CN105671052B - 高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法。狗牙根的遗传转化非常困难，严重制约了其基因功能研究和分子育种工作的开展。本发明公开的新方法利用农杆菌介导的水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体特异性地下调狗牙根内源基因的表达，为研究狗牙根的基因功能提供了高效快捷的技术手段。所述方法包括以下步骤：1）狗牙根目的基因片段的克隆；2）病毒诱导基因沉默载体的构建；3）农杆菌浸染狗牙根植株；4）基因表达丰度的分子检测。使用本方法可以成功使狗牙根内源基因的表达降低50%以上。

Description

高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法
技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导的病毒诱导基因沉默技术用于高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法，属于基因工程和生物技术领域。
背景技术
狗牙根（Cynodon dactylon（L.）Pers.）是禾本科虎尾草亚科狗牙根属植物，是一种重要的暖季型草坪草、牧草及水土保持植物，具有耐旱、耐盐、耐践踏、病虫害少、生长快、草层厚等诸多优点，广泛用于暖温带、亚热带及热带的运动场草坪、公园和道路绿化带、河道和山坡等护坡草坪和放牧草地建设，在草坪和牧草生产中具有十分重要的地位。
对狗牙根抗逆、发育相关重要基因的功能进行深入研究能够为基因工程育种和分子辅助育种提供重要的候选基因和理论依据。然而目前所建立的农杆菌浸染和基因枪轰击介导的狗牙根遗传转化方法均步骤繁琐且效率低下，严重阻碍了在狗牙根植物体内进行相关基因功能的验证。病毒诱导的基因沉默技术利用病毒感染植物后植物对病毒RNA序列进行特异性识别和降解的机制，将目标基因序列融入病毒序列中，使感染重组病毒的植物体内目标基因mRNA也被识别和降解，是一种高效抑制基因表达的技术方法。目前已有多个病毒诱导基因沉默载体得到构建，成功用于烟草、番茄、棉花、拟南芥、水稻、二穗短柄草等植物的基因沉默实验。然而截至目前，仍未有狗牙根病毒诱导基因沉默技术的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法，通过如下技术方案实现。
（1）狗牙根目的基因片段的克隆。
在已知狗牙根目的基因序列情况下，设计PCR扩增目的基因片段的上下游引物，设计原则保证PCR扩增产物长度大于100bp，同时在上下游引物5’端分别添加限制性内切酶MluI和PacI的识别碱基序列ACGCGT和TTAATTAA。提取狗牙根RNA，逆转录成cDNA，使用高保真酶PCR扩增获得目的基因片段。电泳、切胶回收预期大小的PCR产物，连接平末端PCR产物克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布抗性平板，挑取克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性克隆后，测序确认PCR产物的正确性。
在狗牙根目的基因序列未知情况下，可以根据目的基因在其它物种的同源基因序列设计简并引物先从狗牙根cDNA中PCR扩增获得部分基因序列，测序确认序列正确性后遵照上述方法获得目的基因片段。
（2）病毒诱导基因沉默载体的构建。
提取上述测序验证的含有狗牙根目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体pRTBV-MVIGS质粒，使用MluI和PacI两个限制性内切酶于37℃酶切8小时；电泳、切胶回收目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将摩尔比为3：1的目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃8小时；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物RTBV-F（序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA）和RTBV-R（序列：AGGCTGGAGGCATAAACGC）进行菌落PCR，对克隆进行鉴定。
（3）农杆菌浸染狗牙根植株。
