CN105695336B - 一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌及其印染应用 - Google Patents

一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌及其印染应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及轻化工领域，旨在提供一种葡萄座腔菌属的菌株Pseudofusicoccum sp.F10及其印染应用。该真菌F10能产生靛蓝色素，该色素为带C‑CH3类取代基、含香酸类化合物，色素在中性及偏碱性水溶液中最大吸收峰位于620nm处，色素在酸性水溶液中沉淀；对氧化剂不敏感，还原剂亚硫酸钠对色素有破坏作用；印染应用时对棉织品印染效果好，媒染剂NaCl有助于染色效果。本发明得到的新型天然染料安全环保，本发明不受地域、环境的限制，真菌色素的重现性好，生物培养方法使得产量大幅度提高，更易实现工业化。

Description

一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌及其印染应用
技术领域
本发明是关于轻化工领域，特别涉及一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccumsp. F10及其印染应用。
背景技术
色素即着色剂，是印染工业和食品添加剂的一个重要组成部分，它可以改善印染物品和食品的色泽，是决定产品品质的关键因素之一。产品的颜色，是产品给消费者视觉的第一感官印象，直接影响到产品的销售业绩，因此产品具有安全的色调和色泽对于产品是非常重要的。色素一般分为合成色素和天然色素。虽然合成色素占据市场的主导地位，但是随着合成色素具有毒性、致癌性，甚至可能导致对重要机体的损伤的报道，合成色素的安全性成为消费者关注的最大热点。随着人们生活水平的提高及保健意识的增强，同时由于天然色素具有安全可靠、无毒副作用、色调自然、抗肿瘤及多功能性等优点，使得天然色素越来越受到关注。天然色素按其来源可分为3类: 植物色素、动物色素和微生物色素。 动植物色素具有季节性和机体本身限制等不利因素，而微生物色素是从微生物中提取, 不受资源、环境和空间的限制，具有植物色素和动物色素所不可比拟的优越性。微生物色素的大量发酵不仅降低了生产成本，而且节约了原材料，保护了生态环境。在自然界中微生物能产生色素的种类非常丰富，但在发酵工业中得到应用的为数不多, 国际上被正式批准生产的天然蓝色素种类很少, 而用微生物发酵生产的蓝色素更是罕见。
蓝色素是三个基本色调（红、黄、蓝 ）之一，其中天然的红、黄品系色素来源较多，天然蓝色素则较为罕见，它可与另两种天然色素搭配成多种色素，极大的丰富了天然色素的种类。在目前为数不多的报道所提及的天然蓝色素中，有的具有抑菌作用（主要对革兰氏阳性菌），如放线紫素（Actinhordin）和石蕊杀菌素(Litmocidin)；有的具有多种营养保健功能,如花青素(Anthocyanidin)。因此，开发天然蓝色素具有重要的理论意义和广阔的应用前景。关于产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccumsp. F10及其印染应用，未见有报道。
发明内容
本发明涉及一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间：2015年5月12；保藏地址：武汉市武昌珞珈山(武汉大学)，邮编为430072 ；保藏编号：CCTCC NO ：M 2015293，分类属葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌属，
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293），其特征在于，该菌气生菌丝的着色随真菌和生长由灰白色变为黑色，在培养皿（PSA,马铃薯蔗糖琼脂培养其）背面颜色由逐渐变蓝灰色，最终变为蓝黑色，气生菌丝顶端形成头状孢子梗，产生透明分生孢子。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293），其特征在于，其ITS 序列：
ACCTACCGGGATTAGGGTCTCTTCCCGAGCCCACTCTCCAACCCTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGTTCTCCGCGGCCGGCCCCCTAGCCGGGGCTGGCCTGCGCCCGCCAGAGGACCACAAAACTCCAGTCAGTGAACTTTGCTGTCTGATATAAATTCAATAAACTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACACCCCTCAAGCTCTGCTTGGTATTGGGCGGCGTCCTCTCCGGACGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTAGAAAACACCTCGCTTTGGAGGACGGGACGACCGCTCGCCGGACGAACCTTTGAATTCATTTTCCTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA
菌株ITS 基因序列在NCBI 数据为中分析比对，鉴定种属于葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌属真菌。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素的方法，以20％的土豆汁为基础，分别加入2％的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉， 在固体培养基上培养5d的菌体为种子，用打孔器接种直径为6mm、菌龄一致的F10菌块于装有100mL不同碳源的液体培养基的250mL三角瓶中，室温25℃、需氧150rpm/min培连续培养10d，产生菌发酵液；观察菌丝量及色素合成情况，结果表明，碳源为甘油、乳糖时，不产色素；碳源为蔗糖、淀粉、麦芽糖时，产色素量较好。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素分离的步骤包括：
（1）菌发酵液经离心收集菌丝，菌丝冷冻干燥，加入适量酸性二氯甲烷，震荡浸提，取上清进行萃取，采用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，获得色素粗品。
（2）硅胶柱层析：利用酸性石油醚进行压柱；采用干法上样，即样品中加入少量硅胶，真空悬干上样；加入少量酸性石油醚，进行压柱；洗脱先用2倍柱体积的酸性石油醚，接着酸性石油醚：二氯甲烷（4:1,2:1,2:3,0:1）2倍柱体积进行洗脱，接着酸性二氯甲烷：甲醇（500:1、250:1、200:1、100：0.8、100:1、100:1.5、50:1）洗脱收集。
（3）葡聚糖sephadex LH-20层析：sephadex LH-20在70%乙醇中浸泡24h活化；ddH2O清洗乙醇，除去ddH2O；甲醇洗涤sephadex LH-20，除去甲醇；甲醇：二氯甲烷（1:1）溶胀sephadex LH-20，30min；柱子中加入部分洗脱剂，把溶胀好的凝胶搅拌均匀，注入柱中；
静置30min，使其气泡自然析出；用2-3倍柱体积的洗脱剂平衡柱子；上样（样品溶解在尽量少的二甲基甲酰胺）；洗脱，先用甲醇：二氯甲烷（1:1）的比例冲洗，接着逐步增加甲醇的比例，直至纯甲醇洗脱；收集产物即获得纯靛蓝色素；
产物经浓缩干燥后，利用HPLC-MS、H谱、红外等进行产物鉴定。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素的结构特征经以下实验获得：
制备色素的水溶液，用紫外可见分光光度计于400-800nm进行光谱扫描，得蓝色素吸收光谱，蓝色素最大吸收峰值为620nm；色素在酸性水溶液中沉淀。
色素经氧化还原环境稳定性试验表明，该化全物对氧化剂不敏感，能在0.2-0.6%的H2O2溶液中，室温静置1h后，测最大吸收峰的吸光度值，计算残存率。结果表明该浓度氧化剂H2O2对该色素没有影响；但还原剂亚硫酸钠对色素有破坏作用。
纯化靛蓝色素的利用HPLC-MS、红外、H谱对物质进行鉴定，从红外得到验证，3422cm-1为羧酸中缔合的O-H，峰形宽而散，吸收强度中；羧酸分子中的双分子缔合，使得C=O的吸收峰向低波数方向移动，因此，1719cm-1为C=O吸收峰，肩峰，吸收强度中；1306cm-1，1226cm-1为C-O的伸缩振动峰，肩峰，吸收强度中。 3100~3000 cm-1附近，有较弱的峰，吸收强度较弱，但1582cm-1，1542cm-1，1500cm-1三处中强峰，则可鉴定含有苯环。也就是说我们的产物为芳香化合物。
虽然，3000-2850cm-1 之间的多重峰较弱，但C-H伸缩振动 1427cm-1，多重峰，吸收强度中，则为C-CH3中C-H弯曲振动。
以上可以说明产物可能为带C-CH3类取代基的含香酸类化合物。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素对棉织品印染特性在于：采用后媒法染色，90℃入染60min，降温至70℃，加入媒染剂NaCl（5g/L），升温至90℃，恒温30min，降至室温后取出布样，水洗后烘干。多次复染，染色效果好。
附图说明
图1葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M2015293）分生孢子梗显微图
图2葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M2015293）产色素在三种pH值水溶液中的可见光吸收扫描图。
图3葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M2015293）产色素的红外色谱扫描图。
