因过表达突变株，利用电转化方法转入了感受态细胞中，通过荧光定量PCR方法测定突变株prcR基因的mRNA表达水平时发现，prcR基因过表达突变株均比原始菌株的基因表达量高；利用SDS-PAGE和Westernblot分析检测过表达突变株相应基因蛋白的表达时发现，分别在30kDa处出现目的条带，为prcR基因编码的组氨酸蛋白激酶，而原始菌株在相应位置未出现条带。同时prcR基因过表达突变株分别比原始菌株蛋白表达提高131.04％，较预期(120％)提高了9.37％，其抑菌能力比原始菌株提高了20.69％。传代后发酵液细菌素效价2430.45±39.04AU/mL，传代后效价比较稳定，说明菌株具有良好的遗传稳定性。本发明关于基因过表达突变株的构建的研究将为今后基因功能的研究和细菌素的生产提供理论了依据。
附图说明
图1为prcR基因PCR扩增产物电泳图；其中M：DNAMarkerDL2000；1：PCR产物；
图2为质粒pRSFDuet-1SacI及PstI双酶切胶回收验证结果；其中M：DNAMarkerDL15000；1：质粒pRSFDuet-1SacI及PstI双酶切胶回收产物；
图3为质粒pMD18-T-prcRSacI及PstI双酶切胶回收验证结果；其中M：DNAMarkerDL15000；1：质粒pMD18-T-prcRSacI及PstI双酶切胶回收产物；
图4为质粒pRSFDuet-1-prcRKpnI酶切胶回收验证结果；其中M：DNAMarkerDL15000；1：质粒pRSFDuet-1-prcRKpnI酶切胶回收产物；
图5为重组质粒PCR扩增Tetr基因结果；其中M：DNAMakerDL15000；1-5：Tetr基因PCR扩增产物；
图6为重组质粒KpnI酶切验证结果；其中M：DNAMarkerDL15000；1-5：重组质粒酶切产物；
图7为重组质粒EcoRV酶切验证结果；其中M：DNAMarkerDL15000；1-5：重组质粒酶切产物；
图8为Tet-up、Tet-down引物对PCR验证结果；其中M：DNAMarkerDL2000；1：以prcR过表达突变株gDNA为模板的PCR产物；2：以原始菌株gDNA为模板的PCR产物
图9为SDS-PAGE鉴定PrcR蛋白的表达；其中M、1、2分别代表蛋白Marker、原始菌株、prcR基因过表达突变株；
图10为prcR基因蛋白的Westernblotting检测；
图11为prcR基因过表达突变株表达PrcR蛋白的强度；
图12为prcR基因过表达突变株和原始菌株对枯草芽孢杆菌的抑菌试验；其中1、2分别为HD1.7、prcR基因过表达突变株抑菌圈(pH5.5)；
图13为不同发酵次数的发酵液效价检测结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、从副干酪乳杆菌HD1.7中扩增prcR基因；
二、将prcR基因与pMD18-T载体连接构建质粒pMD18-T-prcR；
三、以表达质粒pRSFDuet-1为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因prcK，构建重组过表达载体pRSFDuet-1-prcR；
四、以表达质粒pRSFDuet-1-prcK为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因tet，构建重组过表达载体pRR-tet；
五、将过表达载体pRR-tet电转化副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞；
六、prcR基因过表达突变株的筛选和鉴定。
本实施方式以副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7为载体，采用过表达技术，构建其群体效应相关基因(prcR)过表达突变株，利用过表达prcR基因的方法提高副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7产细菌素的能力，为今后基因过表达及细菌素的生产提供理论依据。
步骤一所述副干酪乳杆菌HD1.7已在文献《副干酪乳杆菌HD1.7遗传转化体系的初步建立》(中国农学通报，2011,27(23))中公开。
本实施方式中每个步骤的具体内容及结果如下：
1、prcR的克隆
以L.paracaseiHD1.7基因组DNA(gDNA)为模板，用prcR-up、prcR-down引物(表1)进行PCR扩增反应，反应体系如表2，反应程序如表3。PCR产物末端加“A”：向上述PCR产物中加入0.25μLTaq(5U/μL)DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min。
表1引物序列
表2prcR基因克隆反应体系
体系组分 添加量(μL) 组分终浓度
10×Pfu Buffer(Mg2+plus) 5 1×
dNTP Mixture(2.5mmol/L) 4 0.2mmol/L
gDNA(25ng/μL) 10 5ng/μL
prcR-up(1pmol/μL) 10 0.2pmol/μL
prcR-down(1pmol/μL) 10 0.2pmol/μL