将连接狗牙根目的基因片段的pRTBV-MVIGS质粒转化农杆菌EHA105，涂布卡那霉素和利福平双重抗性平板，挑取克隆，使用RTBV-F和RTBV-R引物进行菌落PCR检测。将PCR鉴定阳性克隆按1：100比例扩大培养于含卡那霉素和利福平的LB培养基，28℃培养过夜至OD600约为3。将培养液倒入离心管，4000 g、4℃离心10分钟收集菌体。用浸染缓冲液（10 mM吗啉乙磺酸，10 mM氯化镁，5 mM氯化钙，300 mM乙酰丁香酮，pH 5.6）重悬菌体，使OD600达到1.5，倒入烧杯中，室温静置3小时。将光照16小时/黑暗8小时、28℃条件下培养7天的狗牙根幼苗从Hoagland培养基中取出，用清水洗去培养基，转移至含有农杆菌浸染液的烧杯中，用滤网盖住狗牙根幼苗使其浸没于液面下。将烧杯放入连有真空泵的真空室中，抽真空5分钟后，将幼苗取出，用清水洗去粘附的浸染液，重新转移至Hoagland培养基中，于光照16小时/黑暗8小时、28℃条件继续培养21天。将含农杆菌的浸染废液用高温蒸汽灭菌后再予以丢弃。
（4）基因表达丰度的分子检测。
将未浸染的培养28天的狗牙根植株以及浸染后继续培养21天的狗牙根植株从Hoagland培养基中取出，剪下其叶片，提取其RNA，逆转录成cDNA。设计检测目的基因表达的PCR引物，避开第（1）步中PCR扩增目的基因区段，使用实时定量PCR获得目的基因在对照植株和浸染病变植株的Ct值。同时使用狗牙根内参基因肌动蛋白（actin）的检测引物对内参基因actin在对照植株和浸染病变植株的表达量进行分析，获得响应的Ct值，用2–ΔΔCt算法计算获得目的基因在对照植株和浸染病变植株中相比actin基因的相对表达量。
本发明的技术优势及有益效果在于。
（1）相比花费昂贵的基因枪轰击法以及耗时长且步骤繁琐的农杆菌介导的愈伤组织转化方法，本发明所提供的方法能够在4周内高效的将狗牙根内源基因的表达进行沉默，通过观察基因沉默植株相比对照植株的表型，可以快速地分析表达被沉默基因的功能。
（2）相比已知的农杆菌介导的病毒诱导基因沉默方法，本发明所提供的方法使用真空泵辅助农杆菌浸染狗牙根叶片，相比注射器直接注射叶片提高了农杆菌浸染效率。在浸染液配方中，本发明提供的方法新加入了5 mM的氯化钙，也极大的提高了浸染效率。
（3）与狗牙根cDNA文库相结合，使用本发明所提供的方法可以快速高通量地筛选与抗逆性和生长发育相关的未知狗牙根基因，为分子标记辅助育种和基因工程育种提供大量的候选基因。
附图说明
图1为狗牙根两个品种八氢番茄红素脱氢酶基因表达被抑制的表型照片。
图2为狗牙根两个品种八氢番茄红素脱氢酶基因表达被抑制的定量PCR检测结果。
具体实施方式
下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1 狗牙根八氢番茄红素脱氢酶基因沉默导致植株叶片白化。
国审狗牙根品种‘阳江’狗牙根和美国进口品种‘common’狗牙根：江苏省中国科学院植物研究所草业研究中心。pRTBV-MVIGS质粒：印度德里大学南方校区植物分子生物学系（参考文献：Purkayastha A, Mathur S, Verma V, Sharma S, Dasgupta I. Virus-induced gene silencing in rice using a vector derived from a DNA virus.Planta, 2010, 232: 1531-1540）。大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105：江苏省中国科学院植物研究所草业研究中心。
一、狗牙根八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoene desaturase,PDS）的克隆。
使用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep植物总RNA提取试剂盒提取‘阳江’狗牙根叶片的总RNA，操作步骤按试剂盒自带说明书进行。使用宝生物（大连）有限公司的逆转录试剂盒将狗牙根总RNA逆转录为cDNA，操作步骤按试剂盒自带说明书进行。
根据NCBI已登录的植物PDS基因的核苷酸序列设计扩增狗牙根PDS基因的简并引物PDS-F-290/PDS-R-980，如表1所示，PCR扩增获得狗牙根PDS基因中间区段。电泳，切胶回收PCR产物，连接全式金（北京）生物技术有限公司的pEASY-Blunt Simple载体，得到连接产物，转入大肠杆菌DH5α中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序。
表1. 引物列表
采用RACE PCR的方法获取狗牙根全长PDS基因序列，具体步骤如下：
1、根据测序获得的狗牙根PDS基因的中间区段核苷酸序列设计扩增狗牙根PDS基因全长的巢式PCR引物5’-PDS-1/5’-PDS-2和3’-PDS-1/3’-PDS-2以及接头引物adaptor-oligodT、adaptor-1和adaptor-2，如表1所示；