图4葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M2015293）产色素对棉织品印染效果图(印染重复三次)。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，仅在说明本发明所提供的菌种特性、该菌发酵液的实验室生产制备方法、色素的分享纯化方法及菌发酵液和色素的印染应用，但本发明并不局限于此。
实施例1：一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间：2015年5月12；保藏地址：武汉市武昌珞珈山( 武汉大学)，邮编为430072 ；保藏编号：CCTCC NO：M 2015293，分类属葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌属，
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293），其特征在于，该菌气生菌丝的着色随真菌和生长由灰白色变为黑色，在培养皿（PSA,马铃薯蔗糖琼脂培养其）背面颜色由逐渐变蓝灰色，最终变为蓝黑色，气生菌丝顶端形成头状孢子梗，产生透明分生孢子，如图1所示。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293），其特征在于，其ITS 序列：
ACCTACCGGGATTAGGGTCTCTTCCCGAGCCCACTCTCCAACCCTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGTTCTCCGCGGCCGGCCCCCTAGCCGGGGCTGGCCTGCGCCCGCCAGAGGACCACAAAACTCCAGTCAGTGAACTTTGCTGTCTGATATAAATTCAATAAACTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACACCCCTCAAGCTCTGCTTGGTATTGGGCGGCGTCCTCTCCGGACGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTAGAAAACACCTCGCTTTGGAGGACGGGACGACCGCTCGCCGGACGAACCTTTGAATTCATTTTCCTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA
菌株ITS 基因序列在NCBI 数据为中分析比对，鉴定种属于葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌属真菌。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素的方法，以20％的土豆汁为基础，分别加入2％的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉， 在固体培养基上培养5d的菌体为种子，用打孔器接种直径为6mm、菌龄一致的F10菌块于装有100mL不同碳源的液体培养基的250mL三角瓶中，室温25℃、需氧150rpm/min培连续培养10d，产生菌发酵液；观察菌丝量及色素合成情况，结果表明，碳源为甘油、乳糖时，不产色素；碳源为蔗糖、淀粉、麦芽糖时，产色素量较好。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素分离的步骤包括：
（１）菌发酵液经离心收集菌丝，菌丝冷冻干燥，加入适量酸性二氯甲烷，震荡浸提，取上清进行萃取，采用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，获得色素粗品。
（２）硅胶柱层析：利用酸性石油醚进行压柱；采用干法上样，即样品中加入少量硅胶，真空悬干上样；加入少量酸性石油醚，进行压柱；洗脱先用2倍柱体积的酸性石油醚，接着酸性石油醚：二氯甲烷（4:1,2:1,2:3,0:1）2倍柱体积进行洗脱，接着酸性二氯甲烷：甲醇（500:1、250:1、200:1、100：0.8、100:1、100:1.5、50:1）洗脱收集。
（3）葡聚糖sephadex LH-20层析：sephadex LH-20在70%乙醇中浸泡24h活化；ddH2O清洗乙醇，除去ddH2O；甲醇洗涤sephadex LH-20，除去甲醇；甲醇：二氯甲烷（1:1）溶胀sephadex LH-20，30min；柱子中加入部分洗脱剂，把溶胀好的凝胶搅拌均匀，注入柱中；
静置30min，使其气泡自然析出；用2-3倍柱体积的洗脱剂平衡柱子；上样（样品溶解在尽量少的二甲基甲酰胺）；洗脱，先用甲醇：二氯甲烷（1:1）的比例冲洗，接着逐步增加甲醇的比例，直至纯甲醇洗脱；收集产物即获得纯靛蓝色素；
产物经浓缩干燥后，利用HPLC-MS、H谱、红外等进行产物鉴定。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素的结构特征经以下实验获得：
