CN105675705B - 测定氨基酸在土壤中移动规律的装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种测定氨基酸在土壤中移动规律的装置，由培养箱、紫外灭菌灯、直流电源、石墨片、塑料盆、加热丝、温度探头、土体箱、注射器、过滤器组成；所有部件均放置于培养箱中。本发明将直流电源与四片石墨片相连，可提供220‑360V电压，控制塑料盆中土壤样品的温度为70‑90℃，土体箱一侧中部连接注射器，注射器的容积为1‑5ml，过滤器内含0.22微米醋酸纤维滤膜。通过向已灭菌土壤中添加15N标记的氨基酸溶液，经扇状采样后测定同位素丰度，就可以计算氨基酸的迁移速率。本发明装置设计合理，制作简便成本低，操作简单，准确度高，有利于准确测定氨基酸在土壤中的迁移转化规律。
Description
技术领域
本发明属于植物营养和土壤科学研究领域，涉及一种测定氨基酸在土壤中移动规律的装置及方法。
背景技术
随着分析技术及植物营养的快速发展，植物能够直接吸收分子态氨基酸已成为共识，氨基酸可以作为植物生长的重要氮源，而无需经过微生物分解为无机氮后再作为植物生长的重要氮源。土壤中包含丰富的氨基酸，且其对植物生长和作物品质具有重要的作用，因此研究土壤中氨基酸的形态、浓度、迁移转化规律对充分利用土壤氨基酸资源，提高作物品质具有重要的意义。
然而，土壤中氨基酸在自然状态下会被土壤微生物迅速分解，蛋白质也会源源不断的分解为氨基酸，氨基酸的迅速周转成为研究氨基酸迁移的最重要的限制因子。土壤完全灭菌可以有效避免微生物的影响，然而现有的土壤完全灭菌方法均存在较大的弊端。采用化学药剂是常用的灭菌方法，多采用甲醛、1,3氯乙烯等有毒有害的化学试剂，这些药剂会在土壤中残留，对后续研究及实验人员健康造成威胁。高温灭菌法多采用121℃高温高压灭菌，然而这么高的温度下土壤结构发生变化，土壤化学组成也会相应变化，对试验结果造成影响。γ射线灭菌法根据γ射线能量高、穿透力强的特点，以杀死土壤微生物，该方法是较为理想的方法，然而其操作上存在很大的安全隐患，且成本较高，很难普及使用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种测定氨基酸在土壤中移动规律的装置，本发明提供的装置由培养箱、紫外灭菌灯、直流电源、石墨片、塑料盆、加热丝、温度探头、土体箱、注射器、过滤器组成；所有部件均放置于培养箱中，紫外灭菌灯位于培养箱顶部，直流电源与四片石墨片相连，其中两片连于正极，两片连于负极，石墨片位于塑料盆两端，加热丝均匀分布于塑料盆中，塑料盆内还均匀分布个四个温度探头，塑料盆中放置待测土壤样品；土体箱一侧中部连接注射器，过滤器与注射器相连；直流电源提供220-360V可调节电压，石墨片的长度、宽度、厚度分别为15、10、0.2cm，塑料盆为聚乙烯材质，加热丝为绝缘加热，通过温度探头控制塑料盆中土壤样品的温度为70-90℃，注射器的容积为1-5ml，过滤器内含0.22微米醋酸纤维滤膜。
本发明的另一个目的是提供测定氨基酸在土壤中移动规律的方法，通过以下步骤实现：
(1)先将自然风干后过2mm筛的土壤平铺于塑料盆中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯、直流电源、加热丝、温度探头，控制直流电源电压为220-360V，塑料盆中土壤温度为70-90℃，开启此装置12-48h后，关闭紫外灭菌灯、直流电源、加热丝、温度探头；
(2)待塑料盆中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20-40％,将混匀后的土壤添加到土体箱中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器向土体中添加1-5ml浓度为0.01-0.1mM，15N标记丰度为99.8％的氨基酸溶液，打开紫外灭菌灯；
(3)土体静置24-96h后，按照离注射器添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
本发明通过直流电击配合70-90℃高温，从而达到杀灭土壤微生物的效果。该装置对土壤的扰动较小，对土壤中各物质形态的影响较小，且杀菌效率较高，成本低廉。向已灭菌的土壤中添加一定浓度同位素标记的氨基酸，在完全无菌环境下培养一段时间后，根据扇形取样法破坏性采样，测定土壤中同位素丰度，就可以计算土壤氨基酸的迁移速率。本发明装置设计合理，制作简便成本低，操作简单，准确度高，利用同位素示踪技术能够有效地提高检测的精度。
附图说明
图1是本发明装置结构示意图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
参见图1，测定氨基酸在土壤中移动规律的装置由培养箱1、紫外灭菌灯2、直流电源3、石墨片4、塑料盆5、加热丝6、温度探头7、土体箱8、注射器9、过滤器10组成；所有部件均放置于培养箱1中，紫外灭菌灯2位于培养箱1上部，直流电源3与四片石墨片4相连，其中两片连于正极，两片连于负极，石墨片4位于塑料盆5两端，加热丝6均匀分布于塑料盆5中，塑料盆5内还均匀分布个四个温度探头7，塑料盆5中放置待测土壤样品；土体箱8一侧中部连接注射器9，过滤器10与注射器9相连；直流电源3提供220-360V可调节电压，石墨片4的长度、宽度、厚度分别为15、10、0.2cm，塑料盆5为聚乙烯材质，加热丝6绝缘加热，通过温度探头7控制塑料盆5中土壤样品的温度为70-90℃，注射器9的容积为1-5ml，过滤器10内含0.22微米醋酸纤维滤膜。
使用该装置测定氨基酸在土壤中移动规律的方法：
(1)先将自然风干后过2mm筛的土壤平铺于塑料盆5中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7，控制直流电源电压为220-360V，塑料盆5中土壤温度为70-90℃，开启此装置12-48h后，关闭紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7；
(2)待塑料盆5中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20-40％,将混匀后的土壤添加到土体箱8中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器9向土体中添加1-5ml浓度为0.01-0.1mM，15N标记丰度为99.8％的氨基酸溶液，打开紫外灭菌灯2；