2、3’RACE使用接头引物adaptor-oligodT进行拟转录，使用宝生物（大连）有限公司的逆转录试剂盒按试剂盒自带说明书进行。5’RACE先使用基因特异性引物5’-PDS-1进行逆转录，反应条件同上，接下来加入2µL 10×buffer，1µL dATP和1µL末端脱氧核苷酸转移酶 [宝生物（大连）有限公司] 在cDNA 5’末端加上PolyA序列；
3、以上述逆转录产物为模板，使用adaptor-1和3’-PDS-1、adaptor-2和3’-PDS-2为引物进行巢式PCR 扩增获取3’cDNA端序列，以加接头后的逆转录产物为模板，使用adaptor-oligodT、adaptor-1和5’-PDS-1、adaptor-2和5’-PDS-2为引物进行巢式PCR扩增获取5’cDNA端序列；
4、电泳，切胶回收PCR产物，连接pEASY-Blunt Simple载体，得到连接产物，转入大肠杆菌DH5α中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序；
5、将两个序列的测序结果和中间区段序列进行拼接，获得狗牙根PDS基因开放阅读框。开放阅读框编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为CdPDS蛋白（由562个氨基酸残基组成），为狗牙根中首次克隆获得的八氢番茄红素脱氢酶基因。将编码CdPDS蛋白的基因命名为CdPDS基因，其cDNA全长序列（包括5’和3’UTR区）如序列表的序列2所示，编码区为序列表中序列2自5’末端第69-1757位核苷酸。
二、狗牙根CdPDS基因用于沉默实验片段的克隆。
设计扩增狗牙根CdPDS基因编码区456-875核苷酸区段的简并引物PDS-VIGS-F/PDS-VIGS-R，如表1所示，在上下游引物5’端分别加上限制性内切酶MluI和PacI的识别碱基序列ACGCGT和TTAATTAA。以上述逆转录获得的狗牙根cDNA为模板，PCR扩增获得长为420bp的用于沉默实验的CdPDS基因片段。
电泳，切胶回收PCR产物，连接pEASY-Blunt Simple载体，得到连接产物，转入大肠杆菌DH5α中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序。
三、病毒诱导基因沉默载体的构建。
提取上述测序验证的含有CdPDS基因片段的pEASY-Blunt Simple载体质粒和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体pRTBV-MVIGS质粒，使用MluI和PacI两个限制性内切酶于37℃酶切8小时。
电泳、切胶回收大小为420bp的CdPDS基因片段和pRTBV-MVIGS载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将摩尔比为3：1的CdPDS基因片段和pRTBV-MVIGS载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃8小时。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物RTBV-F（序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA）和RTBV-R（序列：AGGCTGGAGGCATAAACGC）进行菌落PCR鉴定。
四、农杆菌浸染狗牙根植株。
将连接CdPDS基因片段的pRTBV-MVIGS-CdPDS质粒和未连接基因片段的空载体pRTBV-MVIGS转化农杆菌EHA105，涂布卡那霉素和利福平双重抗性平板，挑取克隆，使用RTBV-F和RTBV-R引物进行菌落PCR检测。
将PCR鉴定阳性克隆按1：100比例扩大培养于含卡那霉素和利福平的LB培养基，28℃培养过夜至OD600约为3。将培养液倒入离心管，4000 g、4℃离心10分钟收集菌体。用浸染缓冲液（10 mM吗啉乙磺酸，10 mM氯化镁，5 mM氯化钙，300 mM乙酰丁香酮，pH 5.6）重悬菌体，使OD600达到1.5，倒入烧杯中，室温静置3小时。
将光照16小时/黑暗8小时、28℃条件下培养7天的狗牙根幼苗从Hoagland培养基中取出，用清水洗去培养基，转移至含有农杆菌浸染液的烧杯中，用滤网盖住狗牙根幼苗使其浸没于液面下。将烧杯放入连有真空泵的真空室中，抽真空5分钟。
抽真空后，将幼苗取出，用清水洗去粘附的浸染液，重新转移至Hoagland培养基中，于光照16小时/黑暗8小时、28℃条件继续培养21天后可以看到pRTBV-MVIGS-CdPDS转化农杆菌浸染两个品种狗牙根植株叶片均出现白化现象，提示PDS基因表达得到成功抑制，结果如图1所示。
将含农杆菌的浸染废液用高温蒸汽灭菌后予以丢弃。
五、CdPDS基因表达丰度的分子检测。