制备色素的水溶液，用紫外可见分光光度计于400-800nm进行光谱扫描，得蓝色素吸收光谱，蓝色素最大吸收峰值为620nm；色素在酸性水溶液中沉淀，如图2所示。
色素经氧化还原环境稳定性试验表明，该化全物对氧化剂不敏感，能在0.2-0.6%的H2O2溶液中，室温静置1h后，测最大吸收峰的吸光度值，计算残存率。结果表明该浓度氧化剂H2O2对该色素没有影响；但还原剂亚硫酸钠对色素有破坏作用。
纯化靛蓝色素的利用HPLC-MS、红外、H谱对物质进行鉴定，从红外得到验证，3422cm-1为羧酸中缔合的O-H，峰形宽而散，吸收强度中；羧酸分子中的双分子缔合，使得C=O的吸收峰向低波数方向移动，因此，1719cm-1为C=O吸收峰，肩峰，吸收强度中；1306cm-1，1226cm-1为C-O的伸缩振动峰，肩峰，吸收强度中。 3100~3000 cm-1附近，有较弱的峰，吸收强度较弱，但1582cm-1，1542cm-1，1500cm-1三处中强峰，则可鉴定含有苯环，也就是说我们的产物为芳香化合物，如图3所示。
虽然，3000-2850cm-1 之间的多重峰较弱，但C-H伸缩振动 1427cm-1，多重峰，吸收强度中，则为C-CH3中C-H弯曲振动。
以上可以说明产物可能为带C-CH3类取代基的含香酸类化合物。
所述的一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）产色素对棉织品印染特性在于：棉织品在靛蓝色素水溶液中采用后媒法染色，90℃入染60min，降温至70℃，加入媒染剂NaCl（5g/L），升温至90℃，恒温30min，降至室温后取出布样，水洗后烘干；多次复染，染色效果好，如图4所示。
实施例2：一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌Pseudofusicoccum sp. F10（保藏编号：CCTCC NO：M 2015293）的菌发酵液对棉织品印染特性在于：棉织品在菌发酵液中采用后媒法染色，90℃入染60min，降温至70℃，加入媒染剂NaCl（5g/L），升温至90℃，恒温30min，降至室温后取出布样，水洗后烘干；多次复染，染色效果好。
ACCTACCGGGATTAGGGTCTCTTCCCGAGCCCACTCTCCAACCCTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGTTCTCCGCGGCCGGCCCCCTAGCCGGGGCTGGCCTGCGCCCGCCAGAGGACCACAAAACTCCAGTCAGTGAACTTTGCTGTCTGATATAAATTCAATAAACTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACACCCCTCAAGCTCTGCTTGGTATTGGGCGGCGTCCTCTCCGGACGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTAGAAAACACCTCGCTTTGGAGGACGGGACGACCGCTCGCCGGACGAACCTTTGAATTCATTTTCCTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA

Claims (5)

1.一株产靛蓝色素葡萄座腔菌属真菌(Pseudofusicoccumsp.) F10，其保藏在中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO ：M 2015293。
2.一种利用权利要求1 所述的葡萄座腔菌属真菌(Pseudofusicoccumsp.) F10产靛蓝色素的方法，其特征在于：F10 经PS 液体发酵生成种子培养基，按5% 的接种量在同种培养基上于室温有氧发酵10d，收集菌发酵液；超声破碎菌体，柱层析法分离获得色素。
3.一种由权利要求2 所述的方法获得的色素，其特征在于，色素呈靛蓝色，为带C-CH3类取代基、含香酸类化合物，色素在中性及偏碱性水溶液中最大吸收峰位于620nm处；色素对氧化剂不敏感，还原剂亚硫酸钠对色素有破坏作用。
4.一种由权利要求2 所述的菌发酵液用于印染的用途。
5.一种由权利要求3所述的色素用于印染的用途。
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产蓝色素放线菌的初步鉴定和蓝色素性质研究;张和春等;《无锡轻工大学学报》;19990930;第18卷(第3期);第23-28页 *
天然蓝色素的研究进展;车双辉等;《食品研究与开发》;20030430;第24卷(第2期);第18-20页 *
浅青紫链霉菌蓝色素的稳定性研究;谢勇等;《嘉兴学院学报》;20131130;第25卷(第6期);第41-45页 *
葡萄座腔菌科研究进展;程燕林等;《生态学报》;20111231;第31卷(第11期);第3197-3207页 *

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