Pfu DNA polymerase(2.5U/μL) 0.5 0.025U/μL
灭菌ddH2O 5.5 —
总体积 50
表3prcR基因克隆的反应程序
以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1。PCR产物prcR与目的片段大小相同，为789bp，与设计结果相符。
2、pMD18-T-prcR的构建
使用上海华舜生物科技有限公司胶回收(小量)试剂盒对目的片段进行回收，胶回收产物与pMD18-T载体在16℃水浴中过夜连接，进行TA克隆，反应体系如表4。将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，经培养后，挑取白色单菌落。
表4prcR与pMD18-T连接反应体系
体系组分 添加量
pMD18-T Vector 1μL
Insert DNA(prcR) 3μL
Solution I 5μL
ddH2O Up to 10μL
将筛选出的阳性克隆菌液送Invitrogen生物工程有限公司进行测序，利用生物学软件分析测序结果，重组质粒命名为“pMD18-T-prcR”。
3、过表达载体pRSFDuet-1-prcR的构建
将载体pRSFDuet-1和pMD18-T-prcR分别进行SacI和PstI双酶切，酶切体系如表5，37℃，2h，反应结束后检测酶切结果并利用胶回收纯化目的条带(图2，图3)。将上述酶切片段分别连接，即pRSFDuet-1线性片段分别与prcR酶切片段在16℃水浴中过夜连接，连接体系如表6。连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，抗生素筛选浓度为Kan70μg/mL。对转化后得到的阳性菌提取质粒，即为过表达载体pRSFDuet-1-prcR。
表5重组质粒酶切反应体系
表6prcR与线性pRSFDuet-1的连接反应体系
连接体系中的成分 添加量(μL)
prcR 15
线性pRSFDuet-1 2
10×T4 DNA Ligase Buffer 2
T4DNA Ligase(3U/μL) 1
总体积 20
4、过表达载体pRR-tet的构建
以pBR322为模板，以tet-up、tet-down引物PCR扩增tet基因，反应体系如表7，反应程序如表8，将载体pRSFDuet-1-prcR进行KpnI酶切，酶切体系如表9，37℃水浴2h。将tet片段(图5)与pRSFDuet-1-prcR线性片段(图4)在16℃水浴中过夜连接，连接体系如表10。
表7tet基因克隆反应体系
体系组分 添加量(μL) 组分终浓度
10×Pfu Buffer(Mg2+plus) 5 1×
dNTP Mixture(2.5mmol/L) 4 0.2mmol/L
gDNA(25ng/μL) 10 5ng/μL
tet-up(1pmol/μL) 10 0.2pmol/μL
tet-down(1pmol/μL) 10 0.2pmol/μL
Pfu DNA polymerase(2.5U/μL) 0.5 0.025U/μL
灭菌ddH2O 5.5 —
总体积 50
表8tet基因克隆的反应程序
表9质粒pRSFDuet-1-prcR和pBR322酶切反应体系
表10prcR与线性pRSFDuet-1的连接反应体系
连接体系中的成分 添加量(μL)
prcR 15
线性pRSFDuet-1 2
10×T4 DNA Ligase Buffer 2
T4 DNA Ligase(3U/μL) 1
总体积 20
连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，抗生素筛选浓度为Tet50μg/mL。随机挑取多个白色菌落分别接种于10mL含终浓度50μg/mLTet的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养过夜。阳性重组质粒命名为“pRR-tet”。
对转化后得到的阳性菌进行酶切验证结果(图6)表明：1，2，5泳道可见重组质粒pRR-tet被KpnI单酶切，并且其酶切产物可以产生两条清晰的条带，其大小分别与pRSFDuet-1-prcR线性片段4.6kb和tetr片段1.4kb大小相符；EcoRV单酶切pRR-tet结果如图7所示：1，2，5泳道可见重组质粒pRR-tet被EcoRV单酶切，产生三条条带，说明tetr基因正向插入到pRSFDuet-1-prcR表达质粒载体上。
5、电转化L.paracaseiHD1.7感受态细胞
将3μg过表达质粒与40μL感受态细菌在冰浴条件下混匀，然后将其加入到冰预冷的0.2cm电转杯中，并于冰上放置10min。使用电穿孔仪，设定各参数：电阻值200Ω，电容值25μF，点击时间5ms，电压1.8kv。电穿孔后迅速加入500μLMRS培养基，转入1.5mL离心管内，30℃静置培养5h。取100μL涂布于相应的抗生素筛选平板上，30℃静置培养72h。空白对照组为不添质粒，直接取40μL副干酷乳杆菌感受态细胞于电转化杯中，其余步骤同上。
6、prcR基因过表达突变株的筛选和鉴定