将未浸染的培养28天的狗牙根植株以及pRTBV-MVIGS-CdPDS和空载体pRTBV-MVIGS转化农杆菌浸染后继续培养21天的狗牙根植株从Hoagland培养基中取出，剪下其叶片，使用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep植物总RNA提取试剂盒提取其RNA，使用宝生物（大连）有限公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。
设计检测CdPDS基因表达的PCR引物CdPDS-q-F/CdPDS-q-R，避开PCR扩增狗牙根CdPDS基因编码区456-875核苷酸区段。使用qTOWER 2.2（德国耶拿分析仪器股份公司）定量PCR仪分析获得CdPDS基因在对照植株和叶片白化病变植株叶片的Ct值，反应体系为：10µL2×SYBR Premix ExTaq[宝生物（大连）有限公司]，1µL cDNA，1µLCdPDS-q-F引物，1µLCdPDS-q-R引物，7µL ddH2O，反应参数为：94℃5分钟，94℃30秒、68℃30秒、38个循环，68℃5分钟。
同时使用狗牙根内参基因肌动蛋白（actin）的检测引物CdACT1-q-F和CdACT1-q-R对内参基因CdACT1在对照植株和叶片白化病变植株的表达量进行分析，获得响应的Ct值，反应体系和参数同上。
用2–ΔΔCt算法计算获得CdPDS基因在对照植株和叶片白化病变植株中相比CdACT1基因的相对表达量，如图2所示，相比未浸染植株和空载体转化农杆菌浸染植株，pRTBV-MVIGS-CdPDS转化农杆菌浸染后叶片白化病变植株中CdPDS基因的表达量显著下降了50%-66%，提示CdPDS基因表达得到高效抑制。
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<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400> 1
Met Asn Ile Thr Gly Ala Asn Gln Ala Arg Phe Phe Gly Gly Gln Leu
1 5 10 15
Pro Thr Gln Lys Cys Phe Ser Ser Gly His His Leu Thr Val Ala Met
20 25 30
Lys Ser Leu Val Leu Arg Asn Lys Gly Lys Arg Leu His Arg Arg Leu
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Lys Pro Ile Leu Leu Glu Ala Arg Asp Val Leu Gly Gly Lys Ile Ala
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Ala Trp Lys Asp Lys Asp Gly Asp Trp Tyr Glu Thr Gly Leu His Ile
130 135 140
Phe Phe Gly Ala Tyr Pro Asn Ile Gln Asn Leu Phe Gly Glu Leu Gly
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Pro Asn Lys Pro Gly Glu Phe Ser Arg Phe Asp Phe Pro Glu Thr Leu
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Pro Ala Pro Leu Asn Gly Ile Trp Ala Ile Leu Arg Asn Asn Glu Met
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Val Lys His Phe Ala Leu Ser Asp Gly Thr Gln Ile Thr Gly Asp Ala
340 345 350
Tyr Val Phe Thr Ala Pro Val Asp Ile Phe Lys Leu Leu Val Pro Gln
355 360 365
Glu Trp Asn Glu Ile Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Glu Lys Leu Val Gly
370 375 380
Val Pro Val Ile Asn Val His Ile Trp Phe Asp Arg Lys Leu Lys Asn
385 390 395 400
Thr Tyr Asp His Leu Leu Phe Ser Arg Ser Ser Leu Leu Ser Val Tyr
405 410 415
Ala Asp Met Ser Val Thr Cys Lys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Arg Ser