(3)土体静置24-96h后，按照离注射器9添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器9添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器9添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器9添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
实施例2
(1)先将自然风干后的浙江大学紫金港西区湿地土壤过2mm筛的土壤平铺于塑料盆5中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7，控制直流电源电压为220V，塑料盆5中土壤温度为70℃，开启此装置24h后，关闭紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7；
(2)待塑料盆5中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20％,将混匀后的土壤添加到土体箱8中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器9向土体中添加1ml浓度为0.05mM，15N标记丰度为99.8％的甘氨酸溶液，打开紫外灭菌灯2；
(3)土体静置96h后，按照离注射器9添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器9添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器9添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器9添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
实施例3
(1)先将自然风干后的浙江大学紫金港西区湿地土壤过2mm筛的土壤平铺于塑料盆5中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7，控制直流电源电压为220V，塑料盆5中土壤温度为70℃，开启此装置24h后，关闭紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7；
(2)待塑料盆5中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20％,将混匀后的土壤添加到土体箱8中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器9向土体中添加1ml浓度为0.05mM，15N标记丰度为99.8％的赖氨酸溶液，打开紫外灭菌灯2；
(3)土体静置96h后，按照离注射器9添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器9添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器9添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器9添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
实施例4
(1)先将自然风干后的浙江大学紫金港西区湿地土壤过2mm筛的土壤平铺于塑料盆5中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7，控制直流电源电压为220V，塑料盆5中土壤温度为70℃，开启此装置24h后，关闭紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7；
(2)待塑料盆5中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20％,将混匀后的土壤添加到土体箱8中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器9向土体中添加1ml浓度为0.05mM，15N标记丰度为99.8％的谷氨酸溶液，打开紫外灭菌灯2；
(3)土体静置96h后，按照离注射器9添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器9添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器9添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器9添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
实施例5
(1)先将自然风干后的仙居高山土壤过2mm筛的土壤平铺于塑料盆5中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7，控制直流电源电压为360V，塑料盆5中土壤温度为80℃，开启此装置24h后，关闭紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7；
(2)待塑料盆5中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20％,将混匀后的土壤添加到土体箱8中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器9向土体中添加2ml浓度为0.05mM，15N标记丰度为99.8％的甘氨酸溶液，打开紫外灭菌灯2；
(3)土体静置96h后，按照离注射器9添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器9添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器9添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器9添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
