CN105693919B - 一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶及其制备方法 - Google Patents
一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶，由作为骨架的聚N‑异丙基丙烯酰胺和作为功能性单体的丙烯酰氨基苯硼酸与丙烯酰氨基二羧甲基‑L‑赖氨酸水合物构建而成，其中作为骨架的聚N‑异丙基丙烯酰胺为粒径150‑250nm且均匀分布的微凝胶粒子，微凝胶的结构式为P(NIPAM‑co‑AAPBA‑co‑AANTA)，该微凝胶粒子在室温下为球形。本发明的优点是：该高分子微凝胶可提高胰岛素负载效率，并实现葡萄糖刺激响应释放胰岛素。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料领域，特别是一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶及其制备方法。
背景技术
胰岛素，作为一种蛋白类药物，广泛用于糖尿病治疗中。但是，在使用的过程中，胰岛素经常会受到体内蛋白酶的作用影响而分解，失去活性。这种容易失活的缺陷大大限制了胰岛素的使用效果，因此，如何在应用的过程中提高胰岛素的稳定性，从而减少胰岛素的应用限制，已经引起了科研工作者的广泛关注。
目前，负载蛋白类药物的方法主要有：1)物理包埋，利用高分子链的亲疏水性构建聚合物胶束，并将蛋白类药物包埋在胶束中；2)静电吸附，利用高分子链与蛋白类药物的电荷不同使其相互作用构建胶束，并将蛋白类药物包埋于其中；3)化学键合，在蛋白类药物表面共价键合可聚合单体后再与其它单体共聚，从而在蛋白周围形成聚合物薄膜，这样可有效避免蛋白变性或降解。蛋白质药物纳米载体已经在某些方面部分改善了蛋白质药物的性能，表现出良好的应用前景，已有部分蛋白质药物纳米载体进入临床试验阶段。但是，基于聚合物纳米粒子的蛋白质药物载体往往存在载药困难、载药量和载药效率低的问题，因此当前对蛋白类药物的负载研究距离工业化生产仍存在一段距离。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶及其制备方法和应用，该高分子微凝胶可提高微凝胶的胰岛素负载效率，而且可实现胰岛素的刺激响应释放。
本发明的技术方案：
一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶，由作为骨架的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)和作为功能性单体的丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)与丙烯酰氨基二羧甲基-L-赖氨酸水合物(AANTA)构建而成，其中作为骨架的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为粒径150-250nm且均匀分布的微凝胶粒子，微凝胶的结构式为P(NIPAM-co-AAPBA-co-AANTA)，该微凝胶粒子在室温下为球形。
一种所述可提高酶热稳定性的高分子微凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)合成丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)功能性单体
将氨基苯硼酸(APBA)溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中，在冰浴中保持30min，然后缓慢滴入丙烯酰氯，氨基苯硼酸、氢氧化钠溶与丙烯酰氯的用量比为8.22g：120mL：6mL，将溶液在冰水浴中保温1.5h，然后把浓度为2N的盐酸溶液加入到体系中得到固体物质，将固体物质分离后用水洗三次，得到AAPBA产物，将产物在真空中干燥得到最终的AAPBA产物；
2)合成丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)功能性单体
①合成苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)
将苄氧羰基-H-赖氨酸(CBZ-lys)和溴乙酸分别溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中，苄氧羰基-H-赖氨酸与氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液的用量比为6g：40mL，溴乙酸与氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液的用量比为5.96g：21.5mL，分别得到CBZ-lys溶液和溴乙酸溶液，然后在冰水浴条件下将CBZ-lys溶液缓慢滴入溴乙酸溶液中，在70℃下反应4h，得到混合液，在室温下将浓度为2N的盐酸溶液缓慢滴入上述混合液中，苄氧羰基-H-赖氨酸、溴乙酸与盐酸溶液的用量比为6g：5.96：20mL，过滤得到CBZ-NTA的粗产物，将粗产物在真空条件下干燥得到白色固体苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)；
②利用苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)合成二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)