筛选出在四环素终浓度为50μg/mL的MRS抗性平板上生长的单菌落，连续传代培养3-4次，观察突变株的稳定性。用Tet-up、Tet-down引物对进行PCR验证，同时，用原始菌株基因组(gDNA)作对照。反应体系和反应程序同表2、3，以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果如图8所示：可从突变株基因组DNA中扩增出与Tetr基因(1.4kb)大小相同的片段，而不能从原始菌株中扩增出相同的片段，说明pRR-tet过表达质粒成功转化入L.paracaseiHD1.7，prcR基因过表达突变株构建成功。
7、Westernblot检测过表达突变株prcR基因蛋白表达效果
提取过表达突变株的蛋白，进行SDS-PAGE试验，电泳完毕后将凝胶片转移至纤维素膜上，进行显色反应，利用生物软件对Westernblotting的检测结果进行定量分析，比较原始菌株及prcR基因过表达突变株的蛋白表达情况，确定相关蛋白表达量上的差异，SDS-PAGE电泳结果如图9所示。由图10可知，prcR过表达突变株经诱导后，在30kDa处出现了清晰地条带，该蛋白分子量与理论值相一致；并且蛋白的表达量均明显强于原始菌株，说明过表达突变株成功表达目的蛋白。
由图10可知，过表达突变株中prcR基因蛋白产物经Westernblotting检测后，分别在30kDa处出现单一条带，而原始菌株则未出现相应条带，说明过表达载体成功转化入L.paracaseiHD1.7中，目的蛋白得以表达。
利用软件对Westernblotting的条带进行分析，得到原始菌株及prcR基因过表达突变株表达的蛋白强度，见下表11与图11。
表11prcR基因过表达突变株表达PrcR蛋白的强度
由上述图表分析可知，prcR基因过表达突变株分别比原始菌株蛋白表达提高131.04％，说明两种基因过表达突变株均成功表达目的蛋白，且表达量均明显高于原始菌株。
8、基因过表达突变株抑菌效果测定
对突变株及原始菌株L.paracaseiHD1.7(作对照)进行发酵，做抑菌试验，指示菌选用枯草芽孢杆菌，结果分别如图12所示：prcR基因过表达突变株对枯草芽孢杆菌的抑制程度与原始菌株的抑菌程度相比均显著提高，其产生的细菌素效价分别比原始菌株高20.69％，说明突变株所产生细菌素的量比原始菌株高。
9、基因过表达突变株遗传稳定性试验
将获得的突变菌株在斜面连续传代，每传代一次进行发酵培养，将其接种于MRS培养基中，30℃培养24h，测定发酵液效价如图13所示，其具有良好稳定性及高于原始菌株的细菌素产生量，其细菌素效价达到2430.45±39.04AU/mL。

Claims (7)

1.高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、从副干酪乳杆菌HD1.7中扩增prcR基因；
二、将prcR基因与pMD18-T载体连接构建质粒pMD18-T-prcR；
三、以表达质粒pRSFDuet-1为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因prcR，构建重组过表达载体pRSFDuet-1-prcR；
四、以表达质粒pRSFDuet-1-prcR为骨架，向质粒上的多克隆位点插入目的基因tet，构建重组过表达载体pRR-tet；
五、将过表达载体pRR-tet电转化副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞；
六、prcR基因过表达突变株的筛选和鉴定。
2.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤一中扩增prcR基因的引物为prcR-up和prcR-down，prcR-up引物序列为5’-CCGGAGCTCATGCTGAAGATTTTCATTCTGGAAG-3’，prcR-down引物序列为5’-CCGCTGCAGATGATGATGATGATGATGTCAAGCATCATTTGACAGATCATTG-3’。
3.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤一中扩增prcR基因PCR反应体系如下：
PCR反应程序为：
。
4.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中prcR基因与pMD18-T载体连接反应体系如下：
5.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中构建重组过表达载体pRSFDuet-1-prcR时，用限制性内切酶SacI和Pst对IpRSFDuet-1和pMD18-T-prcR分别进行双酶切。
6.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中tet基因是以pBR322为模板，以tet-up、tet-down引物PCR扩增得到的，PCR反应体系如下：
PCR反应程序为：
。
7.根据权利要求1所述的高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中插入目的基因tet的连接反应体系为：
。
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