实施例6
(1)先将自然风干后的仙居高山土壤过2mm筛的土壤平铺于塑料盆5中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7，控制直流电源电压为360V，塑料盆5中土壤温度为80℃，开启此装置24h后，关闭紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7；
(2)待塑料盆5中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20％,将混匀后的土壤添加到土体箱8中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器9向土体中添加2ml浓度为0.05mM，15N标记丰度为99.8％的赖氨酸溶液，打开紫外灭菌灯2；
(3)土体静置96h后，按照离注射器9添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器9添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器9添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器9添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
实施例7
(1)先将自然风干后的仙居高山土壤过2mm筛的土壤平铺于塑料盆5中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7，控制直流电源电压为360V，塑料盆5中土壤温度为80℃，开启此装置24h后，关闭紫外灭菌灯2、直流电源3、加热丝6、温度探头7；
(2)待塑料盆5中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20％,将混匀后的土壤添加到土体箱8中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器9向土体中添加2ml浓度为0.05mM，15N标记丰度为99.8％的谷氨酸溶液，打开紫外灭菌灯2；
(3)土体静置96h后，按照离注射器9添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器9添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器9添加溶液位置水平的取样点则能够表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器9添加溶液位置正下方的取样点则能够表示氨基酸的纵向迁移速率。
表1：不同氨基酸在不同土壤中的迁移速率
从表1可以看出，氨基酸在不同土壤中的迁移速率存在明显的差异，不同氨基酸在同一土壤中的迁移速率也存在明显的差异，且横向和纵向的迁移速率也存在显著的差异。在紫金港湿地和仙居土壤中，该装置已对土壤完全灭菌，保证了研究迁移速率的准确性。在紫金港湿地土壤中，谷氨酸的迁移速率大于甘氨酸的迁移速率，甘氨酸的迁移速率高于赖氨酸的迁移速率，在仙居高山土壤中也呈现了相似的规律。根据氨基酸性质分析，谷氨酸属于带负电荷氨基酸，而土壤团粒也带有负电荷，电荷想斥从而加快了谷氨酸的移动，而赖氨酸属于带正电荷氨基酸，相互吸引，其移动速率减慢。仙居高山土壤质地疏松，所以三种氨基酸的迁移速率较之紫金港湿地土壤较高。此结果表明，该方法能够有效地测定氨基酸在土壤中的迁移速率。
Claims (4)
1.一种利用 装置测定氨基酸在土壤中移动规律的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）先将自然风干后过2mm筛的土壤平铺于塑料盆（5）中，加纯净水至土壤表面存留少量水分，打开紫外灭菌灯（2）、直流电源（3）、加热丝（6）、温度探头（7），控制直流电源电压为220-360V，塑料盆（5）中土壤温度为70-90℃，开启此装置12-48h后，关闭紫外灭菌灯（2）、直流电源（3）、加热丝（6）、温度探头（7）；
（2）待塑料盆（5）中土壤温度降低后，在无菌操作台上多次混匀，控制土壤含水量为20-40%,将混匀后的土壤添加到土体箱（8）中，轻微震动以紧实土壤，通过注射器（9）向土体中添加1-5ml浓度为0.01-0.1mM，15N标记丰度为99.8%的氨基酸溶液，打开紫外灭菌灯（2）；
（3）土体静置24-96h后，按照离注射器（9）添加溶液位置相同距离的扇形取样方法，采集土壤样品，采用同位素质谱检测土壤中同位素丰度，采样点与注射器（9）添加溶液位置应根据土壤情况及氨基酸类型而定，与注射器（9）添加溶液位置水平的取样点表示氨基酸横向的迁移速率，位于注射器（9）添加溶液位置正下方的取样点表示氨基酸的纵向迁移速率；
所用装置由培养箱（1）、紫外灭菌灯（2）、直流电源（3）、石墨片（4）、塑料盆（5）、加热丝（6）、温度探头（7）、土体箱（8）、注射器（9）、过滤器（10）组成，所有部件均放置于培养箱（1）中，紫外灭菌灯（2）位于培养箱（1）顶部，直流电源（3）与四片石墨片（4）相连，其中两片连于正极，两片连于负极，石墨片（4）位于塑料盆（5）两端，加热丝（6）均匀分布于塑料盆（5）中，塑料盆（5）内还均匀分布个四个温度探头（7），土体箱（8）一侧中部连接注射器（9），过滤器（10）与注射器（9）相连。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，直流电源（3）提供220-360V可调节电压，石墨片（4）的长度、宽度、厚度分别为15、10、0.2cm，塑料盆（5）为聚乙烯材质，注射器（9）的容积为1-5ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，过滤器（10）内含0.22微米醋酸纤维滤膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加热丝（6）绝缘加热，通过温度探头（7）控制塑料盆（5）中土壤样品的温度为70-90℃。
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