在冰浴条件下，将CBZ-NTA和钯炭分别加入到50mL甲醇中，CBZ-NTA与甲醇的用量比为2g：50mL，钯炭与甲醇的用量比为0.2g：50mL，将上述反应物加入烧瓶中，对烧瓶进行抽真空操作，在烧瓶内气压为1.01kPa的条件下向烧瓶内通入一个大气压的氢气，保持气压稳定条件下在25℃水浴中搅拌反应10小时，过滤得到滤渣，将滤渣用蒸馏水清洗10次后收集滤液并将其真空旋干得到产物二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)；
③利用二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)来合成丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)
将NTA溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中得到二羧甲基-L-赖氨酸溶液，NTA与氢氧化钠溶液的用量比为1g：5mL，将丙烯酰氯溶于二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，丙烯酰氯与二氯甲烷的用量比为9.6mL：10mL，在冰水浴条件下在二羧甲基-L-赖氨酸溶液中缓慢滴入丙烯酰氯溶液得到混合溶液，混合溶液中NTA与丙烯酰氯的用量比为1g：9.6mL，搅拌反应4h，用浓度为2N的盐酸溶液将混合溶液调至pH为5后旋干，然后分别用30mL的无水甲醇清洗三次，收集清洗液，最后将甲醇旋干得到AANTA产物；
3)微凝胶溶液的制备
将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)、丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)和N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于水中并混合均匀，过滤除去不溶杂质，然后通入氮气0.5h来排空水溶液中的氧气，将过滤后的溶液在70℃下反应1h后加入过硫酸铵(APS)进行反应8小时，得到微凝胶溶液，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)、丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)水与过硫酸铵(APS)的用量比为0.34g：0.063g：0.158g：0.008g：100mL：0.017g；
4)将上述微凝胶溶液用超纯水稀释5倍得到稀释的微凝胶溶液；
5)将上述稀释的微凝胶溶液用超纯水进行透析至少一周时间，透析完成后取出再加超纯水至微凝胶溶液浓度为0.5mg/mL，制得高分子微凝胶溶液。
一种所述可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶的应用，用于提高提高胰岛素的负载效率，方法如下：
1)将微凝胶加入缓冲溶液中制得微凝胶缓冲溶液，所述缓冲溶液为10mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液溶液；
2)将胰岛素与异硫氰酸荧光素(FITC)在0℃条件下混合搅拌均匀，胰岛素与异硫氰酸荧光素的摩尔比为1:1，然后振荡12个小时，得到异硫氰酸荧光素标记的胰岛素；
3)将制备的微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素混合均匀，微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素溶液的摩尔比为1:1，透析除去未反应的胰岛素，在荧光激发波长为498nm处测定荧光值。
该微凝胶溶液提高胰岛素负载效率的原理：
胰岛素，作为一种具有生理功能的生物大分子，其三维结构决定了他们的活性和作用机理。其中胰岛素B链上含有一个组氨酸残基，成熟的胰岛素储存在胰岛β细胞内的分泌囊泡中，并通过组氨酸残基上的咪唑基团与锌离子配位，从而以六聚体方式存在。在外界刺激下胰岛素随分泌囊泡释放至血液中，并发挥其生理作用。本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶，该微凝胶可提高胰岛素负载效率，而且实现胰岛素的刺激响应释放。本项目拟利用含有AANTA的聚合物纳米载体通过配位作用高效负载胰岛素，并模拟胰岛β细胞针对葡萄糖浓度变化响应性释放胰岛素。
本发明的优点是：
该高分子微凝胶可提高胰岛素负载效率，并实现葡萄糖刺激响应释放胰岛素。
附图说明
图1为得到的微凝胶的扫描电镜照片。
图2为微凝胶的葡萄糖响应开关实验的曲线。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例：
一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶，由作为骨架的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)和作为功能性单体的丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)与丙烯酰氨基二羧甲基-L-赖氨酸水合物(AANTA)构建而成，其中作为骨架的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为粒径150-250nm且均匀分布的微凝胶粒子，微凝胶的结构式为P(NIPAM-co-AAPBA-co-AANTA)，该微凝胶粒子在室温下为球形。