420 425 430
Met Leu Glu Leu Val Phe Ala Pro Ala Glu Glu Trp Ile Gly Arg Ser
435 440 445
Asp Ala Asp Ile Ile Asp Ala Thr Met Glu Glu Leu Ala Lys Leu Phe
450 455 460
Pro Asp Glu Ile Ala Ala Asp Gln Ser Lys Ala Lys Ile Leu Lys Tyr
465 470 475 480
His Val Val Lys Thr Pro Arg Ser Val Tyr Lys Thr Val Pro Asn Cys
485 490 495
Glu Pro Cys Arg Pro Leu Gln Arg Ser Pro Ile Glu Gly Phe Tyr Leu
500 505 510
Ala Gly Asp Tyr Thr Lys Gln Lys Tyr Leu Ala Ser Met Glu Gly Ala
515 520 525
Val Leu Ser Gly Lys Leu Cys Ala Gln Ser Ile Val Gln Asp Tyr Asn
530 535 540
Lys Leu Ser Leu Met Ser Gln Lys Arg Leu Gln Phe Glu Val Pro Val
545 550 555 560
Val Ser
<210> 2
<211> 2033
<212> DNA
<213> Cynodon dactylon
<400> 2
atcggttaaa gagtatctga aaacacacta agtgttgatt cagtatggat actggctgcc 60
tgtcatctat gaacatcact ggagctaacc aggcaagatt ttttgggggg cagcttccta 120
ctcaaaaatg cttctcaagt gggcaccatt tgactgttgc catgaaatca cttgtcttgc 180
ggaacaaagg aaaaagatta caccgtagac tcggtgcttt tcaggttgcc tgccaggatt 240
tcccaaggcc tccactggaa agcacgataa actatttgga agcgggacag ctatcttcat 300
tttttcgaag cagtgaacgc cccagtaaac cgttacaggt cgtgattgct ggtgcaggat 360
tggctggtct atcaacagca aagtatttgg cagatgctgg ccataaaccc atactgcttg 420
aagcaagaga tgttttgggt ggaaagatag cagcttggaa ggacaaagat ggagattggt 480
acgagactgg gcttcatatt ttttttggag cttatcccaa catacagaat ttgtttggcg 540
agcttggtat tgaggatcgt ttgcaatgga aggaacactc catgatattt gccatgccga 600
ataagccagg agaattcagc cggtttgact tcccagaaac tttgccagca cctttgaatg 660
gaatatgggc catactgaga aacaatgaaa tgcttacctg gcctgagaag gtgaagtttg 720
ctattggact tttgccagca atggcaggtg gtcaacctta tgtcgaagct caagatggcc 780
taactgtttc agagtggatg aaaaagcagg gtgttcctga tcgagtgaat gatgaagttt 840
ttattgcaat gtccaaggca ctcaatttca taaatcctga tgagttatca atgcagtgca 900
ttttgattgc tttaaaccgg tttcttcagg agaagcatgg ttccaaaatg gctttcttgg 960
atgggaatcc acctgaaagg ctgtgcatgc caattgttga tcacattcgg tctaggggtg 1020
gtgaggtccg cctaaattct cgtataaaaa aaatagagtt gaatcctgac ggaactgtga 1080
aacactttgc acttagcgat ggaactcaaa taactggaga tgcttatgtc tttacggcac 1140