所述可提高酶热稳定性的高分子微凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)合成丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)功能性单体
将8.22g氨基苯硼酸(APBA)溶于120mL、浓度为2N的氢氧化钠溶液中，在冰浴中保持30min，然后缓慢滴入6mL丙烯酰氯，将溶液在冰水浴中保温体物质用水洗三次，得到AAPBA产物，将产物在真空中干燥得到最终的AAPBA产物；
2)合成丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)功能性单体
①合成苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)
将6g苄氧羰基-H-赖氨酸(CBZ-lys)和5.96g溴乙酸分别溶于40mL和21.5mL浓度为2N的氢氧化钠溶液中，分别得到CBZ-lys溶液和溴乙酸溶液，然后在冰水浴条件下将CBZ-lys溶液缓慢滴入溴乙酸溶液中，在70℃下反应4h，得到混合液，在室温下将20mL、浓度为2N的盐酸溶液缓慢滴入上述混合液中，过滤得到CBZ-NTA的粗产物，将粗产物在真空条件下干燥得到白色固体苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)；
②利用CBZ-NTA来合成二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)
在冰浴条件下，将2g CBZ-NTA和0.2g钯炭分别加入到50mL甲醇中，在真空度为1.01kPa的条件下通入一个大气压的氢气，保持气压稳定条件下在25℃水浴中搅拌反应10小时，过滤得到滤渣，将滤渣用蒸馏水清洗10次后收集滤液并将其真空旋干得到产物二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)；
③利用二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)来合成丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)
将1g NTA溶于5mL浓度为2N的氢氧化钠溶液中得到二羧甲基-L-赖氨酸溶液，将9.6mL丙烯酰氯溶于10mL的二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，在冰水浴条件下在二羧甲基-L-赖氨酸溶液中缓慢滴入丙烯酰氯溶液得到混合溶液，搅拌反应4h，用浓度为2N的盐酸溶液将混合溶液调至pH为5后旋干，然后分别用30mL的无水甲醇清洗三次，收集清洗液，最后将甲醇旋干得到AANTA产物；
3)微凝胶溶液的制备
将0.34g N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、0.063g丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)、0.158g丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)和0.008g N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于100mL水中并混合均匀，过滤除去不溶杂质，然后通入氮气0.5h来排空水溶液中的氧气，将过滤后的溶液在70℃下反应1h后加入0.017g过硫酸铵(APS)进行反应8小时，得到微凝胶溶液；
4)将上述微凝胶溶液用超纯水稀释5倍得到稀释的微凝胶溶液；
5)将上述稀释的微凝胶溶液用超纯水进行透析一周，透析完成后取出再加超纯水至微凝胶溶液浓度为0.5mg/mL，制得高分子微凝胶溶液。
图1为得到的微凝胶的透射电镜照片，图中表明微凝胶粒子的粒径在150-250nm且均匀分布。
将制备的可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶用于提高胰岛素的负载效率，方法如下：
1)将微凝胶加入缓冲溶液中制得微凝胶缓冲溶液，所述缓冲溶液为10mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液溶液；
2)将胰岛素与异硫氰酸荧光素(FITC)在0℃条件下混合搅拌均匀，胰岛素与异硫氰酸荧光素的摩尔比为1:1，然后振荡12个小时，得到异硫氰酸荧光素标记的胰岛素；
3)将微凝胶溶液负载FITC胰岛素，首先将制备的微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素混合均匀，微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素溶液的摩尔比为1:1，透析除去未反应的胰岛素，在荧光激发波长为498nm处测定荧光值，然后计算微凝胶里FITC胰岛素的负载效率。然后将微凝胶溶液与0.075mg/mL锌离子溶液螯合搅拌一夜并透析一天后得到螯合了锌离子的微凝胶溶液，将得到的螯合了锌离子的微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素混合均匀，微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素溶液的摩尔比为1:1，透析除去未反应的胰岛素，对其进行荧光吸收值的测试，在荧光激发波长为498nm处测定荧光值，然后计算螯合了锌离子的微凝胶溶液里FITC胰岛素的负载效率。将其与未负载锌离子的微凝胶溶液比较负载效率。