cagttgatat cttcaagctt cttgtacctc aagagtggaa cgaaattact tactttaaga 1200
agctagagaa gttggtggga gttcctgtaa tcaatgttca tatatggttc gacaggaaac 1260
tgaaaaacac atatgaccac ctcctcttca gcaggagttc acttctaagt gtctatgcag 1320
acatgtcagt aacctgcaag gaatactatg acccaaaccg ttcaatgctg gagttggtct 1380
ttgctcctgc tgaggaatgg attggacgaa gtgatgctga tatcattgat gcaactatgg 1440
aagagctggc caagttattt cctgatgaaa ttgcagctga tcagagtaaa gcaaagattc 1500
ttaagtatca tgttgtgaag acaccaagat ctgtttacaa aactgtccca aattgtgaac 1560
cttgccgacc tctccaaaga tcaccaattg aagggttcta tctggcgggt gattacacaa 1620
aacagaaata cttggcttct atggagggcg cagttttatc tggaaaactt tgtgcccagt 1680
ctatagtgca ggattataac aagctatcgc tcatgagtca gaagaggttg caatttgaag 1740
ttcctgttgt ttcatagttt gttagcgttc caattaaggt gtttattcat tttttattta 1800
gggggcccgg gggggccctt tacgatcctt ttagcccttg accgttccgt agagttgatt 1860
ttgattgtga attggtttgt tatcatattg gaaaaaggga agatatgtaa aacgacctgc 1920
atagcaattt ttagaccatt gcaaaaggca aagagataaa gagcactcag attttttttt 1980
gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2033

Claims (5)

1.一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法，其特征在于，所述的狗牙根内源基因cDNA全长序列如序列表的序列2所示，编码区为序列表中序列2自5’末端第69-1757位核苷酸；
所述的方法包括以下步骤：
(1)狗牙根目的基因片段的克隆：提取狗牙根RNA，逆转录成cDNA，通过PCR扩增获得目的基因序列，测序确认PCR扩增结果正确性，所述克隆扩增的目的基因片段是狗牙根CdPDS基因编码区456-875核苷酸区段；所述的狗牙根目的基因片段的长度为420bp；
(2)病毒诱导基因沉默载体的构建：将狗牙根目的基因片段和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体进行酶切、连接、转化大肠杆菌，获得连入狗牙根目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体，挑取克隆、提取质粒、酶切验证克隆正确性；
(3)农杆菌浸染狗牙根植株：将连入狗牙根目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体转化农杆菌，将农杆菌扩大培养，使用浸染缓冲液重悬，真空辅助浸染狗牙根植株；
(4)基因表达丰度的分子检测：提取对照狗牙根植株和农杆菌浸染植株RNA，逆转录成cDNA，使用定量PCR检测目的基因的表达丰度变化，所述农杆菌浸染植株为真空辅助浸染后于28℃、16小时光照/8小时黑暗培养条件下继续培养21天的狗牙根植株，对照植株为28℃、16小时光照/8小时黑暗培养条件下生长28天的狗牙根植株。
2.权利要求1所述的方法，其步骤(2)所述水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体为pRTBV-MVIGS，酶切用限制性内切酶为MluI和PacI。
3.权利要求1所述的方法，其步骤(3)所述浸染缓冲液配方为10mM吗啉乙磺酸，10mM氯化镁，5mM氯化钙，300mM乙酰丁香酮，pH值为5.6。
4.权利要求1所述的方法，其步骤(3)所述真空辅助浸染狗牙根植株为28℃、16小时光照/8小时黑暗培养条件下生长7天的狗牙根幼苗。
5.权利要求1所述的方法，其步骤(3)所述真空辅助浸染狗牙根植株真空维持时间为5分钟。
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