将制备的可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶进行葡萄糖响应性测试，方法如下：
1)将微凝胶溶液与PBS 7.4缓冲溶液混合，将其与茜素红S(ARS)反应并搅拌30min，然后将葡萄糖溶液加入微凝胶混合溶液中作用，将得到的最终混合溶液用紫外去测定紫外吸收值，葡萄糖溶液的浓度分别从5到20g/L，在整个过程中监控溶液的紫外吸收值。
2)然后进行微凝胶糖响应开关实验测定，首先将螯合了锌离子的微凝胶与胰岛素溶液混合，得到负载了胰岛素的微凝胶溶液，随后将微凝胶溶液放入PBS缓冲溶液中半小时，测定缓冲溶液中胰岛素的含量，然后将微凝胶溶液放入葡萄糖溶液中半小时，测定缓冲溶液中胰岛素的含量，重复多次后得到微凝胶的糖响应开关实验的曲线。
图2为微凝胶的葡萄糖响应开关实验的曲线，图中表明：在葡萄糖存在的条件下，负载了胰岛素的微凝胶可快速释放胰岛素，而在没有葡萄糖存在的条件下，负载了胰岛素的微凝胶释放胰岛素较慢。
Claims (3)
1.一种可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶，其特征在于：由作为骨架的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)和作为功能性单体的丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)与丙烯酰氨基二羧甲基-L-赖氨酸水合物(AANTA)构建而成，其中作为骨架的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为粒径150-250nm且均匀分布的微凝胶粒子，微凝胶的结构式为P(NIPAM-co-AAPBA-co-AANTA)，该微凝胶粒子在室温下为球形；
所述的丙烯酰氨基二羧甲基-L-赖氨酸水合物(AANTA)采用如下方法制备而成：
①合成苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)
将苄氧羰基-H-赖氨酸(CBZ-lys)和溴乙酸分别溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中，苄氧羰基-H-赖氨酸与氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液的用量比为6g：40mL，溴乙酸与氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液的用量比为5.96g：21.5mL，分别得到CBZ-lys溶液和溴乙酸溶液，然后在冰水浴条件下将CBZ-lys溶液缓慢滴入溴乙酸溶液中，在70℃下反应4h，得到混合液，在室温下将浓度为2N的盐酸溶液缓慢滴入上述混合液中，苄氧羰基-H-赖氨酸、溴乙酸与盐酸溶液的用量比为6g：5.96：20mL，过滤得到CBZ-NTA的粗产物，将粗产物在真空条件下干燥得到白色固体苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)；
②利用苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)合成二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)
在冰浴条件下，将CBZ-NTA和钯炭分别加入到50mL甲醇中，CBZ-NTA与甲醇的用量比为2g：50mL，钯炭与甲醇的用量比为0.2g：50mL，将上述反应物加入烧瓶中，对烧瓶进行抽真空操作，在烧瓶内气压为1.01kPa的条件下向烧瓶内通入一个大气压的氢气，保持气压稳定条件下在25℃水浴中搅拌反应10小时，过滤得到滤渣，将滤渣用蒸馏水清洗10次后收集滤液并将其真空旋干得到产物二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)；
③利用二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)来合成丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)
将NTA溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中得到二羧甲基-L-赖氨酸溶液，NTA与氢氧化钠溶液的用量比为1g：5mL，将丙烯酰氯溶于二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，丙烯酰氯与二氯甲烷的用量比为9.6mL：10mL，在冰水浴条件下在二羧甲基-L-赖氨酸溶液中缓慢滴入丙烯酰氯溶液得到混合溶液，混合溶液中NTA与丙烯酰氯的用量比为1g：9.6mL，搅拌反应4h，用浓度为2N的盐酸溶液将混合溶液调至pH为5后旋干，然后分别用30mL的无水甲醇清洗三次，收集清洗液，最后将甲醇旋干得到AANTA产物。
2.一种如权利要求1所述可提高酶热稳定性的高分子微凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)合成丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)功能性单体
将氨基苯硼酸(APBA)溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中，在冰浴中保持30min，然后缓慢滴入丙烯酰氯，氨基苯硼酸、氢氧化钠溶与丙烯酰氯的用量比为8.22g：120mL：6mL，将溶液在冰水浴中保温1.5h，然后把浓度为2N的盐酸溶液加入到体系中得到固体物质，将固体物质分离后用水洗三次，得到AAPBA产物，将产物在真空中干燥得到最终的AAPBA产物；
2)合成丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)功能性单体
①合成苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)
将苄氧羰基-H-赖氨酸(CBZ-lys)和溴乙酸分别溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中，苄氧羰基-H-赖氨酸与氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液的用量比为6g：40mL，溴乙酸与氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液的用量比为5.96g：21.5mL，分别得到CBZ-lys溶液和溴乙酸溶液，然后在冰水浴条件下将CBZ-lys溶液缓慢滴入溴乙酸溶液中，在70℃下反应4h，得到混合液，在室温下将浓度为2N的盐酸溶液缓慢滴入上述混合液中，苄氧羰基-H-赖氨酸、溴乙酸与盐酸溶液的用量比为6g：5.96：20mL，过滤得到CBZ-NTA的粗产物，将粗产物在真空条件下干燥得到白色固体苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)；
②利用苄氧羰基-H-二羧甲基-L-赖氨酸(CBZ-NTA)合成二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)
在冰浴条件下，将CBZ-NTA和钯炭分别加入到50mL甲醇中，CBZ-NTA与甲醇的用量比为2g：50mL，钯炭与甲醇的用量比为0.2g：50mL，将上述反应物加入烧瓶中，对烧瓶进行抽真空操作，在烧瓶内气压为1.01kPa的条件下向烧瓶内通入一个大气压的氢气，保持气压稳定条件下在25℃水浴中搅拌反应10小时，过滤得到滤渣，将滤渣用蒸馏水清洗10次后收集滤液并将其真空旋干得到产物二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)；
③利用二羧甲基-L-赖氨酸(NTA)来合成丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)
将NTA溶于浓度为2N的氢氧化钠溶液中得到二羧甲基-L-赖氨酸溶液，NTA与氢氧化钠溶液的用量比为1g：5mL，将丙烯酰氯溶于二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，丙烯酰氯与二氯甲烷的用量比为9.6mL：10mL，在冰水浴条件下在二羧甲基-L-赖氨酸溶液中缓慢滴入丙烯酰氯溶液得到混合溶液，混合溶液中NTA与丙烯酰氯的用量比为1g：9.6mL，搅拌反应4h，用浓度为2N的盐酸溶液将混合溶液调至pH为5后旋干，然后分别用30mL的无水甲醇清洗三次，收集清洗液，最后将甲醇旋干得到AANTA产物；
3)微凝胶溶液的制备
将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)、丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)和N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于水中并混合均匀，过滤除去不溶杂质，然后通入氮气0.5h来排空水溶液中的氧气，将过滤后的溶液在70℃下反应1h后加入过硫酸铵(APS)进行反应8小时，得到微凝胶溶液，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)、丙烯酰二羧甲基-L-赖氨酸(AANTA)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)水与过硫酸铵(APS)的用量比为0.34g：0.063g：0.158g：0.008g：100mL：0.017g；
4)将上述微凝胶溶液用超纯水稀释5倍得到稀释的微凝胶溶液；
5)将上述稀释的微凝胶溶液用超纯水进行透析至少一周时间，透析完成后取出再加超纯水至微凝胶溶液浓度为0.5mg/mL，制得高分子微凝胶溶液。
3.一种如权利要求1所述可提高胰岛素负载效率的高分子微凝胶的应用，其特征在于用于提高提高胰岛素的负载效率，方法如下：
1)将微凝胶加入缓冲溶液中制得微凝胶缓冲溶液，所述缓冲溶液为10mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液溶液；
2)将胰岛素与异硫氰酸荧光素(FITC)在0℃条件下混合搅拌均匀，胰岛素与异硫氰酸荧光素的摩尔比为1:1，然后振荡12个小时，得到异硫氰酸荧光素标记的胰岛素；
3)将制备的微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素混合均匀，微凝胶缓冲溶液与异硫氰酸荧光素标记的胰岛素溶液的摩尔比为1:1，透析除去未反应的胰岛素，在荧光激发波长为498nm处测定荧光值。
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